抗凝血劑解毒劑的製作方法

2023-07-04 23:37:51

抗凝血劑解毒劑的製作方法【專利摘要】本發明涉及針對抗凝血劑、特別是針對達比加群的抗體分子，以及所述抗體分子作為此類抗凝血劑的解毒劑的用途。【專利說明】抗凝血劑解毒劑【
技術領域：
】[0001]本發明涉及醫藥領域，尤其是抗凝血療法的領域。現有技術[0002]抗凝血劑為預防血液凝固的物質；即，抗凝血劑可以使血液停止凝固。抗凝血劑廣泛用作治療人血栓性疾病的藥物，例如在易感者中預防原發性及繼發性深靜脈血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞及中風。[0003]一類重要的口服抗凝血劑通過拮抗維生素K的作用而起作用，例如包括華法林在內的香豆素類。第二類化合物通過輔因子間接抑制凝血，例如抗凝血酶III或肝素輔因子II。此包括數種低分子量的肝素產物，其通過抗凝血酶III主要催化抑制Xa因子(以及針對凝血酶的程度較小)(貝米肝素(bemiparin)、舍託肝素(certoparin)、達替肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕月幹素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin),小鏈寡糖(磺達肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))通過抗凝血酶III僅抑制Xa因子。類肝素(達那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮膚素(dermatansulfate))通過兩種輔因子起作用，且抑制Xa因子及凝血酶兩者。第三類則為凝血的直接抑制劑。直接Xa因子抑制劑包括阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban),且直接凝血酶抑制劑包括二價水蛭素(比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(Iepirudin)Ji西盧定(desirudin))以及單價化合物阿加曲班(argatroban)及達比加群(dabigatran)。[0004]由於血液凝固為停止出血的生物機制，因此抗凝血療法的副作用是可能發生不期望的出血事件。因此需要提供一種能夠阻止所述抗凝血劑相關的出血事件發生的解毒劑(antidote)(Zikria及Ansell，CurrentOpinioninHematology2009,16(5):347-356)。一種實現此目標的方法為在給藥抗凝血劑後中和患者體內所存在的抗凝血劑化合物活性。[0005]目前可使用的抗凝血劑解毒劑為魚精蛋白(用於中和肝素)及維生素K(用於中和類似華法林的維生素K拮抗劑)。對於罹患嚴重創傷及嚴重出血且接受低分子量肝素治療的患者而言，新鮮冷凍血漿及重組因子VIIa也可作為非特異性解毒劑使用(LauritzenB.等人，Blood，2005，607A-608A)。也有報導指出魚精蛋白片段(美國專利第6，624，141號)及小合成肽(美國專利第6，200,955號)作為肝素或低分子量肝素解毒劑；且凝血酶突變蛋白(美國專利第6，060,300號)可用作凝血酶抑制劑的解毒劑。已有報導指出凝血酶原中間體及衍生物可用作水蛭素及合成凝血酶抑制劑解毒劑(美國專利第5，817，309號及第6，086，871號)。對於Xa因子直接抑制劑而言，已有報導指出失活Xa因子類似物可用作解毒劑(W02009042962)。此外，重組VIIa因子已經用於逆轉抗凝血酶III依賴性Xa因子之間接抑制劑(例如磺達肝素及艾卓肝素)的效應(BijsterveldNR等人，Circulation,2002,106:2550-2554；BijsterveldNR等人，BritishJ.0fHaematology,2004(124):653-658)。有關抗凝血劑逆轉的方法的綜述提供於Schulman及Bijsterveld,TransfusionMedicineReviews2007:21⑴，37-48中。[0006]國際專利申請案W02011089183公開可結合及中和達比加群活性的抗體。[0007]對於抗凝血療法提供改良的解毒劑存在需求，且具體地，為針對類似達比加群的直接凝血酶抑制劑提供解毒劑，該特異性解毒劑至今尚無人公開。[0008]發明概述[0009]在一個方面中，本發明涉及一種能夠中和抗凝血劑的活性的抗體分子。[0010]在另一方面中，該抗體分子針對抗凝血劑具有結合特異性。[0011]在另一方面中，該抗凝血劑為一種直接凝血酶抑制劑、Xa因子抑制劑或維生素K拮抗劑。[0012]在另一方面中，該抗凝血劑為達比加群(dabigatran)、阿加曲班(argatroban)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)、水蛭素(hirudin)、比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(Iepirudin)、地西盧定(desirudin)、阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、去纖維蛋白多核苷酸(defibrotide)、雷馬曲班(ramatroban)、抗凝血酶III或Drotrecoginα。[0013]在另一方面中，本發明涉及一種針對達比加群、達比加群酯(dabigatranexetilate)及/或達比加群的0_醯基葡糖苷酸的抗體分子。[0014]在另一方面中，本發明涉及一種針對達比加群、達比加群酯和/或達比加群的O-醯基葡糖苷酸的抗體分子，其對於人而言具有降低的免疫原性。[0015]在另一方面中，本發明涉及一種針對達比加群、達比加群酯和/或達比加群的O-醯基葡糖苷酸的抗體分子，其具有改良的理化性質，尤其是在水性溶劑中具有改良的溶解度。[0016]在另一方面中，本發明涉及一種針對達比加群、達比加群酯和/或達比加群的O-醯基葡糖苷酸的抗體分子，其在宿主細胞中具有改良的生產能力，尤其是造成改良的產物收率。[0017]在另一方面中，該抗體分子為多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體的片段，尤其為Fab、Fab』或F(ab』)2片段、單鏈抗體，尤其為單鏈可變片段(scFv)、域抗體、納米抗體、雙價抗體(diabody)或DARPin。[0018]在另一方面中，本發明涉及一種如上所述的抗體分子，其用於醫藥中。[0019]在另一方面中，本發明涉及一種如上所述的抗體分子，其用於治療或預防抗凝血療法所產生的副作用。[0020]在另一方面中，該副作用為出血事件。[0021]在另一方面中，本發明涉及一種治療或預防抗凝血療法所產生的副作用的方法，該方法包括將有效量的如上所述抗體分子給藥至有此需要的患者。[0022]在另一方面中，本發明涉及包含所述抗體分子以及容器和標籤的試劑盒。【專利附圖】【附圖說明】[0023]圖1:利用凝血酶凝血時間測試，觀察到凝血時間會隨著達比加群濃度增加而增長。200nM的濃度會造成凝血時間比基線增加約5倍，且該濃度用於第一組及第二組實驗中。最後一組實驗中採用500nM的濃度(超治療濃度)。[0024]圖2:四種針對達比加群的不同抗體(A至D)均可使人血漿中達比加群所延長的凝血時間中和。人血漿中的基線凝血時間為10.9秒，當使200nM達比加群與血漿預先培養時，凝血時間延長至51秒。將各抗體添加至經200nM達比加群預先培養的血漿中，並再培養5分鐘。隨後，通過添加凝血酶，開始凝血酶凝血時間。各抗體會以不同程度逆轉達比加群的凝血時間。濃度最高的溶液會造成抗凝血活性的最大逆轉。[0025]圖3:將濃度遞增的多克隆抗體(抗體D)添加至已與200nM達比加群預先培養的人血漿中，測量其作用。基線凝血時間為11秒，添加達比加群延長凝血時間至63.7秒。隨後，測定遞增濃度的抗體對逆轉達比加群所延長凝血酶凝血時間的作用。最低濃度將凝血酶凝血時間降低至43.9秒。較高的濃度將凝血酶凝血時間完全降至基線水平，並造成達比加群的抗凝血作用的完全中和。添加非特異性兔多克隆抗體(方塊)對逆轉達比加群的抗凝血作用無影響。[0026]圖4:將濃度遞增的多克隆抗體(抗體D)添加至已與500nM達比加群預先培養的人血漿中，測量其影響。基線凝血時間為10.9秒，添加該較高濃度達比加群時，延長凝血時間至111.7秒(增加約10倍)。抗體的1:2稀釋液或原液逆轉達比加群所延長凝血酶凝血時間的效應與濃度具有相關性。最高濃度也會使凝血酶凝血時間完全逆轉至基線水平，且甚至使超治療濃度的達比加群的抗凝血作用完全中和。[0027]圖5:小鼠單克隆抗體(克隆22)逆轉人血漿及人全血中達比加群的抗凝血作用。將濃度遞增的小鼠單克隆抗體添加至已與30nM達比加群預先培養的人血漿或全血中。通過添加1.5至2U/ml的凝血酶開始該測試，並測量凝血時間。將存在及不存在該化合物下的凝血時間差異定義為100%達比加群活性。該抗體以劑量依賴性方式抑制達比加群-介導的凝血時間延長。[0028]圖6:自克隆22抗體產生的小鼠Fab逆轉人血漿中達比加群的抗凝血作用。將濃度遞增的小鼠Fab添加至已與7nM達比加群預先培養的人血漿中。也測試完整抗體，作為陽性對照組。通過添加0.4U/ml的凝血酶開始該測試，並測量凝血時間。將達比加群介導的凝血時間增加的完全阻斷定義為100%抑制。該Fab以劑量依賴性方式抑制人血漿中達比加群所誘發的凝血時間延長。[0029]圖7:小鼠單克隆抗體(克隆22)逆轉人血漿中的達比加群醯基葡糖苷酸的抗凝血作用。將濃度遞增的小鼠抗體添加至已與7nM達比加群醯基葡糖苷酸或達比加群預先培養的人血漿中。通過添加0.4U/ml的凝血酶開始該測試，並測量凝血時間。將該化合物介導的凝血時間增加的完全阻斷定義為100%抑制。該抗體以劑量依賴性方式抑制人血漿中達比加群醯基葡糖苷酸所誘發的凝血時間延長。[0030]圖8:所選嵌合抗體在凝血酶凝血時間測試中抑制達比加群活性。添加遞增濃度的抗體至已與7nM達比加群一起預培育的人類血漿中。完整抗體亦作為陽性對照進行測試。由添加0.4U/mL凝血酶開始分析並且測量凝血時間。將達比加群介導的凝血時間增加完全阻斷定義為100%抑制。抗體以劑量依賴性方式抑制人類血漿中由達比加群誘發的凝血時間延長。[0031]圖9:FabVH5c/Vkl8(SEQIDNO:99及SEQIDNO:100)及VH5c/Vk21(SEQIDN0:99及SEQIDNO:101)在凝血酶凝血時間血漿分析中抑制達比加群活性。如上所述進行分析。[0032]圖10:FabVH5c/Vkl8(SEQIDN0:99及SEQIDNO:100)及VH5c/Vk21(SEQIDN0:99及SEQIDNO:101)在血漿和全血凝血酶凝血時間測試中抑制達比加群活性。如上所述進行分析。[0033]圖11:Fab-達比加群複合物的晶體結構。A:Fabl8/15(W02011089183)與達比加群的複合物的晶體結構。B:FabVH5c/Vkl8(SEQIDN0:99及SEQIDNO:100)與達比加群的複合物的晶體結構。C:在含有Fabl8/15的晶體結構中所見的達比加群的構型。D:在具有VH5c/Vkl8的晶體結構中所見的達比加群的伸長構型。[0034]圖12:所計算的包含CDR(左側)或完整Fv區(右側)的(A)Fabl8/15、(B)FabVH5c/Vkl8及(C)FabVH5c/Vkl8的空間聚集趨勢(SAP)。[0035]圖13:用相應Fab表達構建體轉染的CHO細胞在分批補料運行之下得到(A)Fab18/15(B)FabVH5c/Vkl8和(C)FabVH5c/Vk21的效價。[0036]發明詳述[0037]在一個方面中，本發明涉及一種能夠中和抗凝血劑的活性的抗體分子。[0038]抗體(也稱為免疫球蛋白，縮寫為Ig)為發現於脊椎動物血液或其他體液的Y球蛋白，且可通過免疫系統用以識別及中和外來物體，例如細菌及病毒。所述抗體通常為由各具有兩個大重鏈及兩個小輕鏈的基本結構單元所組成，以形成(例如)具有I個單元的單體、具有2個單元的二聚體或具有5個單元的五聚體。抗體可通過非共價鍵相互作用而結合至稱為抗原的其他分子或結構。此結合是特異性的，也就是抗體會以高親和力方式僅結合至特定結構。被抗體所識別的抗原的獨特部分稱為抗原表位或抗原決定基。結合至該抗原表位的抗體部分有時稱為互補位，其位於該抗體的所謂的可變域或可變區(Fv)中。該可變域包括三個被骨架區(FR)隔開的所謂的互補決定區(CDR)。[0039]在本發明上下文中，所提及的⑶R是根據Chothia的定義(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.1987，196:901-917)以及Kabat(E.A.Kabat,Τ.T.Wu、H.Bilofsky、Μ.Reid-Miller及H.Perry,SequenceofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,Bethesda(1983))。[0040]本領域已經進一步開發出抗體，且使所述抗體成為醫學及技術中具有多功能的工具。因此，在本發明上下文中，術語「抗體分子」或「抗體」(本文作為同義詞使用)並不只包括自然界中所發現的抗體(該抗體包括例如兩條輕鏈及兩條重鏈，或僅包括兩條重鏈(如在駱駝物種中))，也包括所有包含至少一個具有抗原結合特異性的互補位及具有與免疫球蛋白可變域類似結構的分子。[0041]因此，本發明的抗體分子可為多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體的片段，尤其為Fv、Fab、Fab』或F(ab』)2片段、單鏈抗體，尤其為單鏈可變片段(scFv)、小模塊免疫藥物(SMIP)、域抗體、納米抗體、雙價抗體。[0042]多克隆抗體是指具有不同胺基酸序列的抗體分子的集合，且可通過本領域公知的方法，從接受抗原免疫的脊椎動物的血液中獲得。[0043]單克隆抗體(mAb或moAb)為胺基酸序列相同的單一特異性抗體，單克隆抗體可通過雜交瘤技術,從被稱為雜交瘤的雜交細胞株製備產生的，該稱為雜交瘤的雜交細胞是指可產生特異性抗體的B細胞與骨髓瘤(B細胞癌)細胞融合的克隆(KohlerG、MilsteinC，Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature1975；256:495-7)。或者，單克隆抗體可通過在宿主細胞中的重組表達法製備(NorderhaugL、OlafsenT、MichaelsenTE、Sandlie1.(1997年5月)，「Versatilevectorsfortransientandstableexpressionofrecombinantantibodymoleculesinmammaliancells」，JTmmunolMethods204(I):77-87;參見下文)。[0044]對人的應用而言，往往需要降低源自其他物種(如小鼠)的抗體的免疫原性。這可通過構建嵌合抗體，或通過稱為「人源化」的方法來實現。在本文中，「嵌合抗體」應理解成將包含衍生自一種物種(例如小鼠)的序列部分(例如可變域)融合至衍生自不同物種(例如人)的序列部分(例如恆定域)的抗體。「人源化抗體」為一種包括源自非人物種可變域的抗體，其中某些胺基酸發生突變，使該可變域整體序列更類似接近於人可變域的序列。抗體的嵌合化及人源化的方法也是本領域公知的(BillettaR、LobuglioAF,「Chimericantibodies」.IntRevTmmunol.1993;10(2-3):165-76；RiechmannL、ClarkM、WaldmannH>WinterG(1988),「Reshapinghumanantibodiesfortherapy」，Nature:332:323)。[0045]此外，已經開發基於衍生自人基因組序列的產生抗體的技術，例如通過噬菌體展不技術或使用轉基因動物(W090/05144；D.Marks、H.R.Hoogenboom、Τ.P.Bonnert>J.McCafferty>A.D.Griffiths及G.Winter(1991),「By-passingimmunisation.HumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage.^J.Mo1.Biol.，222，581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296:57-86,2000；S.Carmen及L.Jermutus,「Conceptsinantibodyphagedisplay，，，BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics20021(2):189-203;LonbergN、HuszarD,「Humanantibodiesfromtransgenicmice，，，IntRevImmunol.1995;13(I):65-93;BriiggemannM、TaussigMJ,「Productionofhumanantibodyrepertoiresintransgenicmice，，，CurrOpin810七6吐1101.1997年8月，8(4):455-8)。所述抗體為本發明上下文中的「人抗體」。[0046]本發明的抗體分子也包括保持抗原結合特性的免疫球蛋白片段，如Fab、Fab』或F(ab』)2片段。通過免疫球蛋白的斷裂(例如通過蛋白消化)或通過重組表達所述片段可獲得所述片段。例如通過常規技術，例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶(W094/29348)或內切蛋白酶Lys-C(Kleemann等人，Anal.Chem.80,2001-2009,2008)可實現免疫球蛋白消化作用。以木瓜蛋白酶或Lys-C消化抗體通常會產生兩個相同的稱為Fab片段的抗原結合片段(每一片段具有單一的抗原結合位點)及殘留的Fe片段。經胃蛋白酶處理則會產生F(ab』)2。通過宿主細胞中重組表達製備Fab分子的方法詳細說明於下文中。[0047]已開發出多種技術以將免疫球蛋白可變域或衍生自所述可變域的分子置於不同的分子背景內。根據本發明，這些也應視為「抗體分子」。一般而言，這些抗體分子在尺寸上小於免疫球蛋白，且包括單一胺基酸鏈或由數條胺基酸鏈組成。例如單鏈可變片段(scFv)為免疫球蛋白重鏈及輕鏈的可變區的融合體，利用短接頭(通常為絲氨酸(S)及甘氨酸(G))連在一起(W088/01649;W091/17271;Huston等人，InternationalReviewsofImmunology,第10卷，1993，195-217)。「單域抗體」或「納米抗體」在單一的Ig樣域中具有抗原結合位點(W094/04678；W003/050531；ffard等人，Nature.1989年10月12日；341(6242):544-6;Revets等人，ExpertOpinBiolTher.5(1):111-24,2005)。可將一或多個具有針對相同或不同抗原的結合特異性單域抗體連在一起。雙價抗體為由兩條胺基酸鏈組成的二價抗體分子，其包含兩個可變域(W094/13804;HolIiger等人，ProcNatlAcadSciUSA.1993年7月15日；90(14):6444-8)。抗體樣分子的其他實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF;Srinivasan及Roeske,CurrentProteinPept.Sc1.2005,6(2):185-96)。有一種不同概念產生所謂的小模塊免疫藥物(SMIP)，其包括連接至單鏈鉸鏈的Fv域及缺乏恆定域CHl的效應子結構域(W002/056910)。[0048]在另一方面中，本發明的抗體分子甚至可能與免疫球蛋白可變域僅具有遠距結構相關性，或根本沒有所述相關性，只要其具有相當於免疫球蛋白可變域的特定的結合特異性及親和力即可。所述非免疫球蛋白「抗體模擬物」(有時稱為「支架蛋白」)可能基於A蛋白、載脂蛋白、纖維結合蛋白域、錨蛋白通用序列重複域及硫氧還蛋白的基因(Skerra，CurrentOpinioninBiotechnology2007,18(4):295-304)。本發明上下文中的優選實施方案為經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin’s;Steiner等人，JMolBiol.2008年8月24日；382(5):1211-27；StumppMT、AmstutzP,CurrOpinDrugDiscovDevel.2007年3月；10(2):153-9)。[0049]可將抗體分子融合(成為融合蛋白)或另外連接(通過共價鍵或非共價鍵)至對該抗體分子的特性具有所需影響的其他分子實體。例如可能需要改善抗體分子的藥代動力學性質、例如體液(如血液)中的穩定性，特別是在單鏈抗體或域抗體的情況下。已在此方面開發諸多技術，尤其為延長所述抗體分子在循環中的半衰期，如聚乙二醇化(W098/25971；W098/48837；W02004081026);將抗體分子融合或共價連接至對血清蛋白(如白蛋白)具有親和力的另一抗體分子(W02004041865；W02004003019);或使抗體分子表達為具有全部或部分血清蛋白(如白蛋白或轉鐵蛋白)的融合蛋白(W001/79258)。[0050]在另一方面中，所述抗體分子對抗凝血劑具有結合特異性。「結合特異性」指抗體分子對該抗凝血劑的結合親和力顯著高於對結構上無關的分子的結合親和力。[0051]親和力為抗體分子上的單一抗原結合位點與單一抗原表位之間的相互作用。其以締合常數KA=kass/kdiss或解尚常數KD=kdiss/kass表不。[0052]在本發明的一方面中，如通過表面等離子共振分析法(MalmqvistM.,「SurfacePlasmonresonancefordetectionandmeasurementofantibody-antigenaffinityandkinetics.」，CurrOpinImmunol.1993Apr;5(2):282-6)所測定，該抗體與抗凝血劑的結合親和性的KD值範圍為0.1pM至100μM，優選為IpM至100μΜ，優選為IpM至IμΜ。也可使用動態排除分析(KinExA)技術，測量抗體親和性(Dariing,R.J.及BraultP-A.,「Kineticexclusionassaytechnology-CharacterizationofMolecularInteractions.」，ASSAYandDrugDevelopmentTechnologies.2004年12月，2(6):647-657)。[0053]可通過稱為親和性成熟的方法來增強抗體分子的結合親和性(Marks等人，1992，Biotechnology10:779-783;Barbas,等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813；Shier等人，1995，Genel69:147-155)。因此，本發明也包括親和性成熟的抗體。[0054]在本發明另一方面中，該抗體分子能夠中和抗凝血劑的活性。即，在與該抗體分子結合之後，該抗凝血劑即無法發揮其抗凝血活性，或此活性程度已顯著下降。優選地，當針對所討論的抗凝血劑採用適當的活性分析，特別是採用對凝血酶敏感的凝血分析，如蛇靜脈酶(ecarin)凝血時間或凝血酶凝血時間測定時(H.Bounameaux、MarbetGA、LammleB,等人，「Monitoringofheparintreatment.Comparisonofthrombintime,activtedpartialthromboplastintime,andplasmaheparinconcentration,andanalysisofthebehaviourofantithrombinIII，，，AmericanJournalofClinicalPathologyl98074(l):68-72)，抗體結合後的抗凝血活性會下降至少2倍、5倍、10倍或100倍。[0055]為了製備本發明的抗體分子，本領域技術人員可自多種本領域公知的方法中選擇(Norderhaug等人，JTmmunolMethodsl997,204(1):77-87；Kipriyanow及LeGall,MolecularBiotechnology26:39-60,2004；Shukla等人，2007，J.ChromatographyB,848(1):28-39)。[0056]抗凝血劑為本領域公知的，如上文所述。在本發明另一方面中，該抗凝血劑為直接凝血酶抑制劑、Xa因子抑制劑或維生素K拮抗劑。維生素K拮抗劑的實施例為包括華法林在內的香豆素類。Xa因子的間接主要抑制劑的實例為通過抗凝血酶III的活化產生作用的肝素類物質，其包括數種低分子量的肝素產物(貝米肝素(bemiparin)、舍託肝素(certoparin)、達替肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin))、某些寡糖(磺達肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))、類肝素(達那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮膚素(dermatansulfate)),及直接Xa因子抑制劑(阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban))。凝血酶抑制劑的實施例包括二價水蛭素(比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(Iepirudin)、地西盧定(desirudin))、及單價化合物阿加曲班(argatroban)及達比加群(dabigatran)。[0057]因此，在另一方面中，該抗凝血劑為達比加群、阿加曲班、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐盧定、來匹盧定、地西盧定、阿哌沙班、伊度沙班、奧米沙班、利伐沙班、去纖維蛋白多核苷酸、雷馬曲班、抗凝血酶III或Drotrecoginα。[0058]本發明上下文中優選的抗凝血劑為達比加群(CAS211914-51-1，N-[2-(4-甲脒基苯基氨基甲基)-1-甲基-1H-苯並咪唑-5-基羰基]-N-(2-吡啶基)-β-丙氨酸)，其具有化學式(II):[0059]【權利要求】1.一種針對達比加群的抗體分子，其包含具有選自SEQIDN0:l、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61及67的CDR1、選自SEQIDNO:2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62及68的CDR2及選自SEQIDNO:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57及63的CDR3的重鏈可變域，以及具有選自SEQIDN0:4、10、16、22、28、34、40、46、52、58及64的CDR1、選自SEQIDN0:5、ll、17、23、29、35、41、47、53、59及65的CDR2及選自SEQIDNO:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66及69的CDR3的輕鏈可變域。2.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:1的CDR1、SEQIDNO:2的CDR2及SEQIDNO:3的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:4的CDR1、SEQIDNO:5的CDR2及SEQIDNO:6的CDR3的輕鏈可變域。3.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:7的CDR1、SEQIDNO:8的CDR2及SEQIDNO:9的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:10的CDRl、SEQIDNO:11的CDR2及SEQIDNO:12的CDR3的輕鏈可變域。4.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:13的CDR1、SEQID勵:14的0?2及SEQIDNO:15的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:16的CDRl、SEQIDNO:17的CDR2及SEQIDNO:18的CDR3的輕鏈可變域。5.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:19的CDR1、SEQIDN0:20的CDR2及SEQIDNO:21的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:22的CDRl、SEQIDNO:23的CDR2及SEQIDNO:24的CDR3的輕鏈可變域。6.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:25的CDR1、SEQIDNO:26的CDR2及SEQIDNO:27的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:28的CDRl、SEQIDNO:29的CDR2及SEQIDNO:30的CDR3的輕鏈可變域。7.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:31的CDR1、SEQIDNO:32的CDR2及SEQIDNO:33的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:34的CDRl、SEQIDNO:35的CDR2及SEQIDNO:36的CDR3的輕鏈可變域。8.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:37的CDR1、SEQIDNO:38的CDR2及SEQIDNO:39的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:40的CDRl、SEQIDNO:41的CDR2及SEQIDNO:42的CDR3的輕鏈可變域。9.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:43的CDR1、SEQIDN0:44的CDR2及SEQIDNO:45的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:46的CDRl、SEQIDNO:47的CDR2及SEQIDNO:48的CDR3的輕鏈可變域。10.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:49的CDR1、SEQIDNO:50的⑶R2及SEQIDNO:51的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:52的CDRl、SEQIDNO:53的CDR2及SEQIDNO:54的CDR3的輕鏈可變域。11.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:55的CDR1、SEQIDNO:56的CDR2及SEQIDNO:57的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:58的CDRl、SEQIDNO:59的CDR2及SEQIDNO:60的CDR3的輕鏈可變域。12.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:61的CDR1、SEQIDNO:62的CDR2及SEQIDNO:63的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:64的CDRl、SEQIDNO:65的CDR2及SEQIDNO:66的CDR3的輕鏈可變域。13.如權利要求1的抗體分子，其包含具有SEQIDNO:67的CDRl、SEQIDNO:68的CDR2及SEQIDNO:9的CDR3的重鏈可變域，以及具有SEQIDNO:64的CDRl、SEQIDNO:65的CDR2及SEQIDNO:69的CDR3的輕鏈可變域。14.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:70的重鏈可變域及SEQIDNO:71的輕鏈可變域。15.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:72的重鏈可變域及SEQIDNO:73的輕鏈可變域。16.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:74的重鏈可變域及SEQIDNO:75的輕鏈可變域。17.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:76的重鏈可變域及SEQIDNO:77的輕鏈可變域。18.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:78的重鏈可變域及SEQIDNO:79的輕鏈可變域。19.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:80的重鏈可變域及SEQIDNO:81的輕鏈可變域。20.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:82的重鏈可變域及SEQIDNO:83的輕鏈可變域。21.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:84的重鏈可變域及SEQIDNO:85的輕鏈可變域。22.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:86的重鏈可變域及SEQIDNO:87的輕鏈可變域。23.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:88的重鏈可變域及SEQIDNO:89的輕鏈可變域。24.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:90的重鏈可變域及SEQIDNO:91的輕鏈可變域。25.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:92的重鏈可變域及SEQIDNO:93的輕鏈可變域。26.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:92的重鏈可變域及SEQIDN0:94的輕鏈可變域。27.如權利要求1至26中任一項的抗體分子，其中該輕鏈可變域融合於SEQIDNO:97的恆定域。28.如權利要求1至25中任一項的抗體分子，其中該重鏈可變域融合於SEQIDNO:98的恆定域。29.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:95的重鏈及SEQIDNO:96的輕鏈。30.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:99的重鏈及SEQIDNO:100的輕鏈。31.如權利要求1的抗體分子，其包含SEQIDNO:99的重鏈及SEQIDNO:101的輕鏈。32.如前述任一項權利要求的抗體分子，其為多克隆抗體；單克隆抗體；人抗體；人源化抗體；嵌合抗體；抗體的片段，特別是Fab、Fab』或F(ab』)2片段；單鏈抗體，特別是單鏈可變片段(scFv);小模塊免疫藥物(SMIP);域抗體；納米抗體；雙價抗體；或經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)。33.如前述任一項權利要求的抗體分子，其用於醫藥中。34.如前述任一項權利要求的抗體分子，其用於治療或預防抗凝血療法的副作用及/或用於逆轉抗凝血劑的過度給藥。35.如權利要求34的抗體分子，其中該副作用為出血事件。36.一種治療或預防抗凝血療法的副作用或抗凝血療法中的過度給藥事件的方法，其包括向有此需要的患者給予有效量的前述任一項權利要求的抗體分子。37.一種製備如前述任一項權利要求的抗體分子的方法，其包括(a).提供宿主細胞，其包含一或多個編碼與表達調控序列功能相關的抗體分子的核酸，(b).培養該宿主細胞,及(c).自該細胞培養物回收該抗體分子。38.試劑盒，其包含如權利要求1至32中任一項的抗體或其藥物組合物。39.試劑盒，其包含:(a)如權利要求1至32中任一項的抗體或其藥物組合物；(b)容器；及(C)標籤。40.試劑盒，其包含如權利要求1至32中任一項的抗體，以及達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽。41.一種在正在用達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽治療的患者中中和或部分中和達比加群或達比加群的1-ο-醯基葡糖苷酸的方法，其包括給予權利要求1-32中任一項的抗體或其藥物組合物。42.一種在患者中中和或部分中和達比加群或達比加群的1-0-醯基葡糖苷酸的方法，該方法包括以下步驟:(a)確認患者正在接受達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽治療，且確認該患者服用的量；(b)在進行凝固或凝血試驗或分析之前，用權利要求1至32中任一項的抗體中和達比加群或1-ο-醯基葡糖苷酸，其中達比加群或達比加群的1-0-醯基葡糖苷酸會干擾該試驗結果或分析結果的精確讀數；(c)使用來自患者的樣品進行該凝固或凝血試驗或分析，以確定達比加群或達比加群的1-ο-醯基葡糖苷酸不存在的情況下血塊形成的水平；和(d)調節達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽給藥患者的量，以在患者中達到血塊形成和分解之間的適當平衡。43.在正在用達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽治療的患者中降低達比加群或達比加群的1-ο-醯基葡糖苷酸的血漿濃度的方法，其包括給予逆轉劑的步驟，該逆轉劑中和患者中達比加群或1-ο-醯基葡糖苷酸的活性。44.一種在正在用達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽治療的患者中逆轉達比加群或達比加群的1-ο-醯基葡糖苷酸的抗凝血作用的方法，其中該患者有被認為威脅生命的或導致血流動力學損傷的大出血，或其中該患者需要緊急醫療程序，該方法包括給予逆轉劑的步驟，該逆轉劑可中和患者中達比加群或1-0-醯基葡糖苷酸的活性。45.一種在由於凝血功能損傷或創傷而正在經受出血或有出血危險的患者中逆轉或降低達比加群或達比加群的1-ο-醯基葡糖苷酸的活性的方法，其包括以下步驟:(a)測定患者中達比加群或達比加群的1-0-醯基葡糖苷酸存在的量；(b)給予有效量的藥物以逆轉或降低該患者中測定的達比加群或達比加群的1-ο-醯基葡糖苷酸的活性；(c)監測該患者的凝血酶凝固時間以確保達到達比加群或達比加群的1-0-醯基葡糖苷酸的活性的逆轉或降低。46.權利要求43至45任一項的方法，其中所述逆轉劑為針對達比加群的抗體分子。47.中和達比加群或達比加群的1-0-醯基葡糖苷酸活性的逆轉劑，其用於正在用達比加群、達比加群酯、達比加群的前藥或其藥學上可接受的鹽治療的患者中，其中該患者有被認為威脅生命的或導致血流動力學損傷的大出血，或其中該患者需要緊急醫療程序。48.權利要求47的逆轉劑，其為針對達比加群的抗體分子。【文檔編號】A61P39/02GK103476459SQ201280015713【公開日】2013年12月25日申請日期:2012年3月27日優先權日:2011年3月30日【發明者】J.範萊恩,K.卡納達,R.卡朋漢弗,N.奧埃爾,T.利岑布格爾,C.R.薩科,S.辛格,A.K.沃特曼申請人:勃林格殷格翰國際有限公司