具有改善的藥物動力學特性的修飾嵌合多肽的製作方法

2023-08-08 22:47:26 1

專利名稱：具有改善的藥物動力學特性的修飾嵌合多肽的製作方法
具有改善的藥物動力學特性的〗務飾嵌合多肽
本申請是申請日為2000年5月23日，申請號為00811544.3，發明名 稱為"具有改善的藥物動力學特性的修飾嵌合多肽"的發明專利申請的分 案申請。
本申請要求申請日為1999年6月8日的美國臨時申請號60/138133 的優先權。在本申請中引用了各種文獻。這些文獻所披露的內容以其全文 形式收作本申請的參考。
簡介
本發明的領域是具有改善了的藥物動力學的修飾過的多肽。具體地 講，本發明的領域涉及為了改善其藥物動力學特徵而作過修飾的Fltl受體 多肽。本發明的領域還涉及製備和使用所述修飾過的多肽的方法，包括， 但不限於用這種修飾過的多肽減弱或抑制哺乳動物的血漿滲漏和/或血管 通透性。
背景
多肽配體結合細胞的能力，以及由此引起諸如細胞生長、存活、細胞 產物分泌或分化的表型反應通常是通過細胞上的跨膜受體介導的。所述受 體的胞外結構域(即展現在細胞表面上的受體部分)通常是該分子的最獨 特的部分，因為它能提供具有配體結合特徵的蛋白。配體和胞外結構域的 結合，通常會導致信號傳導，由此將一種生物學信號傳遞到胞內目標。通 常，這種信號傳導是通過催化性的胞內結構域起作用。這種催化性胞內結 構域的序列基序的特殊排列決定了它接觸潛在的激酶底物的能力
(Mohammadi等，1990,分子細胞生物學ll: 5068-5078; Fantl等， 1992，細胞69: 413-413)。通過催化性胞內結構域傳導信號的受體的例 子包括受體酪氨酸激酶(RTKs),如受體的Trk家族，它通常局限於神 經系統細胞，受體的細胞因子家族，包括三聯CNTF受體複合體
(Stahl&Yancopoulos, 1994,神經生物學雜誌25: 1454-1466)，它一般 也局限於神經系統的細胞，G-蛋白偶聯受體，如存在於心肌細胞上的p2-腎上腺素能受體，以及位於肥大細胞和嗜鹼性粒細胞的大部分上的多聚 IgE高親和力受體FcsRI (Sutton&Gould， 1993,自然366: 421-428 )。 到目前為止所鑑定的所有受體在配體結合之後似乎都要發生二聚化、 多聚化、或某些相關的構象變化(Schlessinger,丄，1988, TrendBiochem.Sci.13: 443-447; Ullrich&Schlessinger1990,細胞61: 203-212; Schlessinger& Ullrich, 1992， Neuron9:383-391 ),並且發生在二聚化分子 內結合域之間的分子間的相互作用會導致催化功能的激活。在某些場合 下，如血小板衍生的生長因子(PDGF),所述配體是與兩種受體分子結 合的二聚體(Hart等，1988,科學240: 1529-1531; Heldin， 1989，生物 學化學雜誌264: 8905-8912),而，舉例來說，對於表皮生長因子 (EGF)來說，所述配體是單聚體(Weber等，1984，生物學化學雜誌 259: 14631-14636 )。對於FcsRI受體來說，結合於FcsRI上的配體 IgE以單聚體形式存在，並且只有在抗原結合於IgE/Fc s RI複合體上之後 並與相鄰的IgE分子交聯之後才被激活(Sutton&Gould, 1993,自然 366: 421-428)。
通常， 一種特定受體在高等生物體內的組織分布提供了該受體的生物 學功能的線索。諸如成纖維細胞生長因子(FGF)的某些生長和分化因子 的RTKs是廣泛表達的，因此在組織生長和維持中似乎起著某種一般作 用。更常見的是，受體的TrkRTK家族的成員(Glass&YancopouIos，1993, 細胞生物學趨勢，3: 262-268)局限於神經系統細胞，而神經生長因子家 族包括神經生長因子(NGF)、腦衍生的神經營養因子(BDNF)、神經 營養蛋白-3 (NT-3)和神經營養蛋白-4/5 (NT-4/5)，它能結合TrkRTK 家族受體，促進大腦中和外周的各種神經原的分化(Lindsay, R.M, 1993，參見神經營養因子，S.E丄oughlin&丄H.Falkm著，257-284頁，San Diego, CA，學術出版社)。FcsRI局限於數量非常有限的類型的細胞， 如肥大細胞和嗜鹼性粒細胞。肥大細胞源於骨髓多能造血幹細胞系，但是 在離開血液之後在組織中完成其成熟(參見Janeway&Tmvers, 1996,免 疫生物學，第2版，M.Robertson&E丄awrence著，1: 3-1: 4頁，當代生 物學有限公司，倫敦，英國，出版人)，並且與過敏反應有關。
很多研究已經證實，受體的胞外結合域提供了特殊的配體結合特性。 另外，表達受體的細胞環境可能影響配體與受體結合時所表現出的生物學 反應。例如，當表達Trk受體的神經原細胞接觸神經營養蛋白時，該蛋白 能結合所述受體，導致神經原的存活和分化。當成纖維細胞表達相同的受 體時，接觸神經營養蛋白會導致成纖維細胞的增殖(Glass等，1991,細 胞66: 405-413)。
業已鑑定了 一種由細胞衍生的對血管內皮細胞具有選擇性的二聚體促 細胞分裂劑，並被命名為血管內皮細胞生長因子(VEGF)。業已從以下條件生長培養基中純化了 VEGF:大鼠神經膠質瘤細胞的條件生長培養基 [Conn等，1990, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 87: 2628-2632頁],和牛垂 體濾泡心形細胞的條件生長培養基[Ferrara和Henzd， 1989,生物化學生 物物理學研究通訊161: 851-858頁；Gozpadorowicz等，1989, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86: 7311-7315頁]和來自人U937細胞的條件 生長培養基[Connolly， D.T.等，1989，科學，246， 1309-1312頁]。VEGF 是表觀分子量為大約46kDa的二聚體，每一個亞基的表觀分子量大約 23kDa。 VEGF與血小板衍生的生長因子(PDGF)具有某些結構相似性， 後者是結締組織細胞的促細胞分裂劑，但不能促進來自大的血管的血管內 皮細胞的分裂。
被稱為Flt的膜結合酪氨酸激酶受體被證實為VEGF受體(DeVries, C.等，1992,科學，255, 989-991頁)。能特異性結合VEGF的Fit受體 能誘導細胞分裂。被稱為KDR的另一種形式的VEGF受體也能結合 VEGF並誘導細胞分裂。KDR的部分cDNA序列以及幾乎完整的蛋白序 列是眾所周知的[Terman, B.I.等，1991, Oncogene6， 1677-1683頁； Terman， B丄等，1992生物化學生物物理學研究通訊187, 1579-1586 頁]。
持續的血管形成可以導致或加重某些疾病，如牛皮癬、類風溼性關節 炎，血管瘤、血管纖維瘤、糖尿病性視網膜病和新生血管青光眼。VEGF 活性抑制劑可以用作所述疾病和其他VEGF誘導的病理性血管形成和血管 通透性症狀的治療劑，如胂瘤血管化。本發明涉及一種基於VEGF受體 Fltl的抑制劑。
血漿滲出是發炎的一個關鍵因素，它發生在一種特殊類型的微細血管 中。具體地講，在大多數器官中，血漿滲出特別發生在小靜脈中。與動脈 血管和毛細血管不同，小靜脈會因為各種炎性介體的出現而發生滲漏，所 述介體包括組胺、緩激肽和血清緊張素。發炎的一個特徵是血漿滲漏，它 是由於在小靜脈的內皮細胞中所形成的細胞間隙所導致的。大多數發炎實 -瞼衝莫型證實，所述細胞間隙出現在後毛細血管和集中小靜脈的內皮細胞之 間(Baluk， P.,等，美國病理學雜誌1998, 152: 1463-76)。業已證 實，某些凝集素可用於揭示發炎的小靜脈中內皮細胞邊界上的血漿滲漏、 內皮細胞間隙和指狀過程的集中部位(Thurston, G.等，美國生理學雜 志，1996， 271: H2547-62)。具體地講，業已將植物凝集素用於觀察諸如大鼠氣管的炎性'J、靜脈中的內皮細胞邊界處的形態學改變。諸如
conconavalinA和蓖麻毒蛋白的凝集素能局部結合發炎的小靜脈，發現了 由間隙所暴露的亞內皮細胞血管壁的部位，它相當於血漿滲漏部位 (Thurston, G.等，美國生理學雜誌，1996, 271: H2547-62)。
微細血管的特徵是動態的。例如，慢性炎性疾病與包括血管形成和微 細血管變大在內的微細血管再造相關。微細血管還可以通過獲得異常表型 特徵而再造。在慢性呼吸道炎症的鼠類模型上，呼吸道毛細血管獲得了小 靜脈的特徵，包括變寬了的血管直徑，增強了的對vonWillebrand因子的 免疫反應性，以及增強了的對P-選棒蛋白的免疫反應性。另外，所述再 造的血管在炎性介體的作用下會滲漏，而位於正常小鼠的呼吸道中的同一 部位的血管不會發生滲漏。
業已證實某些物質能夠減弱或抑制血管通透性和/或血管滲漏。例 如，mystixins是合成的多肽，業已報導它能抑制血漿滲漏而不會阻止內 皮間隙的形成(Baluk, P.等，丄Pharmacol.Exp.Ther., 1998， 284: 693-9)。另外，P2-腎上腺素能受體拮抗劑福莫特羅能通過抑制內皮細胞的 間隙形成減輕微細血管滲漏(Baluk, P.和McDonald, D.M.,美國生理學 雜誌1994, 266: L461匪8)。
血管形成蛋白和血管內皮細胞生長因子(VEGF)家族的成員被認為 是對血管內皮細胞具有很高專一性的僅有的生長因子。在小鼠上進行的定
向基因失活研究業已證實，VEGF是血管發育早期所必需的，Ang-l是血 管再造後期所需要的。
於2000年1月4日授予Metris治療劑有限公司的US6011003披露了 一種改變過的可溶形式的Flt多肽，這種多肽能夠與VEGF結合，並因此 產生對它的抑制作用，這種多肽包括5個或更少的完整的免疫球蛋白結合 域。於1998年1月27日授權並轉讓給Merck&Co.的US5712380披露了 血管內皮細胞生長因子(VEGF)抑制劑，該抑制劑是天然存在的或者通 過重組方法工程改造成可溶形式，有或者沒有VEGF受體的C-末端跨膜 區。
同樣轉讓給Merck&Co.的還有1998年4月2日公開的PCT公開號 WO98/13071,該申請披露了抑制原發性腫瘤生長和轉移的基因治療方 法，該方法是通過基因轉移轉入編碼能結合VEGF的可溶性受體蛋白的核 普酸序列而實現的。於1997年11月27日公開的以Genentech公司的名義申請的PCT公 開號W097/44453披露了新型嵌合VEGF受體蛋白，該蛋白包括源於血管 內皮生長因子(VEGF)受體Fltl和KDR的胺基酸序列，包括人KDR受 體FLK1的鼠類同源物，其中，所述嵌合VEGF受體蛋白結合於VEGF 上，並拮抗內皮細胞增殖及其血管形成活性。
於1997年4月17日公開的以ToaGosei有限公司的名義申請的PCT
發明者G·D·巖科波洛斯, N·J·帕帕多波洛斯, S·達維斯 申請人:裡珍納龍藥品有限公司