用於檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型及構建方法

2023-07-10 01:02:56

專利名稱：用於檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型及構建方法
技術領域：
本發明涉及惡性腫瘤檢測領域，為一種全新的非入侵性檢測方法，在體外對卵巢癌進行早期的發現和檢測，其敏感性和特異性均達到85%以上。
背景技術：
據WHO近期世界範圍統計資料，卵巢癌發病率和死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中均僅低於官頸癌佔第二位。而在西方國家，卵巢癌死亡率佔第一位，甚至比官頸癌和子宮內膜癌死亡人數的總和還多。由於尚無成熟的早期診斷方法，卵巢癌發現時70% -80%均為晚期，治療極其困難。常規的手術、化療難以治癒，即使暫時緩解亦常在2-3年後復發，而對這一部分病人反覆手術、化療嚴重影響患者生存質量。如果說卵巢癌是婦科腫瘤醫生面臨的最大挑戰並不過分。對於卵巢癌的診斷，根據其生物學特徵、年齡、性別、好發部位及臨床過程進行分析，在病史及體徵基礎上，採用電生理、超聲波、放射性核素、放射學及核磁共振等輔助檢查。近年，隨著影像學診斷技術的進步和顯微神經外科技術的應用，卵巢癌的診斷和治療總體上取得了顯著進步。然而，對惡性卵巢癌的治療似乎並沒有突破性進展，患者大多在確診後一年內死亡，迫切需要一種更早期的診斷方法。基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F-MS)是近年來發展起來的一種新型的軟電離生物質譜，其原理是用雷射照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從雷射中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比， 檢測離子。儘管MALDI-T0F的準確度高達0. 1 % 0. 01 %，遠遠高於目前常規應用的SDS 電泳與高效凝膠色譜技術，但在腫瘤標誌物尤其是卵巢癌標誌物的應用中仍然存在一些缺陷，因此國內迄今為止尚無採用MALDI-T0F-MS技術獲得檢測卵巢癌標誌物或卵巢癌血清特徵蛋白的報導。

發明內容
本發明目的在於提供一種用於檢測卵巢癌血清特徵蛋白的質譜模型及其製備方法。為實現上述目的，本發明首先提供一種用於檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜標記，該質譜標記是質荷比為1451m/zd673m/z的峰。表徵為質荷比1451m/z的蛋白和表徵為質荷比^73m/z的蛋白是卵巢癌血清特徵蛋白，當其它們上調表達時，預示為卵巢癌患者或潛
在患者。進而本發明提供一種用於檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型，該質譜模型由質荷比為1451m/z和^73m/z的峰構成，模型中表徵為質荷比1451m/z的蛋白和表徵為質荷比 2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特徵蛋白，當其它們上調表達時，預示為卵巢癌患者或潛在患者。根據Clirfrotools軟體對數據經過統一的歸一化處理後，導出的峰面積參數作相對定量，上調表達的臨界值是分別是24. 63 士0. 2、19. 74士0. 27。本發明質譜模型的構建方法包括如下步驟1)收集多例臨床確診的卵巢癌患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標本，進行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進行質譜前預處理3)對預處理過的兩組血清蛋白進行質譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的卵巢癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進行標準化處理，並收集數據；5)對所得數據進標準化處理，篩選出具有下列質荷比峰的2個卵巢癌特徵蛋白 145lm/z、2673m/z，對差異多肽145lm/z、2673m/z進行多肽序列測定，根據這兩個質荷比峰建立檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型。上述方法其中步驟2、預處理的方法是採用SPE-C磁珠對血清蛋白進行富集。本發明結合生物信息學方法篩選出相應的腫瘤標誌並建立檢測模型進行分析檢測，所述的生物信息學方法包括對指紋圖譜進行標準化處理、對所得數據進實驗質控處理、 篩選期望的血清特徵蛋白並建立質譜模型，以及可選擇地包括使用遺傳算法結合最近鄰算法建立並驗證質譜模型等。其中，所述的實驗質控處理指保留峰數量大於50的質譜圖譜數據，並採用Sigma血清的組內變異係數來保證實驗的一致性，從而根據變異係數滿足一致性的允許範圍來進行篩選。本發明中，變異係數優選為14.7%。本發明檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜標記，可用於建立血清特徵蛋白質譜模型以及應用於在卵巢癌早期檢測和篩查。本發明的質譜模型，可用於卵巢癌早期檢測和篩查。本發明與其它卵巢癌的檢測方法比較，具有以下優點第一，本發明採用卵巢癌患者與正常人具有差異的兩個特徵蛋白組合進行對卵巢癌血清的檢測，並採用了傳統統計學與現代生物信息學方法相結合的方法進行數據處理， 從而得到卵巢癌患者和健康人血清蛋白質指紋圖譜檢測模型，並且所發現的一系列蛋白質質荷比峰為尋找新的更理想的腫瘤標誌物提供了基礎和資源。第二，與以往的血清學檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，並能用於篩選抗卵巢癌的藥物中。第三，本發明模型的構建方法設計合理可行，為提供卵巢癌的臨床治癒率提供了新的篩查方法，同時也為探索腫瘤發生發展的機制提供了新的思路。第四，利用本發明分析了 39份血清樣品，訓練組30例，驗證結果顯示，1451m/z、 2673m/z在患病組和正常組間有明顯差異，因此本發明可對卵巢癌作出早期的診斷，提高病人的存活率和生活質量。


圖1為部分健康人血清和卵巢癌患者血清的多肽圖譜。圖2為重複做樣的5個Sigma血清質譜指紋圖。圖3-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達水平展示，箭頭指向為用於建模型的質荷比為1451m/z的卵巢癌特徵蛋白峰；圖3-B表示根據蛋白峰進行蛋白的模擬凝膠電泳圖，其中箭頭指向建模型的1451m/z的特徵蛋白帶。圖4-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達水平展示，箭頭指向為用於建模型的質荷比為^573m/Z的卵巢癌特徵蛋白峰；圖4-B表示根據蛋白峰進行蛋白的模擬凝膠電泳圖，其中箭頭指向建模型的2673m/z的特徵蛋白帶。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1卵巢癌特徵蛋白質譜模型的建立1、樣本和儀器共39例血清樣本，其中四例來自卵巢癌患者，另外10例來自健康人群，卵巢癌患者均經術後病理報告確定。均在清晨空腹下抽取，分離血清後儲存在-80度低溫冰箱中。基質輔助雷射解析飛行時間質譜Autoflex II T0F/T0F及實驗用的SPE-C磁珠試劑盒購自毅新興業(北京)科技有限公司。使用Bruker公司的數據分析軟體Clirfrotools 做數據的預處理，處理後的數據採用統計分析軟體R2. 6. 2的遺傳算法包genalg進行處理。2、血清採集及處理血清的採集收集靜脈血在BD管中，避免溶血。緩慢地上下振蕩管五次，使血液中的凝結塊混勻。室溫(25°C )血凝結1小時，垂直放置。其中血液必須精確凝結1小時，否則，由於樣品不同的凝結時間而導致不同的肽譜。室溫下，用臨床離心機以1.400-2. OOOg 離心SST管(真空採血管，BD公司)十分鐘。吸取血清(上清液)到對應的已標記管中。 標記乾淨的0. 5ml離心管，同一血清樣品50ul —管，分裝多管。立即凍存血清樣品於_80°C。 由於反覆凍融血清樣品易造成多肽沉澱，從而使得肽譜丟失部分多肽，應避免反覆凍融。凍存血清分為永久保存和待分裝的。血清分裝後可在-80°C保存多年。血清樣品的磁珠處理在進行Clirfrot實驗前，從低溫冰箱提取分裝的血清樣品各1管，放於溼冰上。化凍60 90分鐘。取出10 μ 1磁珠結合緩衝液(BS)，10 μ 1混勻的磁珠懸浮液，5μ 1血清樣品至樣品管，混勻。室溫靜置5min後，將樣品管放入磁珠分離器。 使磁珠貼壁1分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體，再向樣品管中加入100 μ 1磁珠清洗緩衝液(WQ，在磁珠分離器前後相鄰兩孔間反覆移動樣品管10次。最後一次使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體。重複從加100 μ 1磁珠清洗緩衝液，到最後吸去懸浮液體的操作步驟共3次。從磁珠分離器上取下樣品管，並向樣品管中加入5 μ 1磁珠洗脫緩衝液(EQ，溶解貼壁的磁珠，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離後，將上清液移入乾淨的剛加入5μ 1磁珠穩定緩衝液 (SS)O. 5ml 樣品管。3、生物信息學方法(一 )質譜數據採集應用Autoflex II T0F/T0F質譜儀。雷射能量50 %時，IOshots去雜，36 %時
550shots採集一個樣品結晶點的某一個點，平均每個樣品結晶點收集8次共400shots。雷射頻率50Hz。數據收集範圍l-20KDa。在每8個樣品結晶點收集數據前用標準品進行外標校正，平均分子量偏差小於lOOppm。實驗質控(1)對於每一張採集到的原始圖譜，設定S/N > = 5的峰數量做為評判圖譜質量的一個標準；對於峰數量大於50的圖譜才保存，捨棄峰數量小於50的圖譜。(2) 針對整個實驗操作，採用Sigma血清的組內變異係數保證實驗的一致性，本實例方法的變異係數為14. 7%，滿足一致性允許範圍，說明實驗一致性良好。表1為Sigma血清中12個蛋白峰的變異係數值。表ISigma血清的組內變異係數
權利要求
1.用於檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜標記，其包括質荷比為1451m/zd673m/z的峰。
2.根據權利要求1所述的質譜標記，其特徵在於，所述的質荷比為1451m/z的多肽的胺基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述的質荷比為^73m/z的多肽的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.用於檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型，其特徵在於，該質譜模型中包含質荷比為 1451m/z,2673m/z的峰，當這兩個峰上調表達時預示為卵巢癌患者或潛在患者。
4.建立權利要求3所述質譜模型的方法，包括如下步驟1)收集多例臨床確診的卵巢癌患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標本，進行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進行質譜前預處理3)對預處理過的兩組血清蛋白進行質譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的卵巢癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進行標準化處理，並收集數據；5)對所得數據進行標準化處理，篩選出具有下列質荷比峰的2個卵巢癌特徵蛋白 1451m/ZJ673m/Z，對差異多肽1451m/ZJ673m/Z進行多肽序列測定，根據這兩個質荷比峰建立檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，其中步驟幻預處理的方法是採用SPE-C磁珠對血清蛋白進行富集。
全文摘要
本發明提供了一種用於檢測檢測卵巢癌特徵蛋白的質譜模型，該質譜模型由質荷比為1451m/z和2673m/z的峰構成，模型中表徵為質荷比1451m/z的蛋白和表徵為質荷比2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特徵蛋白，當其它們上調表達時，預示為卵巢癌患者或潛在患者。本發明的質譜模型，可用於卵巢癌早期檢測和篩查，方法簡單易於操作，準確性高。為卵巢癌早期檢測和篩查提供了新的思路。
文檔編號G01N27/64GK102426186SQ20111023898
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者李燕, 趙豔梅, 邢雙豔, 馬慶偉 申請人:毅新興業(北京)科技有限公司