利用hplc測定手性液液萃取水相布洛芬對映體濃度的方法

2023-08-09 00:16:51

專利名稱：利用hplc測定手性液液萃取水相布洛芬對映體濃度的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用HPLC法測定手性液液萃取體系水相溶液中布洛芬對映體濃度的方法。
背景技術：
布洛芬(ibuprofen) [(R, S)-2-(_4-異丁基苯基)_丙酸]是一種重要的非甾體藥物，因為其鎮痛、消炎和退熱的作用遠比阿司匹林、保泰松和撲熱息痛強而備受消費者青睞，多年來一直佔據消炎鎮痛類藥物銷售額的榜首。布洛芬分子α位是手性碳原子，存在一對光學活性異構體，化學結構式為
現代藥理實驗證明，其藥理活性主要是S-型布洛芬產生的，S-型布洛芬的療效比R-型布洛芬高約160倍，且主要的毒副作用都是由R-型布洛芬引起的。因此製備單一的S-布洛芬給藥可以顯著減小劑量、提高療效、減少對人體的毒副作用。液液萃取分離布洛芬對映體技術由於在生產過程中易於實現自動化的連續生產以及能耗低的優點，被認為是一項具有開發前景的拆分技術。故建立一種準確測定布洛芬兩種對映體濃度的方法，對其生產有重大指導意義，也能夠推進手性藥物開發技術健康有序的發展。迄今為止，僅有少量文獻報導了布洛芬的色譜分析方法，主要由手性流動相添加法和正相色譜直接分析法兩大類分析方法，前者比較有代表性的是李成平等(藥物分析雜誌，2005，25 (4) =426-428)以 Agilent Eclipse XDB-C8 柱作為分析柱，以水甲醇乙腈
=78 17 5，其中羥丙基-β-環糊精的濃度是80mmol/L，0. 2%磷酸，pH=4. 50的
液作為流動相，流速I. Oml/min，分離度約為I. 42，兩種對映體的保留時間分別為48min和56min,儘管該方法拆分效果尚可，但是分析時間過長，進行液液萃取實驗時往往需要分析的樣品較多，該分析方法不利於提高實驗效率。關於正相色譜直接法，Crowther等研究者(Anal. Chem.，1984，56，2921-2926)以Pirkle型手性固定相附著於矽膠顆粒上作為手性填
P|Hg:254nm檢測波長下，以正己燒異丙醇=97 3(體積比)作為流動相,在2ml/min的流
速下實現了對布洛芬外消旋體的色譜拆分；宋少芳等(藥物分析雜質，2002，22(1) :50-52)以Chiral OD-H柱作為分析柱，以正己烷醋酸=99 I作為流動相，成功的對布洛芬對映體實現了分離，該分析方法雖成功實現了布洛芬對映體的分離，但是存在的問題是作為流動相的色譜正己烷價格昂貴，另外該分析方法比較苛刻，溶解樣品的溶液需為有機溶劑，且其極性不能大於流動相的極性，否則會降低分離度直至無法達到基線分離，不能滿足手性液液萃取體系水相布洛芬對映體濃度的分析要求。因此迫切需要開發一種能夠分析手性液液萃取體系水相溶液布洛芬對映體濃度的方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用HPLC測定手性液液萃取水相布洛芬對映體濃度的方法，準確測定手性液液萃取水相布洛芬兩種對映體的濃度。申請人:發現，以α「酸性糖蛋白類手性柱作為分析柱，以含有甲醇的磷酸鈉-磷酸緩衝溶液作為流動相，在適當的檢測波長和流速下可以將液液萃取體系水相溶液中的布洛芬對映體進行有效色譜分離，同時對於手性液液萃取體系，由於水相和油相經充分混合振蕩，水相溶液中容易混入痕量有機溶劑，此時取樣分析會引起色譜峰偏離基線，影響峰面積積分準確性，無法正確分離分析布洛芬對映體，加入甲醇能夠顯著改善這一狀況。本發明採用的檢測波長為220nm±3nm時，其中檢測波長為220nm時， 紫外吸收強度適中，故檢測波長優先選擇220nm。本發明採用的緩衝鹽溶液的pH值範圍6. 5-7. O,使用pH值為7. O時，分離度最高，故選擇pH值為7.0。本發明的方法的流動相中，緩衝鹽-甲醇混合溶液中甲醇的體積分數是O. 5%-2%，選擇甲醇體積分數為2%，原因在於保證達到基線分離的前提下，使用甲醇體積分數2%的流動相進行樣品測試可以使分析時間最短，提高分析效率。本發明所述的分離分析方法，可按照以下方法實現(I)待測樣品溶液的製備主要分為兩種樣品溶液的製備①將布洛芬外消旋體用磷酸鹽/磷酸溶液溶解，配製成濃度為O. 0006g/L-0. 08g/L的溶液，通過色譜分析，得到布洛芬兩種對映體濃度隨峰面積的變化關係。②以布洛芬外消旋體溶於磷酸鹽/磷酸溶液得到O. 08g/L的布洛芬外消旋體溶液作為水相，以L-酒石酸正戊酯的正辛烷溶液作為油相完成手性液液萃取實驗，分液之後取水相布洛芬溶液過濾通過色譜分析得到水相中未知樣品的峰面積。(2)樣品檢測採用以a r酸性糖蛋白作為填料的手性色譜柱，流動相為甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽溶液，流速為O. 3-0. 5ml/min，檢測波長為210_230nm，取步驟(I)製備好的待測樣品溶液①和②分別注入HPLC，檢測後得到譜圖並進行分析，通過對樣品溶液①進行分析得到濃度隨峰面積變化的標準曲線，將樣品溶液②的未知峰面積代入樣品溶液①的標準曲線，得到手性液液萃取水相布洛芬兩種對映體的濃度。進一步，步驟(2)所述的甲醇的體積分數為O. 5%-2. 0%。進一步，所述的甲醇的體積分數為2%。進一步，所述的磷酸鹽為磷酸鈉。進一步，步驟(2)使用甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽溶液的pH值範圍為6. 5-7. O。進一步，甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽溶液的pH值為7. O。進一步,步驟(2)所述的流動相的流速為O. 5ml/min。進一步，步驟(2)所述的檢測波長為220nm±3nm。
其中HPLC儀島津輸液單元為LC-20AT，檢測器為SPD-20A，脫氣機為D⑶_A5s色譜柱AGP(日本 DAICEL 公司，IOOmmX4. 6mm, 5 μ m)手性柱流動相磷酸鈉/磷酸緩衝鹽甲醇=98 2 (體積比)檢測波長220nm流速0.5ml/min
柱溫室溫由上述技術方案可知，本發明採用以a i-酸性糖蛋白類作為填料的Chiral-AGP(DAICEL公司，IOOmmX 4. 6mm, 5 μ m)手性色譜柱，能夠有效的分析分離布洛芬對映體；選擇磷酸鈉/磷酸緩衝鹽溶解樣品，確保了溶液的穩定性；加入體積分數2%的甲醇，能夠避免液 液萃取體系水相溶液混入的痕量有機溶劑導致的基線偏移，提高了分離分析的準確性；選擇進樣體積20 μ L，提高了色譜峰的對稱性；表明該方法簡單、快速、準確、有效，精密度高，重現性良好，為S-布洛芬質量標準的制定建立了基礎。


圖I實施例1，甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(ρΗ=7· 0)，流速O. 5ml/min的HPLC譜圖，測定手性液液萃取實驗水相布洛芬溶液兩種對映體的濃度，檢測波長220nm圖2實施例2，甲醇(O. 5%)-磷酸鈉/磷酸(pH=6. 5)，流速O. 5ml/min的HPLC譜圖，測定布洛芬外消旋體樣品濃度為O. 02g/L，檢測波長220nm圖3實施例3，甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 3ml/min的HPLC譜圖，測定布洛芬外消旋體樣品濃度為O. 0006g/L，檢測波長230nm圖4實施例3，甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min的HPLC譜圖，測定布洛芬外消旋體樣品濃度為O. 08g/L，檢測波長210nm圖5對比例1，異丙醇(1%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min的HPLC譜圖，測定手性液液萃取實驗水相布洛芬溶液兩種對映體的濃度，檢測波長220nm圖6對比例2，磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min的HPLC譜圖，測定手性液液萃取實驗水相布洛芬溶液兩種對映體的濃度，檢測波長220nm圖7對比例3，甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 9ml/min的HPLC譜圖，測定手性液液萃取實驗水相布洛芬溶液兩種對映體的濃度，檢測波長220nm
具體實施例方式以下通過具體實例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護內容不局限於以下實施實例。以下實施實例中所使用的儀器和藥品如下HPLC儀為島津LC-20AT，紫外檢測器SPD-20A，LC-solution色譜工作站，a r酸性糖蛋白類為固定相的AGP色譜柱(DAICEL公司，IOOmmX 4. 6mm, 5 μ m),電子分析天平(美國OHAUS (奧豪斯)公司，十萬分之一)，精密離子計(上海大浦化工有限公司)，數控超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)，超純水系統(美國PALL Corporation) R-布洛芬和S-布洛芬，布洛芬外消旋體，磷酸鈉，磷酸，色譜甲醇，色譜異丙醇，色譜乙腈，正辛烷、1，2_ 二氯乙烷，正辛醇為分析純實施例I配製O. 08g/L布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液和L-酒石酸正戊酯的正辛烷溶液，完成手性液液萃取實驗，分液之後取水相布洛芬溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾。採用a i-酸性糖蛋白類作為填料的手性色譜柱，流動相為甲醇(2%)_磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min，檢測波長為220nm，進樣量為20 μ L。得到樣品分析譜圖。布洛芬兩種對映體的分離度為I. 512，達到基線分離，峰形良好，實現了手性液液萃取實驗水相溶液布洛芬兩種對映體的分析。實施例2
配製O. 02g/L的布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾。採用a r酸性糖蛋白類AGP手性色譜柱，流動相為甲醇(O. 5%)-磷酸鈉/磷酸(pH=6. 5)，流速O. 5ml/min，檢測波長為220nm，進樣量為20 μ L。得到樣品分析譜圖。相比較實施例1，布洛芬兩種對映體的保留時間分別變為13. 752min和18. 762min，較之甲醇體積分數為2%的保留時間變大，分離度增大為I. 825，能夠達到基線分離。實施例3配製O. 0006g/L的布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾。採用a r酸性糖蛋白類AGP手性色譜柱，流動相為甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 3ml/min，檢測波長為230nm，進樣量為20 μ L。得到樣品分析譜圖。布洛芬兩種對映體的分離度為I. 822，能夠達到基線分離。實施例4配製O. 08g/L的布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾。採用a r酸性糖蛋白類AGP手性色譜柱，流動相為甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min，檢測波長為210nm，進樣量為20 μ L。得到樣品分析譜圖。布洛芬兩種對映體的分離度為I. 508，能夠達到基線分離。對比例I採用Ci1-酸性糖蛋白類AGP手性色譜柱，流動相為異丙醇(1%)-磷酸鈉/磷酸(ρΗ=7. 0)，流速O. 5ml/min，檢測波長為220nm，進樣量為20 μ L。以實施例I樣品溶液進行分析得到樣品分析譜圖。相比較實施例1，布洛芬兩種對映體的保留時間邊為6. 425min和
8.012min，較之甲醇的保留時間明顯變短，但是分離度下降為I. 026，不能達到基線分離，布洛芬兩種對映體的峰面積有一定比例的重疊，不能滿足分析要求。對比例2採用a r酸性糖蛋白類AGP手性色譜柱，流動相為磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min，檢測波長為220nm，以實施例I樣品溶液進行分析得到樣品分析譜圖。在分析樣品時發現，色譜峰容易偏離基線，不能滿足定量分析測試布洛芬對映體濃度的要求。對比例3採用a r酸性糖蛋白類AGP手性色譜柱，流動相為甲醇(2%)-磷酸鈉/磷酸(pH=7. 0)，流速0. 9ml/min，檢測波長為220nm，進樣量為20 μ L。以實施例I樣品溶液進行分析得到樣品分析譜圖。較之實施例1，增大流動相流速，分離度降低為I. 075，兩種對映體峰面積重疊部分較大，不能滿足分析要求。實施例5對本發明測定液液萃取體系水相溶液中布洛芬對映體濃度的方法學考
察I.專屬性考察配製O. 01g/L布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，按照實施例I的色譜條件進行檢測，進樣量為20 μ L。結果發現R-布洛芬和S-布洛芬分離度為I. 512，能夠達到完全的基線分離。2.線性關係考察
分別精確配置O. 0006g/L、0. 001g/L、0. 002g/L、0. 004g/L、0. 006g/L、0. 01g/L、0. 02g/L、0. 04g/L、0. 06g/L和0. 08g/L的布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，按照實施例I的色譜條件進行檢測，進樣量為20 μ L。R-布洛芬濃度與峰面積在O. 0003-0. 04g/L濃度範圍內呈現良好的線性關係，相關度係數為R2=O. 99975 ；S-布洛芬濃度與峰面積在O. 0003-0. 04g/L濃度範圍內呈現良好的線性關係，相關度係數為 R2=O. 99926。3.色譜系統精密度考察配製O. 01g/L布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，按照實施例I的色譜條件進行檢測，進樣量為20 μ L，重複進樣9次，測定兩種對映體濃度，計算相對標準偏差分別為I. 30%和I. 08%。說明該分析方法精密度良好。4.分析方法重現性考察分別配製O. 006g/L布洛芬外消旋體的磷酸鈉-磷酸溶液7份，用O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，按照實施例I的色譜條件進行檢測，進樣量為20 μ L，測定兩種對映體濃度，計算相對標準偏差分別為I. 58%和I. 60%。表明該方法重現性良好。綜上所述，本發明方法能夠有效的分析分離布洛芬對映體，能夠準確測定手性液液萃取體系水相溶液中布洛芬兩種對映異構體的濃度，該方法簡單、快速、準確、有效，精密度高，重現性好，是測定手性液液萃取體系水相溶液布洛芬兩種對映異構體濃度的理想方法。
權利要求
1.一種利用HPLC測定手性液液萃取水相布洛芬對映體濃度的方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)待測樣品溶液的製備 製備以下兩種樣品溶液 ①將布洛芬外消旋體用磷酸鹽/磷酸溶液溶解，配製成濃度為O.0006g/L-0. 08g/L的溶液，通過色譜分析，得到布洛芬兩種對映體濃度隨峰面積的變化關係； ②以布洛芬外消旋體溶於磷酸鹽/磷酸溶液得到O.08g/L的布洛芬外消旋體溶液作為水相，以L-酒石酸正戊酯的正辛烷溶液作為油相完成手性液液萃取實驗，分液之後取水相布洛芬溶液過濾通過色譜分析得到水相中未知樣品的峰面積； (2)樣品檢測 採用以α「酸性糖蛋白作為填料的手性色譜柱，流動相為甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽溶液，流速為O. 3-0. 5ml/min，檢測波長為210_230nm，取步驟(I)製備好的待測樣品溶液①和②分別注入HPLC，檢測後得到譜圖並進行分析，通過對樣品溶液①進行分析得到濃度隨峰面積變化的標準曲線，將樣品溶液②的未知峰面積代入樣品溶液①的標準曲線，得到手性液液萃取水相布洛芬兩種對映體的濃度。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟(2)所述的甲醇的體積分數為O. 5%-2. 0%。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的甲醇的體積分數為2%。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的磷酸鹽為磷酸鈉。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟(2)使用甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽溶液的PH值範圍為6. 5-7.0。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽溶液的pH值為7. O。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟(2)所述的流動相的流速為O.5ml/min0
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟(2)所述的檢測波長為220nm±3nm。
全文摘要
利用HPLC測定手性液液萃取水相布洛芬對映體濃度的方法，是一種手性液液萃取體系水相中布洛芬兩種對映體的濃度的測定方法。該方法採用α1-酸性糖蛋白類手性柱，以甲醇-磷酸鹽/磷酸緩衝鹽作為流動相，在適當的紫外檢測波長和流速下，通過校正曲線法測定手性液液萃取體系水相溶液中布洛芬兩種對映體的濃度。該方法能夠使布洛芬兩種對映體達到基線分離，能夠準確測定布洛芬對映體的濃度，該方法簡單、快速、準確、有效，精密度高，重現性好，為S-布洛芬質量標準的制定建立了基礎。
文檔編號G01N30/88GK102890134SQ20121016073
公開日2013年1月23日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者任鍾旗, 程永琪, 趙丹, 郭志敏, 張衛東, 劉君騰 申請人:北京化工大學