用於選擇顯示減少的損傷誘導的表面變色的方法

2023-07-05 03:40:26 1

專利名稱：：用於選擇顯示減少的損傷誘導的表面變色的方法用於選擇顯示減少的損傷誘導的表面變色的方法發明領域本發明涉及用於針對其中存在的個體篩選植物或植物部分的群體的方法，所述個體與對照植物或植物部分相比，顯示減少的損傷誘導的表面變色。發明背景由於不斷增加的需要，新鮮產品例如萵苣、義大利紅生菜(radicchio)、苦苣和其他蔬菜的加工近年來獲得長足的發展。葉類蔬菜的收穫和加工包括葉子的大量切割，這誘導了強烈的損傷反應。該損傷反應導致加工的產品的快速變質。該變質表現在由於損傷表面上和周圍的酶促褐變或變粉紅引起的變色、呼吸和由於蒸騰作用引起的變幹。特別地，酶促褐變或變粉紅據認為是非常重要的，其直接或間接決定了鮮切包裝的葉類蔬菜如萵苣和義大利紅生菜的總體質量。此外，作為變質的結果，微生物的數量可顯著增加，這可以危害食品安全。加工的萵苣的高度易腐壞的性質導致消費者感覺到強烈的變色(off-colour)、異味(off-odour)和質地改變，這妨礙了比所謂的便利市場的流通增長更快速的增長。其他蔬菜如馬鈴薯、蘑菇、塊根芽菜、朝鮮薊和茄子，還有果實和花可經歷不希望的變色。例如，果實如香蕉、蘋果、梨子、鱷梨、芒果、桃子和杏子等，當切成薄片或剝皮時，很快變成褐色。當以加工的形式例如薄切片、切成的小方塊、去皮的形式或在果實沙拉中提供這些果實時，必須採取措施。切花花莖(Cutflowerstem)(例如來自大丁草或菊花)也可容易地變色，所述變色從商業的觀點來看是不希望的，因為消費者認為變色使花喪失了吸引力，從而減少了產品的可銷售性。為了抑制蔬菜例如萵苣中的變質過程，已發展了可用於減緩加工的萵苣的變質的許多化學或物理的收穫後處理方法。在這些方法當中包括在改變的大氣下包裝鮮切的葉類蔬菜、使用可食用的塗層、熱激處理和加入抑制酶促褐變的化學物質。當在低溫下在減少氧氣的大氣下包裝鮮切萵苣時，可顯著地減少酶促褐變。然而，這樣的改變的、低氧環境導致無氧呼吸，這產生了令人感覺非常討厭的產品的異味和臭味。可食用的塗層是用作物理隔離屏障和有效保護產品免受各種變質例如蒸發和褐變侵害的材料的薄層。這些塗層可以例如由樹脂、多糖或蛋白質製成。已進一步證明，可通過在加工後即刻在45。C下使用90秒的短暫熱激來防止鮮切萵苣的褐變。熱激很可能使蛋白質的生物合成從參與變色的酶轉向熱激蛋白，從而減少了酶促褐變的能力。可選擇地，可用參與變色通路的酶的熱敏感性(thermosensitivity)來解釋熱激處理對褐變的作用。可使用的化學物質可以是例如還原劑如維生素C、螯合劑如EDTA、絡合劑如環糊精和酶抑制劑如L半胱氨酸。化學物質在新鮮食品中的應用明顯地牽涉到食品安全性問題和需要法規批准(regulatoryapproval)。可以考慮上述收穫後技術的組合，最終，使用的方法是技術功效、成本和食品安全性之間的平衡結果。不論所使用何種技術，加工的蔬菜、果實和花的收穫後質量的提高來之不易，從而在本領域存在提供可選擇的技術來消除或減少對使用物理或化學收穫後技術的需要的明確需要。發明概述本發明的目的是提供篩選方法，所述方法用於選擇顯示減少的損傷誘導的變色反應的植物，從而提供對收穫後的加工障礙例如酶促褐變或變粉紅具有抗性的植物和從其產生的後代。也可在植物的部分例如莖、種子、果實、葉、花、塊莖、枝等中看到損傷引起的變色。因此本發明的進一步目的是提供選擇在它們的植物部分顯示減少的損傷誘導的變色反應的植物的篩選方法。物相比，顯示減少的變色)篩選植物或植物部分的群體的方法，所述方法包括a)提供植物群體或來自該群體的植物的部分；b)任選地在植物或植物部分上產生損傷表面；c)溫育植物或植物部分或在其上產生的損傷表面以允許在其內或其上發生變色；d)在植物或植物部分內或上觀察變色；e)將觀察到的變色與在對照植物或植物部分中觀察到的變色進行比較，從而鑑定顯示沒有變色的或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。本發明的方法具有兩個主要的實施方案。在第一實施方案中，變色是內源性底物轉化的結果。該變色將在一定的環境下溫育植物或植物部分一定量的時間後自發地產生。該情況下的變色是損傷誘導的。本發明特別地涉及天然發生的酶促變粉紅色和褐變反應。本發明的篩選方法意欲用於鑑定不顯示該反應或與對照相比顯示減少的反應的植物。在第二實施方案中，變色由外源加入的底物的轉化引起，當植物中的反應發生時，所述底物可被轉化成變成可見的有色底物。這樣的顏色反應可以是或可以不是損傷誘導的。其也發生在例如完整的種子的種皮中。本發明的篩選方法意欲用於鑑定不顯示該反應或顯示與對照相比減少的反應的植物。後一種施用方案更特別地涉及用於就針對其中存在的個體(所述個體與對照植物或植物部分相比，顯示減少的變色)篩選植物或植物部分的群體的方法，所述方法包括a)提供植物群體或來自該群體的植物的部分；b)將植物或植物部分與底物一起溫育，所述底物可轉化成有色色素從而允許在其內或其上發生變色；c)在植物或植物部分內或上觀察變色；d)將觀察到的變色與在對照植物或植物部分中觀察到的變色進行比較，從而鑑定顯示沒有變色或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。本發明的方法可用於可經歷變色的任何植物，但特別適合用於產品，特別是用於蔬菜或果實或用於花。該方法尤其適合於用於葉類蔬菜例如萵苣、義大利紅生菜或苦苣，適合用於塊莖，如馬鈴薯或甘薯(sweetpotato),適合用於根類植物，例如塊根芽菜(celeriac),適合用於枝條類(shoots)，例如witloof或適合用於蘑菇。此外方法可用於果實，例如蘋果、香蕉、聘梨、桃子、梨子、杏子、芒果、茄子和適合用於花類或花莖類(flowerstem)，例如大丁草莖、菊花、朝鮮薊基部等。本發明的篩選方法意欲用於鑑定在一個或多個它們的部分或組織中具有減少的損傷誘導的表面變色的植物。因此，為了進行篩選，使用易於變色的部分或組織是非常實用的。在萵苣中，這樣的部分或組織可以是葉或其部分例如葉的打孔部分，在香蕉中，可合適地使用去皮果實的切片，在花類植物中，莖的切片是非常實用的受試載體(testvehicle)。然而，已發現還可在未受損傷的組織上檢測變色。在實施例中，顯示了完整的種皮和根尖能夠在外源加入的底物存在的情況下誘導顏色反應，所述底物在未受傷的情況下可被轉化成有色色素。該顏色反應的減少或不存在可用於篩選具有減少的變色的植物。在特定的實施方案中，該方法特別適合用於選擇屬於菊科(JWeraceae)的植物，特別是萵苣屬(Lactuca)的植物和更特別地屬於萵苣(Zac&casa〃raJ種的植物或屬於菊苣屬(Cichorium)的植物，和特別地屬於菊苣(C/c力or/i/邁//7^r6";y,種和苦苣(67c力oW"範e"力V/d種的植物，所述植物顯示不存在或減少的損傷誘導的表面變色使用本發明的方法篩選的植物群體可以是任何植物群體，但優選是具有許多不同成員的變異植物群體，以增加發現顯示減少的損傷誘導的變色的植物的機會。可通過使用例如化學物質和/或輻射的誘變處理產生這樣的變異群體，所述變異群體在本文中被稱為突變體植物群體。可選擇的群體是種質集合體，所述集合體是顯示天然變異的植物的集合體。此外，還可使用轉基因植物的群體。適合地使用具有損傷表面的植物部分來進行本發明的方法。非常有用的受試樣品是通過對葉子穿孔產生的盤，即所謂的葉盤。可選擇地，可使用有葉脈的葉類蔬菜的中脈組織。合適地，從此類葉脈切取葉盤。在果實中，可評估分成二半的果實的切面或可選擇地薄切片或小方塊的切面。對於花，莖的切片是非常有用的受試樣品。合適地在水性環境中進行溫育。可用在溼潤的濾紙上或濾紙間溫育的葉盤很好地進行本發明的方法。然後在濾紙上可以非常清楚地看到圍繞損傷的邊緣的顏色反應。可選擇地，水性環境包括水或溶液。在將在下面進一步說明的特定的實施方案中，溶液包含底物，例如L-3,4-二羥基苯丙氨酸。該化合物通過多酚氧化酶轉化成黑色的色素黑色素的產物。可用於在該方面篩選萵苣植物的可選擇的化合物包括但不限於綠原酸、異綠原酸、L酪氨酸和兒茶酚。的葉變色)的後代進行本發明，從而證明後代仍然具有與在親本植物中發現的相同的不存在或減少的損傷誘導的葉變色。本發明還可在植物的部分上進行。植物部分如萵苣或苦苣的葉球或葉通常是具有切面(所述切面可經歷變色)的部分。其他部分是果實、枝、根、種子、塊莖、花、莖等。在本發明的其他實施方案中，種子或萌發的種子可用作在外源加發的種子的情況下，幼根尖參與顏色反應。就鑑定可用於加工的蔬菜的市場的突變體植物而言本發明在商業上具有極大的吸引力。如上面所解釋的，產品特別是新鮮果實和蔬菜的變色被認為是不想要的，因為消費者拒絕變色的產品發明詳述當通過切割收穫和加工萵苣時，產生許多葉損傷表面，所述葉損傷表面導致植物或植物部分的顯著反應，表現為損傷表面上或附近的褐色或粉紅色變色。還可在遠離葉的中脈以及柄上的損傷表面的位置上觀察到變粉紅色。有時還可在即將收穫前的階段觀察到變粉紅色，這據認為是由於農作物的非生物脅迫或過度成熟造成的。其他植物，特別是其他蔬菜、果實和花也易於變色。因此本發明他蔬菜或果實或花的非常方便的篩選方法。不同形式的變色受到酶活性的影響，所述酶活性由於損傷而獲得強烈的增強且產生了幾種形式的多酚和來源於其的反應產物。參與褐變反應的重要的酶活性是ppo。與酶促褐變相關的ppo活性不限定於萵苣，已描述了該ppo活性在許多其他植物物種中如蘋果、香蕉和馬鈴薯中與收穫後變質有關。事實上，pp0被公認為是與許多加工的新鮮果實和蔬菜的收穫後變質有關的最重要的酶之一。因此，pp0—直是目的在於減少或預防其活性以增加食品的收穫後質量的許多技術的耙標。ppo催化將存在於植物組織中的多酚氧化，從而形成鄰醌的反應。然後，酶促和非酶促反應導致褐色或黑色色素的形成。在許多植物種中，pp0由小的基因家族編碼，所述基因家族的個體成員可具有指示功能趨異的不同的時間和空間表達模式。例如已顯示，萵苣在葉的光合和維管組織中包含不同的pp0同種型(isoform)。pp0的天然底物在不同的物種之間可以不同。表1列出了經歷損傷後變色的不同蔬菜和果實的pp0底物。這些和其他底物可用於本發明的基於外源底物的篩選方法。表1tableseeoriginaldocumentpage11在許多植物中，pp0酶的水平並非是植物組織損傷後特異性誘導的，而是以無活性形式存在於葉綠體中。在損傷後，由於存在於液泡中的酚類底物因為組織的破裂而與ppo接觸的事實的原因，ppo的激活由此而表現出來。在萵苣中，作為pp0的底物的多酚的產生由損傷誘導。因此，萵苣組織的褐變潛能似乎不受葉組織中PP0的量的限制而是受損傷後多酚生物合成速度的限制。在該方面，不同的農作物之間情況可以不同。例如，在蘋果中，多酚的量足以在損傷後1小時內產生果實的褐變反應，然而在萵苣中，由於萵苣中多酚庫大部分需要在損傷後重新合成的事實，褐變反應可花費數天時間。通過詳盡表徵的稱為苯基丙酸類通路(phenylpropanoidpathway)的生物化學通路進行多酚類的合成。首先，該通路的關鍵步驟由苯丙氨酸解氨酶催化(PAL,Hahlbrock，K和Scheel，D(1989)A麵Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.40，347-369)。PAL將通過莽草酸酯通路合成的胺基酸苯丙氨酸轉化成肉桂酸(cinnamicacid)。在萵苣，葉子的損傷導致PAL基因表達和PAL活性的強誘導。多酚的形成與該酶活性相關，這表明由萵苣的損傷誘導的PAL活性是造成褐變的重要因素(Campos，R.等人(2004)PhysiologicaPlantarum121，429-438和其中的參考資料)。然而，目前還不清楚哪一個其他因素決定損傷誘導的變色反應的最終結果。例如，據認為過氧化物酶(POD)的活性在建立變色的最終水平中同樣重要(Fukumoto，L.R.等人(2002)J.Agric.FoodChem.540，4503-4511;Martin-DianaA.等人(2005)Biosci.Biotechnol.Biochem.69，1677-1685)。由於酶活性依賴於內部過氧化氫的可獲得性，因而POD對變色的貢獻可能是有限的。進一步顯然的是，植物以某種不為人知的方式感覺到損傷，隨後通過級聯反應產生信號，對於萵苣，該信號目前未被充分確定。似乎顯然的是，這些活性主要被靶向傷口癒合和抗病原體的防禦。因而，許多遺傳因子可能參與發動損傷的萵苣組織的變色反應，這些因子中的各因子是減少或消除損傷誘導的變色的遺傳修飾的潛在的靶標。這些遺傳因子的大部分目前是未知的，對於已知的涉及到的因子，不清楚這些因子在變色反應中所起的特定作用達到何種程度，或這些因子可能具有與植物的損傷生理學相關的更一般的功能。例如，儘管認為損傷誘導的PAL活性確定萵苣的褐變水平，但苯基丙酸類通路的產物已知參與尤其細胞壁的生物合成或還參與防禦反應。西此為了減少褐變潛能而減少損傷誘導的PAL活性，可削弱除了損傷誘導的褐變以外的與萵苣栽培的其他方面相關的其他功能，這可能是較不希望的。同樣地，PP0的活性據認為參與防禦反應，因此通過減少PPO水平來減少褐變潛能可增加對病原體的易感性(Thipyapong，P.等人(2004)Planta220，105-117)。因此，本發明者推論，更加無偏性的方法可在該方面獲得更大的成功。這樣的方法包括下列步驟1.植物的變異體群體，特別是突變體群體的產生。可通過用誘變劑如曱磺酸乙酯(ems)或X射線處理種子或植物組織來產生這樣的突變體群體。2.有效率的表型篩選的建立，在所述篩選中，選擇基於通過PAL和/或PPO介導的植物的變色，特別是損傷反應誘導的植物的變色。3.在它們的關於收穫後變色潛能的損傷反應發生改變的且不存在所述改變的多效性的突變體的表徵，根據一般實踐，所述多效性削弱植物的生長和加工。本發明因而涉及用於鑑定、選擇和獲得顯示減少的損傷誘導的變色和收穫後加工障礙例如酶促褐變或變粉紅色的植物的篩選方法。在篩選方法中，可在損傷表面觀察到變色，而且還發現完整的組織也顯示在加入底物後發生的顏色反應。例如可如下製備用於本發明的方法的突變體植物群體a)使用誘變劑處理待改變植物物種的M0種子以獲得Ml種子；b)栽培來自所獲得的Ml種子的植物以獲得Ml植物；c)任選地重複步驟b)和c)n次以獲得Ml+n種子，d)萌發所獲得的Ml+n種子，栽培來自這些種子的植物。根據本發明，隨後針對它們的損傷誘導的變色反應測定這些植物。選擇不顯示或顯示減少的對損傷的變色反應的植物。然後，栽培選擇的植物的後代，測量損傷誘導的變色反應。為了產生遺傳變異性，可使用誘變。可用於在植物物種中誘導遺如，可在包含不同濃度的誘變劑如ems的溶液中處理種子。Ems主要烷基化DNA鏈的G殘基，這在DNA複製過程中引起與T配對而非與C配對。從而GC鹼基配對以由有效劑量的ems和植物的錯配修復系統的活性確定的頻率改變成AT鹼基配對。ems的有效劑量取決於所使用的濃度、種子大小和其他物理性質以及種子在ems溶液中的溫育時間。已用誘變劑處理的種子通常稱為Ml種子。作為處理的結果，Ml種子的組織在它們的細胞的基因組中包含隨機點突變，那些存在於將形成種系組織(生殖細胞)的細胞的亞群中的點突變將被傳遞至稱為M2的下一代。單倍不足(haplo-insufficient)從而引起不育或誘導胚胎致死現象的突變或其組合將不被傳遞至M2代。如上述使用ems的相似方法同樣可用於其他誘變劑。合適的誘變劑在本領域內是熟知的。特別有用的是烷基化誘變劑，例如硫酸二乙酯(des)、乙烯亞胺(ei)、丙磺酸內酯、N-曱基-N-亞硝基尿烷(nitrosourethane)(mnu)、N-亞硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亞硝基脲(enu)、疊氮化納。可選擇地，通過輻射誘導突變，所述輻射選自例如X射線、快中子、紫外線照射。在本發明的另一個實施方案中，通過基因工程例如通過使用嵌合寡核苷酸、同源重組、基因打靶、與內源產物竟爭的經修飾的靶基因的導入、通過RNA幹擾進行的下調等來誘導突變。可將誘變處理的M2群體用於針對通過PAL和PPO介導的損傷反應的篩選方法。對於本領域技術人員來說顯然的是攜帶遺傳變異的任何植物群體可用作該表型篩選的起始材料，所述植物群體是例如作為顯示天然變異的植物的集合體的種質集合體或轉基因植物的群體。合適地通過自體授粉產生Ml和Ml+n種子。為了進行本發明的表型篩選，必須產生損傷表面，因為酶促變色反應是在損傷後誘導的。這樣的損傷是通過方法如切割、穿孔、切片、磨損、擠壓、破壞、剝皮、壓碎、壓迫、鞭打、碾磨、液體注射、滲透壓休克、分離(detaching)、割和撕裂獲得的。發現，在其中PPO在底物可到達的範圍內的情況下，例如當PP0分泌或位於細胞外部時，還可在完整的組織和植物部分例如種子上實施使用外源加入的底物的本發明的方法。從而誘導顏色反應的酶也可在無預先損傷的情況下獲得。在損傷後或當不需要損傷時，用於診斷導致組織變色的通路和可非常有效地用於突變體群體的篩選的表型特徵必須逐漸表現出來。令人吃驚地發現，可通過採集植物的部分，然後在非常特殊的條件(所述條件有利於不同形式的變色，特別地損傷表面變色發生)下溫育它們來獲得這樣的表型特徵。然後，這樣的測定可用於大量的植物或植物部分例如突變植物，以選擇顯示減少的損傷誘導的變色反應的植物。本發明的一個實施方案基於令人吃驚的發現，即當採集來自葉子例如萵苣葉子或苦苣或witloof的葉子的葉盤並且在5。C下在溼潤的濾紙之間溫育時，在大約4天後，葉盤邊緣的粉紅色染料的形成逐漸變得明顯。合適的濾紙是1450CV型濾紙，Ref.no.10313281，來自Schleier&Schuell，MicroscienceGmbH,Dassel，Germany。在進一步溫育後，信號增強，在大約一周後達到最大強度。粉紅色染料的形成特異性地在損傷表面發生。可通過在視覺標度(visualscale)上進行從0(其表示無褐變或變粉紅色)至10(其表示與待篩選的植物的標準品種(例如用於篩選萵苣的萵苣(L.sativa)相似的褐變和變粉紅)的評分來測量變色。在本實例中，萵苣品種'Troubadour'用作10的標準。如果希望，可使用圖進行比較，從而給0和10之間的中間級別評分。此外，可由具有粉紅色或褐色染料的濾紙產生數字圖像，然後計算每葉盤位置具有強粉紅色或褐色的像素的數目。通過使用這些測量中的一種，可進行本領域技術人員熟知的筒單統計分析如t檢驗，從而確定植物或植物群體變粉紅色或褐變的程度是否比標準顯著更低。單側檢驗的所使用的顯著性水平是0.001。對於突變體，可在作為最佳的可獲得的標準的原始品種的粉紅色為了在代表不同變異樣品的現有植物中發現本發明的性狀，可使用繁殖系(breedingline)和/或基因庫登錄號(genebankaccession)。然後可在處於研究中的個體登錄號與群體的其餘部分的變粉紅色的評分之間進行統計比較。當針對顯著減少的變粉紅色對個體進行統計檢測時，可能需要多重比較檢驗來保持適當的總體顯著性水平，例如使用一個標準的Dunnett氏多重比較檢驗(DunnettCW，J.Amer.Statist.Assoc.50:1096-1121(1955))。此外，據顯示可通過使用不同發育階段的葉子的許多不同類型的組織獲得該反應。例如，還可誘導中脈組織產生該對損傷的反應。當用於不同種類的萵苣，例如葉用萵苣(butterhead)、巻心萵苣(iceberg)、直立萵苣(cos)、荷蘭萵苣(batavia)或棟葉萵苣(oakleaf)時，未發現顯示比被研究的群體的剩餘部分顯著更少的變粉紅色的個體登錄號。因此得出，在栽培的萵苣種類中，不存在或只存在非常有限的損傷誘導的粉紅色變色的遺傳變異。根據本發明，進一步證明PPO的特異性抑制劑L半胱氨酸，當在反應過程中使用時，強烈地抑制粉紅色染料的形成。此外，發現肉桂醛(其為PAL活性和鮮切萵苣的褐變的抑制劑)抑制粉紅色染料的形成(Fujita，N.等人(2006)BiosciBiotechnol.Biochera.70，672-676)。這些發現顯示萵苣的粉紅色變色反應是PAL和PPO依賴性的。已知通過使用短暫的熱激可非常有效地防止鮮切萵苣的酶促褐變。可通過假定將蛋白質的生物合成從苯基丙酸類通路改向熱激蛋白，從而減少朝向多酚形成的代謝流來解釋觀察到的效應。可選擇地，可通過假定參與多酚氧化的酶例如PPO和POD通過熱激處理而失活來解釋效應。當對隨後針對變粉紅色反應而進行測定的萵苣使用熱激時，顯示該反應如酶促褐變被有效抑制。這證明了作為本發明的部分的萵苣的變粉紅色反應在生理上與熟知的酶促褐變反應非常相似。通過將L半胱氨酸用作還原劑來進一步驗證該發現。L半胱氨酸，除了是PP0的抑制劑外，還已知與有色的鄰醌(0-quinone)反應並且在化學還原反應中將它們轉化回無色的二酚。當用L半胱氨酸處理由萵苣葉盤形成的粉紅色染料時，證明粉紅色化合物被轉化成無色化合物。因此粉紅色染料似乎可能是由PPO形成的鄰醌。這由發現還原劑如抗壞血酸或穀胱甘肽也可將粉紅色染料轉化成無色化合物來確證。此外，當用L半胱氨酸處理採自田間的、顯示變粉紅色的植物時，也可消除粉紅色變色。這證明葉盤變粉紅色反應代表了有時可在處于田間條件下生長的植物中看到的天然發生的變粉紅色現象。本發明的其他實施方案基於下列實驗。通過切割產生葉球的萵苣葉的部分，將所述部分在16。C下在空氣中進行溫育。作為反應，在大約4天後，損傷表面變成褐色。特別地在主脈的損傷表面上，可清楚地觀察到褐變。此外，還可在通過切割或磨損損壞葉子後在整個植物水平上觀察到褐變反應。L半胱氨酸(PPO的抑制劑)可完全抑制所有這些褐變反應，這證明了這些表型是通過PPO的活性表現的，從而可被當作如在萵苣的加工和包裝過程中觀察到的收穫後褐變的診斷。這些損傷誘導的褐變反應能夠以有效的方式產生，所述方式可在用於鑑定損傷誘導的褐變潛能減少的突變體植物的表型篩選方法中使用。本發明的其他實施方案基於萵苣組織的損傷表面上的變色，或基於在完整萵苣組織例如萵苣種皮內、上或附近觀察到的、通過使用底物誘導的顏色反應，所述底物可被酚氧化酶轉化成有色化合物。例如，當將萵苣葉盤與PPO底物L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)一起溫育時，在損傷表面上觀察到深褐色向黑色的變色，該變色是黑素形成(通過PPO)的表現。當同時使用L半胱氨酸，黑色變色被完全抑制，這確認了該變色是PPO介導的假設。儘管L-DOPA被認為不是萵苣PP0的天然底物，但其可用於目的在於鑑定顯示減少的損傷誘導的變色的突變體的測定。可以以與對於L-D0PA所描述的方式相似的方式，使用其他底物以產生變色反應。這些底物包括但不限於綠原酸、異綠原酸、L酪氨酸和兒茶酚。綜合起來，植物中產生的損傷表面上不同染料的形成監控始於損傷信號的誘導、通過PAL和PPO介導且導致變色的通路的變化。如所描述的，可容易地通過目檢(所述目檢允許進行非常有效的突變體篩選方法)來評估這些損傷誘導的變色反應。在圖1中圖解說明了本發明描述的方法的背後的原理。因此根據本發明，發現在體外，葉盤的損傷誘導的變色通路與以工業規模進行加工的萵苣的損傷誘導的變色具有很大的重疊，從而可被當作該過程的診斷特徵。這由這樣的概念支持，即PAL或PPO的抑制劑抑制在實際的工業條件下加工的和包裝的萵苣的酶促褐變。重要地，由於該方法包括誘導步驟(即損傷和由PPO介導的一個最終的代謝轉換)，因而該方法允許捕獲直接或間接參與該生理過程的所有遺傳因子。此外，由於可通過使用不同發育階段的葉子的整個葉組織產生該反應，因此當考慮相關性時，可將突變體篩選靶向這些不同的階段或組織。可進一步表徵突變體植物，基於一個或多個上述表型測定，已鑑定所述突變植物在從損傷到向PAL和PP0依賴性變色的生理過程方面發生了改變。可在不同的水平例如在分子、生物化學、生理學和表型水平上進行該表徵。對於本領域技術人員很顯然的是，可觀察到變色的可變水平，所因座或相同基因座的不同等位基因型的存在,在隱性突變的情況下，可通過進行等位性檢驗容易地區分這兩種可能性，所述檢驗包括將兩種突變植物雜交和確定雜種的表型。在突變的等位性的情況下，減少的變色性狀在F1中將是明顯的，然而在突變體的表型由不同隱性基因座確定的情況下，情況則不是這樣。當在本發明的一個實施方案中將隨機誘變用於產生起始群體時，遺傳背景中的突變也可在實驗條件下促成表型的變異。為了區分不同強度的單突變和遺傳背景中的突變的組合效應，應當針對不同的減少的變色事件進行回交以產生均一的遺傳背景。為了確定參與損傷誘導的變色的特定基因座上的突變是否展示多效性，該方法也是適當的。因此基於減少的變色反應所選擇的M2植物用於生長M3種子。然後，針對它們減少的對損傷的反應重新評估來源於減少的變色事件的近交系。此外，可在不同的遺傳背景中和在不同的農作物栽培和加工條件下評估減少的褐變或變粉紅色。本發明的篩選方法可用於所有這些評估。可進行生物化學研究以闡明涉及受遺傳修飾影響的通路的問題。因如編碼PAL、PPO或過氧化物酶的基因是否被修飾。進一步地進行遺傳分析以證明候選基因中發現的修飾是形成改變的表型的原因。選方法，但對於本領域技術人員來說已知的是，存在允許以特定的方式修飾存在於植物的基因組中的基因靶的技術。例如，已證明嵌合寡核苷酸是具有特定作用模式的有效誘變劑。另一個方法是通過同源重組或基因打靶修飾基因靶。通過使用該方法，用導入的包含希望的修飾的DNA片段交換基因的片段。轉基因方法也是可行的，在所述方法中導入與內源產物竟爭的被修飾的靶基因。這可導致顯性負效應。此外，通過RNA千擾特異性下調基因的表達是可行的。在誘變的寡核苷酸的情況下，基因打靶或轉基因方法用於修飾參與損傷誘導的變色反應的遺傳因子，很明顯，相關基因的一級結構應當是已知的。當針對變粉紅色測定從種子(所述種子是通過自體授精獲得的)生長的特定突變體的後代植物時，觀察到與對於原始鑑定的突變體所發現的減少相似的減少。這證明減少的粉紅色變色反應能夠遺傳並且可通過基因組的修飾引起。進一上令人吃驚的發現是如下事實，即當將經鑑定顯示減少的損織的酶促褐變進行檢測時，該反應也被強烈抑制。這顯示葉盤變粉紅色的測定因果性地涉及萵苣中的酶促褐變，以及顯示變粉紅色的測定可用於預測成熟萵苣植物的酶促褐變的水平。因此，可將葉盤變粉紅色的測定用作鑑定具有減少的酶促褐變潛能的萵苣植物的選擇工具。該工具可用於從任何類型的植物群體(無論遺傳變異的原因是什麼)鑑定存在於該群體中的具有減少的酶促褐變潛能的萵苣植物。例如，除了ems群體外，可使用天然獲得的材料或繁殖種群。該篩選方法還可用於篩選顯示損傷誘導的變色的其他植物。本發明提供的一種或多種篩選方法可例如用於其收穫後加工質量需要提高的任何植物物種。除了栽培的萵苣外，本發明還可用於例如屬於菊科的其他植物物種，例如萵苣屬的野生型種或屬於菊苣屬(所述屬是種如苦苣(Cichoriumendivia)、菊苣和witloof菊苣(Cichoriumintybus)屬於的屬)的植物。此外，可用本發明的方法篩選其他農作物植物例如蘋果、義大利紅生菜(radicchio)、馬鈴薯、甘薯、塊根芽菜、蘑菇、香蕉、鱷梨、桃子、梨、杏子、芒果、茄子和花或花莖(flowerstems)例如大丁草莖、菊花、朝鮮薊基部等。本發明涉及用於通過進行本文中公開的一種篩選方法來檢測植物中的表型特徵的方法。通過3個變色試驗(即變粉紅色或褐變的發生或將底物如L-DOPA轉化成黑色素的能力)中的一個或多個檢測確定特徵的存在。本文中所使用的"對照"是已知其顯示變粉紅色、褐變和L-D0PA至黑色素的轉化中的一種或多種變色反應的任何植物，所述反應可被L半胱氨酸或肉桂醛抑制。合適地，使用植物，所述植物的葉盤或其他植物部分，當在5'C下在溼潤的濾紙之間溫育7天時，顯示圍繞所述盤或部分的邊緣的粉紅色變色。將在下列的且不意欲以任何方式限定本發明的實施例中進一步舉例說明本發明。所述實施例涉及萵苣葉盤和種子、菊苣屬和茄子，但可使用其他植物或其部分特別是新鮮果實和蔬菜而不使用萵苣。在實施例中參考下列附圖。圖1:針對減少的收穫後酶促變色而進行的萵苣群體的突變體篩選方法的設計背後的原理的概述。篩選的輸入信號是被植物感覺且產生導致許多生理過程(包括衰老、呼吸和組織變色)的不同信號傳輸反應的葉組織的損傷。該輸入信號可與作為PPO底物的酚類化合物應用相結合。篩選的輸出信號是診斷收穫後褐變和變粉紅色的損傷表面的褐色或粉紅色變色(所述變色取決於所使用的條件)。這可從輸出信號被肉桂醛和L半胱氨酸(其分別為PAL和PPO的特異性抑制劑)完全抑制的事實推斷出來。圖2:基於葉盤的粉紅色變色的篩選的輸出表型的代表性圖像。將萵苣植物的葉盤(每植物1個葉盤)排列在溼潤的濾紙之間並且在5。C下溫育7天。可在損傷表面清楚地觀察到圍繞各葉盤的粉紅色變色。圖3:在不同濃度的PAL抑制劑肉桂醛存在的情況下進行的葉盤變粉紅色測定(每培養皿4個葉盤)。各培養皿上方的數字顯示所使用的肉桂醛的百分比。圖4:PP0抑制劑L半胱氨酸對溼潤的濾紙之間溫育的萵苣葉盤(每培養皿4個葉盤)的粉紅色變色的抑制效應。各培養皿上方的數字顯示所使用的L半胱氨酸的百分比。圖5:PP0抑制劑L半胱氨酸在1.5mML-D0PA存在的情況下對溼潤的濾紙之間溫育的萵苣葉盤(每培養皿4個葉盤)的黑色變色的抑制效應。各培養皿上方的數目顯示所使用的L半胱氨酸的mM濃度。圖6:熱激預處理對萵苣葉盤變粉紅色的效應。在各培養皿上指定的溫度下對完整的葉子施用熱激，進行90秒。圖7:通過L半胱氨酸使通過萵苣的損傷反應形成的粉紅色染料至無色化合物的轉化。培養皿的上行顯示L-DOPA測定，而培養皿的下行顯示變粉紅色的測定。在完成損傷反應後，用L半胱氨酸處理各培養皿中的兩個葉盤中的下方葉盤。所使用的L半胱氨酸的濃度是上面指定的0、0.001、0.01、0.1、l和lOmM。圖8:通過L半胱氨酸產生的田間栽培的萵苣中變粉紅色的減少。上方的圖才匡(upperpanel)顯示採自淨皮7_1<^旻(waterlogging)極端脅迫的植物的萵苣葉子的常見的變粉紅色症狀。主脈顯示粉紅色染料的存在。下方右圖框顯示採自在室溫下用1mML半胱氨酸處理30分鐘後，顯示變粉紅色症狀的葉子的葉盤。下方左圖框顯示在室溫下用水處理30分鐘後的相似的葉盤。圖9:圖框A:根據本發明描述的方法針對葉盤變色對個體萵苣M2植物(按庫分組的)進行的表型分析。12000個樣品中總共有138個樣品在該圖框中展示，其中箭頭所指的樣品顯示急劇減少的變粉紅色變色。圖框B:確認了與顯示清楚的變色反應的對照樣品相比，粉紅色變色的形成幾乎不存在(中間位置中的樣品)的圖框A中指出的選擇的個體的再檢測。圖10:M2萵苣植物的表型。通過使用根據本發明的測定法，標記有l、2、4、5、7、10和12的植物顯示減少的粉紅色葉盤變色。植物3、6、8、9和11是顯示與野生型對照相當的粉紅色葉盤變色的水平的植物。植物1是顯示粉紅色變色的急劇減少和正常生長習性的突變體的唯一例子。植物2、4、5、7、10和12顯示減少的粉紅色變色和矮小、變白的表型。圖ll:顯示減少的變色的萵苣的突變體的後代檢測。在左邊，顯示25個顯示正常的損傷誘導的變色反應的樣品。在右邊，顯示採自一系列來源於單個突變體的35個後代植物的樣品組，所述突變體顯著地減少了其損傷誘導的變色反應。圖12.基於採自成熟萵苣植物的葉子中脈部分的褐色變色的篩選的輸出表型的代表性圖像。圖像顯示在16。C下溫育3天後萵苣邊葉中脈的組織盤。可在損傷表面清楚地觀察到常見的褐色變色。各培養皿包含3個在中脈的不同位置(綠色、淡綠色和白色)採集的葉盤。培養皿上方的數字表示向濾器中加入的L半胱氨酸的mM濃度。圖13:萵苣葉表面的L-DOPA至黑色素的轉化。圖框A顯示1.5mML-DOPA溶液中的測定。上管是陰性對照，其他3個管相同。圖框B顯示包含1.5mML-D0PA的溼潤濾紙之間的葉盤的溫育的結果。圖14:在中脈褐變上顯示減少的損傷誘導的粉紅色變色的萵苣突變體的後代檢測。圖框A顯示減少的變粉紅的突變體的編號為l至8的8林後代植物的中脈葉盤(每植物3個葉盤)。圖框B顯示編號為9至16的顯示正常褐變反應的8抹對照植物的中脈葉盤(每植物3個葉盤)。圖15:在環境大氣下切割和包裝後，顯示減少的損傷誘導的粉紅色變色或褐變反應的萵苣的突變體的評估。對照植物的葉球的葉碎片示於左邊，減少的變色的突變體的葉碎片示於右邊。將鮮切葉材料在4。C下貯存6天。可在對照樣品中清楚地觀察到褐色變色，然而突變體樣品保持不變。圖16:苦苣(cichoriumendivia)(左圖框)和菊苣(Cichoriumintybus)(右圖框)中變粉紅色測定。圖17:萵苣葉盤上的綠原酸測定。圖18:切開的茄子中的褐變反應。圖19:萵苣(上行)和茄子(下行)的種子上的L-DOPA測定。圖20:萵苣的萌發的種子上的L-D0PA測定。圖21:萵苣的萌發的種子上的兒茶酚測定。實施例實施例1使用ems進行的萵苣的遺傳修飾將萵苣品種Troubadour、Apache、Yorvik和Roderick的大約2000粒種子在室溫下在24小時期間於0.05%(w/v)或0.07%(w/v)的ems的充氣溶液中進行溫育。在ems處理後，用水漂洗M1種子，然後在20。C下在16小時光照、8小時黑暗的方案下種植在溫室中，讓其長成成熟的植物，誘導抽苔和開花以產生M2種子。在成熟後，收穫M2種子，將聚集成堆和貯藏以待進一步使用。基於具有白化的表型的個體植物(所述植物的葉綠素生物合成被擾亂)的相對數目估計突變頻率。實施例2基於粉紅色色素形成診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選的發展發展其中可容易地評估由損傷誘導的萵苣的葉變色的表型測定法。該方法允許針對變色進行幼小植物的篩選。從幼小或成熟的植物採集直徑5mm的葉盤並且將其置於培養皿中的溼潤的濾紙之間。將系統在5。C下溫育7天。在溫育過程中，變得如在濾紙上列印的圓一樣清楚可見的粉紅色染料在葉盤的損傷位置產生(圖2)。為了證明粉紅色染料的產生需要活性苯基丙酸類通路，在該測定中檢測PAL(肉桂醛，圖3)和PP0(L半胱氨酸，圖4)的抑制劑的效應。當在測定過程中使用肉桂醛時，粉紅色變色在0.01%或更高的濃度被完全抑制。使用0.001%和更高的濃度的L半胱氨酸獲得相似的結果，然而其他胺基酸如L亮氨酸或L丙氨酸不顯示任何效果。這證明L半胱氨酸可抑制萵苣葉盤的變粉紅色反應並且L半胱氨酸的抑制作用是特異性的。為了證明L半胱氨酸在該系統中確實用作PPO活性的抑制劑，將萵苣葉盤與PP0底物L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)—起溫育。儘管認為L-D0PA不是萵苣PP0的天然底物，但在損傷表面觀察到暗褐色至黑色的變色，所述變色是通過PPO形成黑色素的表現。當同時使用1mM或更高濃度的L半胱氨酸時，如圖5中所示，變色被完全抑制。通過在誘導損傷反應前使用熱激來進一步表徵萵苣葉盤變粉紅色的反應。在21、40、50和60。C的溫度下在90秒的期間溫育分離的葉。在該處理後，採集葉盤，針對變粉紅色對其進行測定。當在50'C或更高的溫度下進行熱激時，變粉紅色反應被完全抑制。該結果顯示於圖6中。由於已知L半胱氨酸通過將它們轉化回無色的二酚而與作為PPO產物的鄰醌反應，因此確定L半光氨酸對來自萵苣葉盤的粉紅色染料的影響。平行地，在與L-DOPA溫育後，確定L半胱氨酸對黑色素形成的影響。根據上述方法採集和溫育葉盤。在完成損傷反應後，向葉盤加入一系列濃度的L半胱氨酸，監測顏色的變化。結果示於圖7中。該實驗清楚地證明L半胱氨酸將粉紅色染料轉化回無色化合物，然而L-DOPA測定中形成的黑色的黑色素不受L半胱氨酸影響。這證明粉紅色染料很可能是由萵苣多酚氧化系統形成的鄰醌。為了證明體外觀察到的反應反映生理上相關的反應，將基於L半胱氨酸的變色用于田間生長的植物材料。這可通過從田間栽培的萵苣植物收穫沿著葉脈顯示強烈的變粉紅色症狀的葉子來進行。當例如通過嚴重水浸的條件脅迫植物時，通常觀察到該現象。葉子用於製備葉盤，所述葉盤立即用1mML半胱氨酸進行溫育。在室溫下進行在大約30分鐘的溫育後，如圖8中所示，粉紅色變色消失。綜合起來，這些實驗數據顯示，可通過損傷誘導萵苣葉盤以產生PAL和PPO依賴性的粉紅色變色。該表型允許用於萵苣突變體的有效率的和有效的篩選方法，所述萵苣突變體具有改變的、通過PAL、PPO或兩者介導的損傷反應誘導的變色。實施例3篩選具有減少的損傷誘導的變色的突變體為了鑑定具有低損傷誘導的酶促褐變或變粉紅色潛能的萵苣突變體，將實施例2中描述的葉盤測定法用於萵苣突變體群體的植物。在溫室中栽培12000株植物(位置DeLier，3月28日播種；4月18日種植；在常規的萵苣的生長條件下進行生長)，從各個體植物採集葉盤(從5月15日開始釆樣)，將葉盤作為(平均)25個樣品的庫在5。C下在溼潤的濾紙之間溫育7天。依賴於粉紅色變色的強度給每一個葉盤進行視覺評分。基於該評估，選擇其葉盤顯示沒有或顯示具有相對低程度的損傷表面變色的植物。將具有幾乎看不到的痕量變色的植物編號為06D.210202。在12000株植物中，最終選擇l林只顯示痕量的、幾乎看不見的變色的植物和11林顯示相對低變色水平的植物。這些測定中的一個測定的結果示於圖9。對最初選擇的12個個體重複變色測定，對於大多數個體情況，確認了最初的結果。只選擇確認的個體進行進一步的分析和種子生產。實施例4篩選具有減少的損傷誘導的變色的突變體為了鑑定具有低損傷誘導的酶促褐變潛能的萵苣突變體，將實施例2中描述的葉盤測定法用於萵苣突變體群體的植物。將8500林植物栽培在溫室中直至3周齡(6-8葉期)，然後從各個體植物採集葉盤，將所述葉盤在5。C下於溼潤的濾紙之間溫育7天。依賴於粉紅色變色的強度給予各葉盤視覺評分。基於該評估，選擇其葉盤顯示沒有或顯示相對低程度的損傷表面變色的植物。在8500林植物中，選擇8林不顯示任何可見變色的植物和10林顯示相對低的變色的植物。對18個最初選擇的個體重複變色測定，對於大多數個體情況，確認了最初的結果。U個個體示於圖10中。只選擇確認的個體用於進行進一步的分析和種子生產。給l林不具有多效副作用(例如，變白、變矮)的突變植物賦予編號05D.202539。通過該植物的自交產生的種子被編號為05D.810596。通過3林從05D.810596的種子生長而來的植物的自交產生的種子編號為07G.9979並且保藏在NCIMB。NCIMB號是41441(於2006年10月10日4呆藏)。實施例5選擇的顯示減少的損傷誘導的變色的突變體的表型分析在選自實施例3中提供的篩選的12個突變體中，6個顯示急劇減少的生長表型和變白。其他突變體發育正常，即與誘變實驗的起始群體的類型一致。變矮和變白的突變體的葉綠體功能可能被擾亂。由於PP0存在於這些細胞器中，這可以解釋葉盤測定中相對低的反應。由於該多效突變是不希望的，因此這些突變體被認為是不太適切的。顯示最強的葉盤變色的減少的突變植物06D.210202顯示了正常表型，因此突變被認為是對於變色是特異性的，不具有強多效性效應。實施例6後代中幾乎不存在變色表型的確認為了證明萵苣突變體如來自實施例3和5的植物06D.210202的通過自交產生種子。通過植物06D.210202的自交產生的種子編號為06D.819784。將種子在土壤中萌發，使用葉盤變粉紅色測定法針對變色檢測植物。該實驗清楚地顯示改變的表型具有遺傳基礎，因為所有後代植物都顯示相似的表型，即粉紅色變色的急劇減少，與用於產生種子的突變體相似。在圖11中舉例說明了該結果。通過3林從06D.819784的種子生長的植物的自交產生的種子編號為06D.863B2,然後在NCIMB保藏。NCIMB號為4H54(於20(H年1月3日保藏)。實施例7基於褐色色素形成診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選的發展將萵苣栽培至成熟，通過從葉脈組織切取葉盤來釆集邊葉的部分。將葉盤在16。C下於溼潤的濾紙上進行溫育。在大約72小時後，損傷表面轉變成褐色。在10mML半胱氨酸存在的情況下，褐變反應被抑制，這表明觀察到的變色是PPO介導的。這樣的實驗的代表性結果顯示於圖12中。由於如圖12中展示的反應是PP0介導的褐變反應，因此為了篩選顯示減少的在萵苣的加工過程中發生的褐色變色的突變體，如本實施例中描述的篩選方法可以認為是有效的和無偏性的。實施例8基於L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-D0PA)轉化回稱為黑色素的黑色色素診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選的發展除了在廣義上闡明損傷誘導的變色的測定外，根據本發明的方法也允許以更特異性的方式篩選具有減少的PPO活性的突變體。通過使用在1.5mML-DOPA存在的情況下溫育的葉盤來發展顯示PPO活性的表型測定法。由於黑色變色變得明顯，從而可推斷出，可通過多酚氧化系統在萵苣葉的損傷表面容易地將L-DOPA轉化成稱為黑色素的黑色色素。通過PPO將L-DOPA轉化成反應性L-DOPA-醌，該L-DOPA-醌通過多巴色素和吲咮醌非酶促地轉化成黑色的黑色素。此外，顯示可通過在反應期間加入1mML半胱氨酸來抑制反應(圖5)。因此，該分析使得能夠鑑定突變體，所述突變體在葉的損傷表面產生PPO活性的能力被改變。如圖13中所顯示的，可在溶液和溼潤的濾紙之間觀察到萵苣葉盤對L-DOPA的存在的反應。實施例9寸吏用葉樂K葉盤褐變測定法(ribdiscbrowningassay)針對減少的褐變反應評估顯示幾乎不存在變色的突變體的後代為了證明萵苣突變體(如來自實施例3、5和6的、葉盤的損傷表面的粉紅色變色顯著減少的植物編號06D.210202)的減少的變色也在損傷誘導的褐變反應中有效地減少，將許多後代植物栽培至成熟。在該發育階段，從許多後代植物的邊葉釆集3個中脈葉盤。根據實施例7中描述的方法溫育這些脈葉盤。結果顯示，較早顯示為急劇減少的損傷誘導的粉紅色變色的突變體的後代植物也強烈地減少損傷誘導的中脈褐變。該實驗的結果示於圖14中。實施例10使用包裝在塑膠袋中的鮮切萵苣葉球針對減少的褐變反應評估顯示幾乎不存在變色的突變體的後代使用刀將萵苣植物的成熟葉球切成碎片，然後包裝在包含環境大氣的塑膠袋中，所述萵苣植物是從來自實施例6的種子編號06D.819784生長而來的、葉盤的損傷表面的粉紅色變色顯著減少的萵苣植物。以相同的方式處理顯示正常葉盤粉紅色變色反應的對照植物。將袋子在4'C下保存6天後，針對其褐變反應評估葉材料。該實驗顯示，更早顯示為損傷誘導的粉紅色變色的急劇減少的突變體的後代植物，當使用環境大氣進行加工和貯藏在塑膠袋中時，損傷誘導的中脈褐變也急劇減少。該實驗的結果示於圖15。實施例11菊苣中的變粉紅色為了鑑定有低的損傷誘導的酶促變粉紅色潛能的突變體，將實施例2中描述的葉盤測定法用於突變的菊苣群體的植物。結果顯示於圖16中。結果得出，菊苣中也存在變粉紅色反應。因此本發明的篩選方法是選擇顯示減少的損傷誘導的變色的菊苣植物的強有力工具。迄今，只能通過觀察成熟的植物來評估苦苣和witloof中的褐變反應。可在幼小植物材料上進行實踐的本發明的方法是非常有效率的和快速的。實施例12茄子中的變色將茄子切成兩半，在室溫下溫育過夜。從圖18得出，變色反應主要是由種子引起的。因此，種子是用於基於底物(例如使用L-DOPA)的變色測定的合適的候選物。實施例13基於綠原酸的轉化診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選在濾紙上將萵苣的葉盤與10mM綠原酸一起溫育。圖17顯示葉盤的褐變。在加入L半胱氨酸後，顏色消失再次顯示變色是依賴於PP0的。該實施例證明綠原酸是用於基於底物的篩選測定的合適的底物。實施例14診斷種子的損傷誘導的變色的基於底物的表型篩選用0、2.5和5mML-D0PA溫育萵苣和茄子的種子。圖19顯示在種子中觀察到的顏色反應是濃度依賴性的。該反應是PP0依賴性的，因為其可用L半胱氨酸抑制。將萵苣的萌發的種子與L-D0PA—起溫育。圖20顯示種皮和正好在根尖後的根區(rootzone)顯示顏色反應。該顏色反應可用於篩選顯示減少的變色的種子。將萵苣種子與0、100、250、500、750和1000mg/L兒茶酚一起溫育。圖21顯示種子顯示濃度依賴性顏色反應。該反應是PPO依賴性的，因為發現其被L半胱氨酸抑制。權利要求1.一種方法，所述方法用於針對其中存在的與對照植物或植物部分相比顯示減少的變色的個體而篩選植物或植物部分的群體，所述方法包括a)提供植物的群體或來自該群體的植物的部分；b)任選地在植物或植物部分上產生損傷表面；c)溫育植物或植物部分或在其上產生的損傷表面以允許在其內或其上發生變色；d)在植物或植物部分內或上觀察變色；e)將觀察到變色與在對照植物或植物部分中觀察到的變色進行比較，從而鑑定顯示沒有變色的或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。2.權利要求l中所述的方法，其中變色是損傷誘導的變色。3.權利要求1或2中所述的方法，其中植物是蔬菜植物、結果的植物或開花植物。4.權利要求3中所述的方法，其中植物是選自萵苣、苦苣、witloof、馬鈴薯、甘薯、塊根芽菜、蘑菇、朝鮮薊和茄子的蔬菜植物。5.權利要求3中所述的方法，其中植物是選自蘋果、香蕉、鱷梨、桃子、梨子、杏子和芒果的結果的植物。6.權利要求3中所述的方法，其中植物是選自大丁草和菊花的開花才直物。7.權利要求l-4任一項中所述的方法，其中植物屬於菊科，特別地屬於萵苣屬，更特別地屬於萵苣種。8.權利要求l-4任一項中所述的方法，其中所述植物屬於菊苣屬,和特別地屬於菊苣(Cichoriumintybus)和苦苣種。9.權利要求1、2或3中所述的方法，其中植物部分選自葉、葉球、枝、根、塊莖、莖、花、果實、種子、萌發的種子或其碎片和細胞。10.權利要求7或8中所述的方法，其中植物部分是葉盤。11.權利要求7或8中所述的方法，其中植物部分是來自中脈組織的葉盤。12.權利要求1-11任一項中所述的方法，其中植物群體是突變體植物的群體、種質集合體或轉基因植物的群體。13.權利要求12中所述的方法，其中通過使用化學物質和/或輻射進行誘變處理獲得突變體植物的群體。14.權利要求l-13任一項中所述的方法，其中在水性環境中進行溫育。15.權利要求14中所述的方法，其中水性環境包括溼潤的濾紙。16.權利要求14中所述的方法，其中水性環境包括水或溶液。17.權利要求15或16中所述的方法，其中水性環境包含選自L-3，4-二羥基苯丙氨酸、綠原酸、異綠原酸、L酪氨酸和兒茶酚的化合物。18.權利要求15或16中所述的方法，其中水性環境包含選自表1中所列的化合物的化合物。19.權利要求l-18任一項中所述的方法，其中對照植物是當其葉盤在5。C下在兩片溼潤的濾紙之間溫育7天時，顯示圍繞邊緣的粉紅色變色的植物。20.—種方法，所述方法用於針對其中存在的與對照植物或植物部分相比顯示減少的變色的個體而篩選植物或植物部分的群體，所述方法包括a)提供植物的群體或來自該群體的植物的部分；b)將植物或植物部分與底物一起溫育，所述底物可轉化成有色色素從而允許在其內或其上發生變色；c)在植物或植物部分內或上觀察變色；d)將觀察到的變色與在對照植物或植物部分中觀察到的變色進行比較，從而鑑定顯示沒有變色或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。21.權利要求20中所述的方法，其中底物選自表l中所列的化合物。22.權利要求21中所述的方法，其中化合物是L-DOPA。23.權利要求20、21或22中所述的方法，其中在用底物溫育之前損傷植物或植物部分，然後觀察損傷或損傷附近的變色。24.《權利要求20-23任一項中所述的方法，其中植物部分是種子、萌發的種子或葉盤。25.權利要求1_24任一項中所述的方法，其中變色可被L半胱氨酸抑制或逆轉。全文摘要本發明涉及用於針對其中存在的個體篩選植物或植物部分的群體的方法，所述個體與對照植物或植物部分相比，顯示減少的變色，所述方法包括提供植物群體或來自該群體的植物的部分；任選地在待篩選的植物或植物部分上產生損傷表面；溫育植物或植物部分或在其上產生的損傷表面，以允許在其內或其上發生變色；在植物或植物部分內或上觀察變色；將觀察到的變色與在對照植物或植物部分內觀察到的變色進行比較，從而鑑定顯示沒有變色或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。合適地變色是損傷誘導的變色。文檔編號A01H1/04GK101400253SQ200780006285公開日2009年4月1日申請日期2007年1月8日優先權日2006年1月6日發明者C·M·P·范杜恩申請人:瑞克斯旺種苗集團公司