抑制PTP1B活性的遠志有效部位及其製備和應用的製作方法

2023-08-09 17:52:01 1

本發明涉及中藥提取物有效部位，具體屬於抑制ptp1b活性的遠志有效部位及其製備方法和應用。

背景技術：

糖尿病(diabetesmellitus，dm)是以血糖升高為特徵的內分泌代謝紊亂疾病，主要分為1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病作為dm的主要類型，發病機制主要涉及胰島b細胞受損導致的功能障礙，以及由於胰島素信號通路紊亂引起的外周組織對胰島素敏感性的降低，目前臨床上治療糖尿病的藥物主要有胰島素促分泌劑、胰島素增敏劑等，但這類藥物常存在不同程度的副作用，無法達到預期的治療效果。隨著對於糖尿病發病機制的深入研究，依據發病關鍵靶點作用機制來尋找安全且高效的降糖藥物已成為該領域新的研究焦點。糖尿病往往都伴隨著胰島素敏感組織中的胰島素敏感性降低，也就是胰島素抵抗。這是因為胰島素信號在傳導過程中減弱或出現調控紊亂，從而引起肌肉、肝臟及脂肪組織中的糖脂代謝失衡。研究人員發現在胰島素信道通路中存在一個重要的調控機制就是對胰島素受體(insulinreceptor，ir)、胰島素受體底物(insulinreceptorsubstrate，irs)以及其他下遊分子的蛋白質酪氨酸磷酸化進行可逆性調節。在胰島素信號轉導過程中，被激活的磷酸化ir轉移到內質網上，被特定的酪氨酸酯酶，如蛋白酪氨酸磷酸酯酶1b(proteintyrosinephosphatase1b，ptp1b)，去磷酸化則失活，胰島素信號通路則被終止。由此可見，在整個信號傳導過程中，通過對ptp1b活性的抑制，有助於提高胰島素信號通路的敏感性以及ir、irs-1的磷酸化水平，從而達到治療糖尿病的效果。自ptp1b對胰島素通路的負調控機制闡明至今，已有大約300種小分子抑制劑被發現，但卻沒有相應的新藥上市，這主要是因為該類藥物生物有效性和專屬性不高，於是，開發高效而安全的ptp1b抑制劑對於糖尿病的治療及新藥研發具有非常重大的意義。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供具有抑制ptp1b活性的遠志有效部位及其製備方法和應用。提取分離出的遠志有效部位對ptp1b具有較高抑制活性，可在製備抗糖尿病藥物中應用。

本發明提供的一種抑制ptp1b活性的遠志有效部位的製備方法，步驟如下：將遠志藥材剪短至1-2cm，加入8-10倍的95％乙醇浸泡10-12h，加熱回流2h，藥渣重複浸泡2-3h、回流提取2-3次後合併提取液，過濾，將濾液減壓濃縮至無醇味，即得到醇提物；將過濾後的藥渣，加8-10倍水浸泡10-12h，加熱回流2h，重複浸泡2-3h、回流提取2-3次後合併提取液，過濾，減壓濃縮至流浸膏狀，得到水提物；將醇提物與水提物等體積混合，加入1-1.5倍體積的沸點60℃-90℃的石油醚，萃取2-3次，收集合併萃取剩餘液體，加入1-1.5倍體積的氯仿，萃取2-3次，收集、合併萃取液，回收溶劑，濃縮至浸膏，60℃真空乾燥，粉碎得部位b。

本發明以遠志藥材為原料，採用現代提取分離技術得到遠志的醇提物、水提物和部位a、b、c、d、e，通過體外ptp1b抑制劑篩選模型，對遠志不同提取部位進行了活性篩選，篩選出部位b即氯仿部位對ptp1b具有明顯的抑制作用，其可在製備治療糖尿病藥物中應用。

附圖說明

圖1遠志各部位的提取、分離流程圖；圖中：ct：遠志醇提物；wt：遠志水提物；a：石油醚部位；b：氯仿部位；c：乙酸乙酯部位；d：正丁醇部位；e：萃取水部位。

圖2遠志石油醚部位的uplc-uv圖譜。

圖3遠志氯仿部位的uplc-uv圖譜。

圖4遠志乙酸乙酯部位的uplc-uv圖譜。

圖5遠志正丁醇部位的uplc-uv圖譜。

圖6遠志萃取水部位的uplc-uv圖譜。

圖7遠志醇提物的uplc-uv圖譜。

圖8遠志水提物的uplc-uv圖譜。

圖9遠志部位b、e及陽性藥對ptp1b的抑制活性

具體實施方法

實施例1遠志各提取物及部位的製備

稱取一定量的遠志藥材，剪短至1-2cm，加入10倍的95％乙醇浸泡10-12h，加熱回流2h，重複浸泡2-3h、回流提取3次後合併提取液，過濾，將濾液減壓濃縮至無醇味，即得到醇提物；將過濾後的藥渣，加10倍水浸泡10-12h，加熱回流2h，重複浸泡2-3h、回流提取3次後合併提取液，過濾，減壓濃縮至流浸膏狀，得到水提物；將醇提物與水提物等體積混合，加入1.5倍體積的石油醚(沸點60℃-90℃)，萃取3次，收集合併萃取剩餘液體，在石油醚萃取後的剩餘液體中加入1.5倍體積的氯仿，萃取3次，收集、合併萃取剩液，回收溶劑，濃縮至浸膏，60℃真空乾燥，粉碎得部位b；在氯仿萃取後的剩餘液體中加入1.5倍體積的乙酸乙酯，萃取3次，收集、合併萃取剩餘液體，加入1.5倍體積的正丁醇，萃取3次，收集、合併萃取剩餘液體，回收溶劑，濃縮至浸膏，60℃真空乾燥，粉碎得部位e。

實施例2遠志各提取、分離部位的uplc-uv圖譜研究

對上述提取、分離的各部位進行uplc-uv研究，觀察各部位之間是否存在化學成分的差異。具體方法和結果如下：

1.色譜柱

acquityuplcbehc18，2.1mm×50mm，1.7μm。(廠家：美國waters公司)

2.色譜條件

乙腈(a)-0.1％乙酸溶液(b)為流動相進行梯度洗脫，採集時間：40min，洗脫梯度見表1；檢測波長：302nm；柱溫：40℃；流速：0.3ml·min-1；進樣量：2μl。

表1洗脫梯度表

3.結果

部位b在保留時間(tr)位於22-28min區域中的化學成分種類及含量明顯不同於其他部位，故推測此保留時間區域內的化合物為部位b抑制ptp1b活性的物質基礎。

實施例3遠志各提取物與部位的ptp1b抑制活性篩選

1.遠志提取物及各部位對ptp1b抑制活性測定原理

為了特異地檢測ptp1b的活性，我們採用對硝基苯磷酸鹽法，檢測純化後的ptp1b活性。原理基於一個顯色反應，對硝基苯磷酸二鈉鹽(pnpp)在ptp1b的催化作用下可分解成對硝基苯酚(pnp)和磷酸鹽，其中pnp顯黃色，在405nm處有強紫外吸收，由pnp[(ε＝1.78×104(mol-1·l·cm)-1)]的摩爾濃度可以確定在ptp1b催化下被分解的pnpp的量。

半數抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration，ic50)，是抑制酶活性至原活性1/2時抑制劑的濃度，可用以評判抑制劑對於酶的抑制能力，ic50越低，說明抑制酶活性至1/2所需抑制劑越少，抑制劑對酶的抑制能力越高。將不同濃度的抑制劑，加入至同一條件下的酶-底物反應體系中，將單位時間內產物的增加量，與相同條件下未加抑制劑的對照體系比較後，以抑制百分數為縱坐標，抑制劑濃度的對數值為橫坐標，作圖得到其相應的ic50值。

2.遠志提取物及各部位對ptp1b抑制活性測定

ptp1b的純化：lb固體培養基滅菌後，按照(100ml培養基：100μlcam：100μlamp)加入24mg/ml的cam和100mg/ml的amp。鋪板冷卻後，取0.5μl-1μl菌液於板上，塗布均勻後，用封口膜封好，倒扣置於37℃培養箱中培養過夜。挑取單個、大小合適的菌於已加入cam和amp的5ml已滅菌的液體培養基中，於37℃搖床上200rpm培養過夜。將5ml菌液全部轉移至500ml已滅菌的液體培養基中、滅菌後加入500μlcam、500μlamp，37℃於搖床200rpm培養，od值達到0.6-0.8時，按照每500ml培養基加250μl異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(itpg)的量加入iptg，置於37℃誘導4-5h，8000rpm離心10min，棄去上清，沉澱保存於-20℃。取1l培養基離心得到的菌體，加入50ml的提取緩衝液，重懸菌體，於冰浴上磁力攪拌30min，於50％的功率下超聲破碎8min(超聲破碎儀：scientzjy92-iin超聲波細胞破碎機)，取少量菌液加入0.1mol/l的pnpp，顯黃色則視為均勻。將上述破碎後菌液上至強鹼性陰離子交換樹脂柱(q柱)，掛柱1h，，用tris-hcl配製不同濃度的nacl洗脫液(0.05m、0.1m、0.15m、0.2m)，以流速1秒1滴進行梯度洗脫，用pnpp跟蹤活性，收集有效流分放入冰盒保存於4℃。將q柱所得組分用tris-hcl分別稀釋至0.05m，分別稀釋再合併，加入至強酸性陽離子交換樹脂柱(sp柱)，掛柱1h，用mes緩衝液配製不同濃度的nacl(0.05m、0.1m、0.15m、0.2m)進行梯度洗脫，收集pnpp顯示有活性的流分。

陽性藥(na3vo4，釩酸鈉)的配製：稱取0.1gna3vo4溶於蒸餾水，轉移至10ml的容量瓶，用蒸餾水定容，製成104μg/ml陽性藥溶液。

緩衝液的配製：稱取4.18gmops，2.92gnacl溶於800ml的蒸餾水中，用2mnaoh調節ph至7.2，轉移至1000ml的容量瓶中，用蒸餾水定容，臨用現配。

ptp1b酶溶液的配製：取前述配好的緩衝液和純化的ptp1b酶配成1ml緩衝液中含有7.36μlptp1b酶溶液

在96孔板中加入83μl前述配好的ptp1b酶溶液，加入遠志提取部位溶液10μl，在37℃下恆溫孵育30min，然後加入2μl的pnpp，於37℃恆溫孵育15min。加入5μl2m預冷的naoh終止反應，通過酶標液測量其在405nm處的紫外吸收強度。每份樣品進行3次平行實驗，每一提取部位進行隨行陽性藥對照。通過graphpadprism5.0軟體計算得到ic50值。

3.實驗分組

本實驗設置了遠志ct、wt、部位a、部位b、部位c、部位d、部位e等8個組，分別進行對ptp1b酶活性抑制作用的檢測。根據參考文獻，當ic50＜55.96±1.14μg/ml時，認為其對ptp1b有較強的抑制效果。

4.實驗結果

(1)釩酸鈉陽性藥的濃度設置為0.01，0.1，1，5，25，100μg/ml。釩酸鈉的抑制曲線見圖9-a，從抑制曲線可得，釩酸鈉的ic50為0.1845±0.01μg/ml。

(2)部位e的抑制曲線見圖9-c，其ic50為184.6μg/ml。從吸光度看，濃度為100μg/ml時才出現抑制作用，故認為該部位對ptp1b沒有較強的抑制作用。

(3)部位b的抑制曲線見圖9-b，其ic50值為1.213±0.3μg/ml，認為其對於ptp1b具有強抑制作用。