人多囊蛋白－1N端融合蛋白PC－1－e2的製作方法

2023-07-04 23:06:16 1

專利名稱：人多囊蛋白－1 N端融合蛋白PC－1－e2的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥分子生物工程技術領域，是一種人多囊蛋白-1N端的融合蛋白PC-1-e2，可用於製備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病的藥物，並可用於製備研究該病發病機制的試劑和製備抗PC-1的抗體。
背景技術：
常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是嚴重危害人類健康的遺傳性腎臟病，患者雙側腎臟密布囊腫，常在中年後期發展成為終末期腎衰竭，由於其致病基因在體內廣泛表達，還常累及其他有上皮的器官，包括肝臟、胰腺、卵巢和脈絡叢等，危害甚大。目前已經明確，85～90％的ADPKD的發生系由於PKD1的編碼產物—多囊蛋白-1(PC-1)的結構和功能異常所致，但迄今為止對PC-1的具體功能尚不清楚。腎臟的PC-1表達主要在腎小管上皮細胞，它是一個分子量約460kD的跨膜糖蛋白，由4302個胺基酸組成，包括1個龐大的胞外區，11個跨膜區和1個相對小的胞漿尾。其中胞外區含3074個胺基酸殘基，其所擁有的眾多複雜的蛋白基序決定了胞外部分對PC-1行使正常生理功能的重要性。位於胞外區的氨基端有2個富含亮氨酸的重複序列(LRR區)及其富含半胱氨酸的側翼區域(flank區)，作為細胞表面的受體，參與涉及細胞黏附的蛋白質-蛋白質之間的相互作用。這種黏附作用的失常導致PC-1的信號傳導異常，進而引起細胞周期失衡。
在ADPKD的發病機制中，腎小管上皮細胞異常增生是囊腫發生的一個重要因素。很多原因可以引起腎小管上皮細胞的異常增生，其中PC-1的功能異常導致細胞周期調控失衡，引發各種原癌基因(如c-myc、c-fos、c-jun等)過度表達，進而導致腎小管上皮細胞的過度增殖並形成囊腫。
抑制腎小管上皮細胞異常增生的幹預措施已有報導，如用洛伐他汀、酪氨酸蛋白激酶抑制劑等，其不僅費用昂貴，而且幹預效果有限，還由於涉及的信號傳導途徑複雜，半衰期短等原因，帶來許多不可控因素。

發明內容
本發明提供一種對ADPKD囊腫襯裡上皮細胞和犬遠端腎小管上皮細胞(MDCK)的增生具有明顯抑制作用的融合蛋白PC-1-e2，其可用於製備治療ADPKD的藥物，並可用於製備、研究ADPKD的發病機制的試劑及製備抗人PC-1的抗體。
本發明融合蛋白PC-1-e2是用分子生物工程技術製備的，其為人PC-1胞外區N端的flank-LRR-flank區和部分WSC區的第46～202位胺基酸殘基與6個組氨酸組成的融合蛋白，PC-1-e2的製備方法如下1.製備人腎組織總RNA取新鮮的健康成人腎組織，用總RNA抽提試劑盒，按常規的異硫氰酸胍法提取總RNA。
2.合成引物根據已知的人類PKD1 cDNA序列(GenBankL33243)，設計併合成引物。正向引物 其5』端引入BamHI酶切位點 反向引物 其5』端引入HindIII酶切位點 3.RT-PCR擴增PKD1e2以人腎組織總RNA為模板，用上述引物通過RT-PCR擴增編碼PC-1N端flank-LRR-flank區和部分WSC區的PKD1 cDNA序列PKD1e2，其全長474bp，核苷酸序列見表1。
4.構建表達載體pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2將融合蛋白表達載體pQE30(德國Qiagen公司產品，其閱讀框的5』端含編碼連續6個組氨酸的核苷酸序列)和PKD1e2分別用BamHI和HindIII雙酶切，將兩種酶切產物膠回收後用T4DNA連接酶連接，然後轉化感受態大腸桿菌M15，其轉化子重組質粒通過BamHI/HindIII雙酶切和DNA序列分析鑑定，重組表達載體為pQE30-PKD1e2，工程菌為M15/pQE30-PKD1e2。
5.融合蛋白PC-1-e2的誘導表達工程菌M15/pQE30-PKD1e2在LB培養基中37℃培養過夜，以1∶20體積比接種在2×YT培養基中，繼續培養至OD600值為0.5～0.6，加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM/L，32℃誘導表達4～5小時。經破菌和Ni-NTA Agarose純化後，行SDS-PAGE電泳，顯示表達的融合蛋白分子量為19.0kD，即為PC-1-e2，其胺基酸序列見表2。
6.融合蛋白PC-1-e2的純化及SDS-PAGE分析
4℃離心收集步驟5誘導表達後的菌體，經8M/L尿素裂解液(pH8.0)充分裂解後離心，將上清與50％Ni-NTAAgarose(德國Qiagen公司產品)混合，用pH梯度8M尿素緩衝液(pH6.3，pH5.9，pH4.5)洗滌並洗脫融合蛋白PC-1-e2。12％SDS-PAGE分析融合蛋白PC-1-e2，蛋白薄層掃描分析該融合蛋白佔菌體總蛋白的47.11％。
7.融合蛋白PC-1-e2的Western blot鑑定將純化的PC-1-e2行SDS-PAGE電泳後，半乾法電轉移至硝酸纖維素膜，5％脫脂奶粉封閉，加兔抗人PC-1氨基端多克隆抗體N3(1∶100稀釋)溫育，再加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，洗滌後加入DAB-H2O2底物顯色並拍照。純化的融合蛋白PC-1-e2與多克隆抗體N3反應，在相對分子量19.0kD(PC-1-e2)處出現單一條帶。
在成功獲得人PC-1N端融合蛋白PC-1-e2後，進一步對其抑制腎小管細胞及囊腫襯裡細胞增殖的作用進行了檢測。採用噻唑藍(MTT)法檢測PC-1-e2對ADPKD囊腫襯裡上皮細胞系和犬腎遠端小管上皮細胞株的增殖抑制作用。結果顯示，同對照組相比，在PC-1-e2處理後48小時、72小時和96小時，250ng/ml和500ng/ml濃度的PC-1-e2能夠明顯抑制ADPKD1囊腫襯裡上皮細胞系和犬腎遠端小管上皮細胞株的增殖，在所有濃度範圍內，PC-1-e2對兩種細胞均無明顯損傷作用。
實驗證明，人PC-1N端flank-LRR-flank區和部分WSC區的融合蛋白PC-1-e2的純度和生物學活性均較理想，對腎小管上皮細胞的增生及囊腫襯裡上皮細胞的異常增殖具有明顯抑制作用，並且抑制作用持久。本發明融合蛋白成本低廉，無明顯毒副作用，可用於製備治療ADPKD的藥物，並可用於製備研究ADPKD的發病機制的試劑及製備抗人PC-1N端的抗體。


圖1為本發明融合蛋白PC-1-e2的重組表達載體pQE30-PKD1e2構建流程圖；圖2為本發明構建的融合蛋白重組表達載體pQE30-PKD1e2的結構示意圖。
具體實施例方式
現對製備人PC-1N端融合蛋白PC-1-e2作詳細描述。
一、材料1.質粒和菌株融合蛋白表達載體pQE30(其閱讀框5』端含有編碼連續6個組氨酸的核苷酸序列，該質粒含氨苄青黴素抗性標記基因)和表達宿主菌M15(該菌種含有阻遏質粒pREP4，其含卡那黴素抗性標記基因)購自德國Qiagen公司。
2.主要試劑及儀器總RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒為華舜公司產品，One-Step RT-PCR試劑盒、Ni-NTA純化試劑(Ni-NTA Agarose)購自德國Qiagen公司。各種限制性內切酶、T4DNA連接酶為Takara公司產品。氨苄青黴素(Amp)、卡那黴素(Kan)購自上海華美生物工程公司。胎牛血清、RPMI 1640和DMEM細胞培養基等均為Gibco公司產品。抗PC-1N端多克隆抗體N3由美國耶魯大學醫學院蔡逸強博士惠贈。噻唑藍(MTT)為Amresco公司產品。PCR儀(MJ Research，PTC-200)，酶標儀(LabsystemsMK3)。
二、製備方法1.製備人腎組織總RNA以正常人腎組織，用華舜公司的大量組織總RNA抽提試劑盒製備總RNA，該試劑盒配有TCL裂解液、RP液、W3液和吸附柱等，操作所用材料均經RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC)的0.1％水溶液處理。
(1)將新鮮腎組織300mg放入50ml離心管並置冰裕，加入5ml TCL裂解液，用勻漿器充分勻漿，將勻漿液移入50ml離心管中，再用帶針頭的20ml一次性注射器抽打裂解物10次。
(2)加5ml Tris-HCl飽和酚，高速振蕩2分鐘，再加2ml氯仿，用力顛倒混勻後室溫5000g離心10分鐘，移取5ml水相至50ml離心管中。加75％乙醇2.5ml，混勻後移入吸附柱。加RP液5ml，5000g離心5分鐘。
(3)在吸附柱中加W3液5ml，靜置2分鐘後，5000g離心10分鐘。此步驟重複兩遍。
(4)將吸附柱放入一個乾淨的離心管中，往吸附膜中央加500μl無菌純水，靜置3分鐘，5000g離心10分鐘，即獲得總RNA樣品，置-80℃保存備用。
(5)RNA的鑑定RNA甲醛變性電泳配製1％甲醛變性凝膠(10×MOPS緩衝液10ml，0.1％DEPC水溶液90ml，瓊脂糖1.0克。加熱融化並冷卻至60℃後加入37％甲醛5.4ml和10mg/ml的溴化乙澱6μl，倒入制膠器)；將上述RNA溶液20μl同20μl載樣緩衝液混合，95℃水浴變性2分鐘後加樣電泳。總RNA電泳後在紫外燈下拍照，可看到清晰的28S rRNA和18S rRNA兩個條帶，前者亮度強於後者。
A260/A280＝1.9418，介於1.7～2.0之間，說明RNA降解較少，純度理想。
2.RT-PCR擴增PKD1 cDNA片段PKD1e2
(1)引物設計合成根據已知的人類PKD1 cDNA序列(GenBank L33243)，設計合成1對引物，用於擴增編碼PC-1N端flank-LRR-flank區和部分WSC區的PKD1 cDNA，正向引物 其5』端引入BamHI酶切位點 反向引物 其5』端引入HindIII酶切位點 引物由Invitrogen公司合成。
(2)RT-PCR擴增以上述人總RNA為模板，用上述引物，採用Qiagen公司的One-Step RT-PCR試劑盒(該試劑盒配有無RNA酶水、QIAGEN酶混合物——反轉錄酶和熱啟動TaqDNA多聚酶、5×QIAGEN緩衝液、5×Q溶液、dNTP混合物等)進行擴增。反應體系為總RNA4.0μl(1.354μg)，10mmol/LdNTP混合物2.0μl，QIAGEN酶混合物2.0μl，5×QIAGEN緩衝液10.0μl，5×Q溶液10.0μl，正向引物3.0μl(30pmol)，反向引物3.0μl(30pmol)，無RNA酶水16.0μl。反應條件50℃反轉錄30分鐘；95℃15分鐘激活熱啟動TaqDNA多聚酶；以cDNA第一鏈為模板，94℃40秒，58℃40秒，72℃1分鐘，共進行35個循環；最後72℃延伸10分鐘。RT-PCR擴增產物用1.8％瓊脂糖凝膠電泳，並用DNA膠回收試劑盒回收474bp的擴增產物PKD1e2。
3.製備感受態大腸桿菌M15大腸桿菌M15中含有卡那黴素抗性的阻遏質粒pREP4，融合蛋白在M15中高效表達時，需要阻遏質粒pREP4表達的阻遏蛋白作用於表達載體pQE30的表達調控序列，嚴密調控融合蛋白的表達。
(1)取少量-80℃凍存的甘油菌M15，接種於含卡那黴素25μg/ml的LB瓊脂平皿，37℃培養過夜。挑取單菌落種於3ml LB(含卡那黴素25μg/ml)的試管中，37℃，250轉/分鐘振搖過夜。
(2)取200μl過夜培養菌種於含20ml LB(含卡那黴素25μg/ml)的試管中，37℃，300轉/分鐘振搖3小時，至OD600值為0.4，將試管取出冰浴15分鐘。
(3)培養物於4℃，4000g離心10分鐘，棄上清，加入4ml冰預冷的0.1M的CaCl2重懸菌體，冰浴30分鐘。
(4)4℃，4000g離心10分鐘，棄上清，各加入1ml冰預冷的0.1M的CaCl2重懸菌體，在4℃冰箱放置12-24小時即得到感受態M15菌，可用於轉化。
4.構建融合蛋白表達載體pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2取上述純化的RT-PCR產物PKD1e2和融合蛋白表達載體pQE30，按常規分別用BamHI和HindIII雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳後用DNA膠回收試劑盒純化，分別得到PKD1e2和表達載體pQE30的酶切片斷，按分子數9∶1比例，用T4DNA連接酶連接16小時，將連接反應產物轉化上述製備的感受態宿主菌M15，塗於氨苄青黴素(100μg/ml)和卡那黴素(25μg/ml)抗性的LB瓊脂平皿，37℃培養過夜獲得轉化子。
挑取轉化子經LB振蕩培養後，鹼裂解法抽提質粒DNA(1)在抗性LB平皿上挑取含質粒的大腸桿菌單克隆，接種在含相應抗生素的2ml LB試管中，37℃，250轉/分鐘振搖過夜。
(2)4℃，15000g離心30秒，收集菌體。
(3)加100μl冰預冷的溶液I(50mmol/L Glucose，25Mmol/LTris-HCl，10Mmol/L EDTA，pH8.0)，振蕩懸浮。加入溶液II(0.2M/L NaOH，1％SDS)200μl，迅速顛倒離心管7次。加入冰預冷的溶液III(5M/L KAc 60ml，CH3COOH 11.5ml，雙蒸水21.5ml)150μl，振蕩混勻，置冰浴2分鐘。
(4)4℃，15000g離心5分鐘。小心吸取上清約450μl放入另一試管中。
(5)加450μl酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻。4℃，15000g離心2分鐘。
(6)將上層水相約400μl轉移至另一離心管，加入無水乙醇800μl混勻。室溫靜置2分鐘。
(7)4℃，15000g離心5分鐘。棄上清，加入冰預冷的70％乙醇1ml，4℃下洗滌雙鏈DNA。4℃，15000g離心2分鐘，棄上清，得質粒DNA沉澱。
將所得的質粒DNA經BamHI和HindIII雙酶切，初步鑑定為重組質粒pQE30-PKD1e2，經ABI PRISMTM 3700型DNA測序儀測序分析證實pQE30載體上連接的是PKD1cDNA，大小為474bp，閱讀框正確。測序引物位於表達載體pQE30上，正向引物為5』-CGGATAACAATTTCACACAG-3』，反向引物為5』-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3』。該大腸桿菌轉化子為工程菌M15/pQE30-PKD1e2。重組質粒pQE30-PKD1e2的構建流程圖見圖1，重組質粒pQE30-PKD1e2的結構示意圖見圖2。
5.PC-1融合蛋白的誘導表達和純化(1)將上述獲得的工程菌M15/pQE30-PKD1e2接種於含氨卞青黴素(100μg/ml)和卡那黴素(25μg/ml)的LB 25ml，37℃，250轉/分鐘，培養過夜。
(2)以1∶20體積比接種在2×YT培養基中，繼續培養至OD600值為0.5～0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，32℃誘導表達4～5小時。
(3)4℃，9000g，離心3分鐘收集菌體。
(4)每克菌體加5ml 8M/L尿素裂解液(pH8.0)，充分裂解菌體至裂解溶液呈半透明，9000g離心45分鐘，收集上清。
(5)將上清與50％Ni-NTAAgarose混合(每4ml裂解溶液加1ml Agarose)，常溫下250轉/分鐘振搖1小時，然後將混合液裝柱，經梯度洗脫純化。
(6)配製pH值分別為pH6.3，pH5.9，pH4.5的三種尿素緩衝液(其成分均為100mMNaH2PO4，10mMTris.HCl，8Murea)，按pH值從高到低的順序對上柱蛋白進行梯度洗脫。pH5.9和pH4.5的尿素緩衝液可將柱上的融合蛋白洗脫下來，分別收集其洗脫蛋白液保存於-80℃冰箱。
(7)將上述初步純化的融合蛋白樣品液用12％SDS-PAGE電泳分析，操作參照《分子克隆實驗指南》(科學出版社，1992年10月第2版)。分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％。電泳後用0.05％考馬斯亮藍250染色液染色3小時，再經脫色液脫色。結果表明誘導表達後的細菌裂解物上清有一條明顯的蛋白條帶，分子量約為19.0kD，與理論預計的PC-1融合蛋白PC-1-e2分子量相吻合，確認所得的是融合蛋白PC-1-e2。蛋白薄層掃描分析融合蛋白PC-1-e2佔菌體總蛋白的47.11％，純化後的融合蛋白PC1-e2的純度在95％以上。
6.融合蛋白PC-1-e2的Western blot鑑定(1)取純化的融合蛋白PC-1-e2，以含有重組質粒但未經誘導的M15培養菌做陰性對照(同樣經裂解純化)，12％SDS-PAGE電泳。
(2)用半乾法將電泳膠蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，電轉條件為250伏，90分鐘。
(3)取下硝酸纖維素膜用5％脫脂奶粉封閉，PBST反覆洗滌3次，加1∶100稀釋的抗人PC-1N端多克隆抗體N3於37℃孵育1小時，PBST洗滌3次後，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG孵育1小時，PBST洗滌後加入DAB-H2O2底物顯色並拍照。結果顯示純化的融合蛋白PC-1-e2與多克隆抗體N3反應，在相對分子量19.0kD處出現單一條帶，而未經誘導的菌體純化產物則沒有條帶，說明表達的蛋白是所需要的人PC-1N端的融合蛋白。
7.融合蛋白PC-1-e2的復性將純化的融合蛋白PC-1-e2(已溶解在8M尿素緩衝液中)與復性緩衝液(含2mmol/L還原型穀胱甘肽和0.2mmol/L氧化型穀胱甘肽)按1∶9體積比混合，室溫孵育4小時。在4℃環境下，將該蛋白溶液對500ml pH8.0 PBS緩衝液進行透析48h，其間更換透析緩衝液5次。
8.MTT法檢測PC-1-e2對ADPKD囊腫襯裡上皮細胞系和MDCK的增殖抑制作用細胞傳代後取對數生長期的細胞接種於96孔板(1×104/孔)，24小時(37℃，5％CO2)後，加無血清DMEM培養液再培養24小時，使細胞生長同步。吸棄培養液，加入含不同濃度(100ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、500ng/ml)PC-1-e2的無血清DMEM培養液分別作用24小時、48小時、72小時和96小時(每組設6個復孔，48h換液1次)，經臺盼藍染色，活細胞數達95％以上，於刺激結束前4小時，加入MTT(5g/L)，酶標儀參考波長690nm，在讀數波長550nm處讀取光密度(D)值。結果顯示在PC-1-e2處理後48小時、72小時和96小時，250ng/ml和500ng/ml濃度的PC-1-e2能夠明顯抑制ADPKD囊腫襯裡上皮細胞系和MDCK的增殖，在所有濃度範圍內，PC-1-e2對兩種細胞均無明顯損傷作用。
本發明融合蛋白PC-1-e2對ADPKD囊腫襯裡上皮細胞系和MDCK的增殖有明顯的抑制作用，且無明顯的毒副作用，可用於製備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病的藥物，並可用於製備研究該病發病機制的試劑或製備抗PC-1的抗體。
表1 PKD1cDNA核苷酸序列GCCTGCCGCGTCAACTGCTCGGGCCGCGGGCTGCGGACGCTCGGTCCCGCGCTGCGCATCCCCGCGGACGCCACAGCGCTAGACGTCTCCCACAACCTGCTCCGGGCGCTGGACGTTGGGCTCCTGGCGAACCTCTCGGCGCTGGCAGAGCTGGATATAAGCAACAACAAGATTTCTACGTTAGAAGAAG GAATATTTGCTAATTTATTTAATTTAAGTGAAATAAACCTGAGTGGGAACCCGTTTGAGTGTGACTGTGGCCTGGCGTGGCTGCCGCGATGGGCGGAGGAGCAGCAGGTGCGGGTGGTGCAGCCCGAGGCAGCCACGTGTGCTGGGCCTGGCTCCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCTTGGCATCCCCTTGCTGGACAGTGGCTGTGGTGAGGAGTATGTCGCCTGCCTCCCTGACAACAGCTCAGGCACCGTGGCAGCAGTGTCCTTTTCAGCTGCCCACGA表2 融合蛋白PC-1-e2的胺基酸序列MHHHHHHGSACRVNCSGRGLRTLGPALRIPADATALDVSHNLLRALDVGLLANLSALAELDISNNKISTLEEGIFANLFNLSEINLSGNPFECDCGLAWLPRWAEEQQVRVVQPEAATCAGPGSLAGQPLLGIPLLDSGCGEEYVACLPDNSSGTVAAVSFSAAHEKL
權利要求
1.一種人多囊蛋白-1的N端融合蛋白PC-1-e2，其特徵在於由168個胺基酸組成，胺基酸序列如下MHHHHHHGSACRVNCSGRGLRTLGPALRIPADATALDVSHNLLRALDVGLLANLSALAELDISNNKISTLEEGIFANLFNLSEINLSGNPFECDCGLAWLPRWAEEQQVRVVQPEAATCAGPGSLAGQPLLGIPLLDSGCGEEYVACLPDNSSGTVAAVSFSAAHEKL。
2.權利要求1所述的融合蛋白PC-1-e2在製備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物或製備研究該病發病機制試劑或製備抗多囊蛋白-1的抗體中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥分子生物工程技術領域，是一種人多囊蛋白－1N端的融合蛋白PC－1－e2，可用於製備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病的藥物，並可用於研究該病的發病機制和製備抗多囊蛋白－1的抗體。本發明根據人類多囊腎病基因1(PKD1)的cDNA序列和其編碼產物——多囊蛋白－1(PC－1)的分子結構，採用分子生物工程技術克隆到編碼該蛋白N端的cDNA－PKD1e2，並構建其原核表達載體pQE30－PKD1e2，在大腸桿菌中誘導表達出PC－1 N端的融合蛋白PC1－e2(多囊蛋白－1的flank－LLR－flank區和部分WSC區)，經細胞生物學實驗證實該融合蛋白對體外培養的人多囊腎囊腫襯裡上皮細胞系和犬腎遠端腎小管上皮細胞株的增殖具有明顯的抑制作用，故可用於製備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病的藥物，也可用於製備研究該病發病機制的試劑和製備抗PC－1的抗體。
文檔編號C07K16/18GK1526736SQ0315118
公開日2004年9月8日 申請日期2003年9月25日 優先權日2003年9月25日
發明者趙海丹, 梅長林 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學