甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFP1基因序列的製作方法

2023-08-08 22:56:41

專利名稱：甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFP1基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學中的基因領域，特別是關於甘蔗水分脅迫 相關的鋅指蛋白基因序列。
背景技術：
甘蔗是我國最重要的糖料作物，甘蔗糖佔我國食糖總量的90% 以上，同時甘蔗也是一種重要的能源植物。但我國甘蔗生產的立地條 件差，旱地蔗面積佔全國植蔗面積的85%以上，因此乾旱是我國甘蔗 生產上長期存在的主要的非生物脅迫因素，並嚴重影響甘蔗的產量和 品質。克隆與表達甘蔗乾旱脅迫相關的某些基因，已經成為當前研究 熱點之一。
乾旱會導致植物失水而引發滲透勢的變化，引起滲透脅迫。植物 感受乾旱後，脅迫信號經歷一系列傳遞過程，最後誘導特定功能基因 的表達，在生理生化上作出調節反應。研究表明，轉錄因子在抗旱基 因表達調控中起著重要的作用。其中鋅指蛋白是一類在真核細胞中普 遍存在，作為基因轉錄因子參與細胞內基因表達調控的核酸結合蛋白 質，是真核細胞基因調控中起關鍵作用的一類調控因子。目前，人們 已經從擬南芥、矮牽牛、水稻、大豆、棉花等植物中克隆了許多編碼
鋅指蛋白的基因，並對其結構及功能進行了研究；利用轉基因技術， 也將一些與逆境脅迫相關的鋅指蛋白基因在目標植物中過量表達後，
能對植物起到增強抗逆性的作用，說明鋅指蛋白在增強植物逆境抗性 方面有著廣闊的應用前景。因此，克隆甘蔗水分脅迫相關的鋅指蛋白 基因將有利於研究甘蔗鋅指蛋白基因在甘蔗抗旱反應中的作用，進而 為探討甘蔗抗旱發生機理及為甘蔗抗旱性遺傳改良的研究奠定基礎。

發明內容
本發明的目的是提供一種甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFPl基 因序列，是通過以近源物種水分脅迫相關鋅指蛋白基因的CDS序列 保守區設計簡併引物，並用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到甘 蔗水分脅迫相關鋅指蛋白基因的全長表達序列。其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO.l所述；它的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2 所述。
本發明的目的通過以下技術措施實現
1、總RNA的提取
甘庶莖節總RNA的提取採用Invitrogen公司的TRIzol試劑，試 驗步驟參照TRIzol試劑說明書。
2、 cDNA第一鏈的合成
採用Invitrogen公司的Superscript TM III反轉錄試劑盒進行反 轉錄合成cDNA第一鏈(方法見說明書)。
3、 引物設計與引物合成
從GenBank中下載近源物種(如玉米、水稻等)的水分脅迫相 關鋅指蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W軟體進行多序列比對， 確定保守區，根據保守區序列設計簡併引物，擴增片段大小約為
256bp。引物設計後交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。 引物序列為
ShZFP 1F: 5'-AGATGATAATGARGCAGGAGC國3' ShZFP 1 R: 5'-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC誦3'
4、鋅指蛋白基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用簡併引物進行PCR擴 增，所擴增的PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠 中純化回收目的產物。然後將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體 中，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。 經簡併引物PCR檢測後，將具有插入片段的質粒DNA交由上海生工 生物工程技術服務有限公司進行雙向測序。
根據己得到的cDNA片段序列設計特異性引物，利用cDNA末 端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)對目的 基因的3'和5'末端進行PCR擴增。
在此3，RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由 外側引物和接頭引物進行PCR反應，所得產物作為模板，利用內側 引物和接頭引物再進行PCR擴增。 基因外側引物5'-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3 ， 基因內側引物5' -ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3 ， 接頭引物5'-GGCCACGCGACTAGTAC-3，
在5'RACE中，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C) 尾後，以加尾後的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和OligodG
進行第一次PCR擴增，所得PCR產物再用內側引物和OligodG進行 第二次PCR擴增。
基因外側引物5，-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3 ，
基因內側引
;，-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3'
Oligo匿dG: 5，-GGGGGGGGGGGGGGGH隱3'
所得到的PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測 後，將PCR產物純化並克隆到pMD-18T載體中轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，挑取陽性克隆，交給上海生工生物工程技術服務有限 公司進行雙向測序，測序所得序列再與簡併引物擴增所得的序列利用 Clustal W軟體進行拼接。
5、對甘蔗鋅指蛋白基因的測定
將拼接結果用BLAST軟體進行同源性測定，來確定為甘蔗鋅指 蛋白基因序列。比對結果
formula see original document page 6
本發明的優點
乾旱是我國甘蔗生產上長期存在的主要的非生物脅迫因素，嚴重 影響甘蔗的產量和品質。培育豐產優質抗旱的甘蔗新品種、提高甘蔗
的水分利用效率是提高我國甘蔗糖業國際競爭力的核心技術。因此， 本基因的獲得，不僅為研究甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白基因在甘蔗抗 旱反應中的作用，進而為探討甘蔗抗旱發生機理奠定基礎，而且還將 為甘蔗抗旱遺傳改良提供參考。
具體實施方式
下面用實施例對本發明作進一步說明。
1、 總RNA的提取
取甘蔗莖節約O.lg於液氮中研磨成粉,加入lml Trizol進行勻漿， 按照試劑盒使用說明提取總RNA。
2、 cDNA第一鏈的合成
取甘蔗總RNA約5ug與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)lpL (10pmol/L)混合，7(TC加熱5min後，立即放置冰上，然後加入 5xbuffer 5jiL， 10mmol/L dNTP混合液2.5pL， Ribonuclease inhibitor 0.5pL， M-MLV反轉錄酶0.5)iL，反應體系為25pL。反應過程為42°C 60min， 70°C 15min，最後放入-80。C保存備用。
3、 引物設計與引物合成
從GenBank中下載近源物種(如玉米、水稻等)的鋅指蛋白同 源基因CDS序列，利用Clustal W軟體進行多序列比對，確定保守區， 根據保守區序列設計簡併引物，擴增片段大小約為256bp。引物設計 後交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
引物序列為
ShZFP 1F: 5'-AGATGATAATGARGCAGGAGC-3'
ShZFPlR: 5'-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC-3'
4、鋅指蛋白基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用保守引物進行PCR擴 增，反應體系為10xPCR反應緩衝液5|iL， 25mmol/L MgCl2 3(iL， 2.5mmol/L dNTP 2(iL， lOnmol/L引物ShZFPlF和ShZFPIR各2|iL， Taq酶1.25U，用PCR水將反應體系補充至50pL。反應條件為l個 循環，94。C變性2min; 30個循環，94。C變性45s， 56"C退火45s， 72°C 延伸45s; l個循環，72。C延伸7min; 4。C保溫。所擴增的PCR產物 用1.2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然後 將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5感 受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經酶切檢測後，將具有 插入片段的質粒DNA交上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙 向測序。
根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物，禾!J用cDNA末 端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)對目的 基因的3'和5'末端進行PCR擴增。
在3，RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由外 側引物和接頭引物進行PCR反應，所得產物稀釋100倍後，取lpL 作為模板，禾U用內側和接頭引物再進行PCR擴增。
反應體系為10xPCR反應緩衝液5pL， 25mmol/L MgCl2 3pL， 2.5mmol/LdNTP2jiL， 10nmol/L正反向引物各2|iL， Taq酶1.2U，用 PCR水將反應體系補充至50!iL。
反應條件為1個循環，94。C變性5min; 30個循環，94。C變性 45s， 57。C退火45s， 72。C延伸lmin; 1個循環，72。C延伸7min; 4°C 保溫。
基因外側引物5，-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3， 基因內側引物5'-ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3， 接頭引物5'-GGCCACGCGACTAGTAC-3， 在5'RACE中，利用末端轉移酶和dATP在cDNA末端加上poly (C)尾後，以加尾後的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和 OligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物取1 u L作為模板，再 利用內側引物和OligodG進行第二次PCR擴增。反應體系及反應條 件同3'RACE 。
基因夕卜偵U弓I物5 ，-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3 ， 基因內側引物5 ，-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3 ， Oligo-dG: 5，-GGGGGGGGGGGGGGGH-3， 所得到的PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測 後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌 DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆，交上海生工生物工程技術服務有 限公司進行雙向測序，測序所得序列再與保守區引物擴增所得的序列 利用Clustal W軟體進行拼接。
5、對甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白(ShZFPl)基因的測定 將拼接結果用BLAST軟體進行同源性測定，來確定為甘蔗鋅指 蛋白基因序列。比對結果Score E
Sequences pmduciKQ significant srigmierits:(Sits)ref!買P 00l:iD52:4.S,l量liypDtheticsl protein LOC5^215SZes脆vs
■.-30
gfei^AX14637-:uzinc finger pr-otein.〖Zes. mays.i >c|bl . i !,.9e-,7
306le-
-gfeiAAQS^334,113tre33—associst-e-d prote直n 8 fOrvzs sa.t;ivs Indi,,■30S3e--gl
ref!WP CI0i04.€lS€.lJOs02qrCii95^C！0Orvzs S2tiva (laponica cult..2354e--7〇
ref臺NP 001106260,1|巡14 [Ze經mays〗-11 AN復4『2ea. -5e--75
gbii:&ZCilSS7,lihypoUieticsl protein Osl 022889〖Oryzs sstivs...2e--€9
emb 1 ClkN6SS、3f'. i!hypotlietzcal protein ,V:itis vinifera! >erdb《CA-,-le-64
gfo〗ffl^34g54,1！unknown〖Poptiius t'richocsrpal >Qfe!MK9€387.i 1 ■,,2492e-■64
gt^ABX675S8， 11putstive imiltip!e stress—responsive zinc—finQ.e..,2447e--63
gb|ABK927〇2,11uriknown『Populus t;rictK3csir'pa242化-62
gb|ABK92973.ilunknown〖PopqIqs trictiocairpsl Xjbi. ;l 1 ...2384e-61
■2347e-€0
ei!ii|C4HS3374,l| bypotlietic^i proteinVit.is vinifer:a，3e-57
gfelAW(5gl35-11Sine finger, !0T復一type,' Zinc- finaer, A20—t;vpe f.""1石e-56
dbl^BI31S53,l霎zinc f.incjer protein『Camellia sinensis!21.4le-53
序列表
中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFPl基因序列
2
1
1008
RNA
甘蔗(&3Cc/Z(3rWW Oj^ C/W(37"MOT丄.)

3'UTp
(643) ... (1008)
5，UTp
(1)…(126)

CDS
(127) ... (642)
PolyA site
(984) ... (1008) 1
acgcggggcc gtttcgaagc ccgccgaatt ccctgcgatt cctctcccct cgcctcctcg 60 tcttccccta ggggatcgcc ggagaggaat cgcaaagagg gccgtctcat ccgagttaag 120
gaagcc atg gag cac aag gag act gga tgc cag gcc cct gag gga 165 Met Glu His Lys Glu Thr Gly Cys Gin Ala Pro Glu Gly 1 5 10
ccc ate ctt tgc ate aat aac tgc ggc ttc ttc gga age gca get 210 Pro lie Leu Cys lie Asn Asn Cys Gly Phe Phe Gly Ser Ala Ala 14 19 24
acc atg aac atg tgc tec aag tgc cac aag gag atg ata atg aag 255 Thr Met Asn Met Cys Ser Lys Cys His Lys Glu Met lie Met Lys 29 34 39
cag gag cag gcc aag ctg get gcc tec tct ate gac age ate gtc 300 Gin Glu Gin Ala Lys Leu Ala Ala Ser Ser lie Asp Ser lie Val 44 49 54
aat ggc aac gat get gtc atg gaa cca gtt gtt tct ggc aac aca 345 Asn Gly Asn Asp Ala Val Met Glu Pro Val Val Ser Gly Asn Thr 59 64 69
gtg gt3 3Ct gtt get C33 gtC g3g ttg C33 3tg gtg C3g 390
Val Val Thr Val Ala Gin Val Glu Leu Gin Thr Met Asn Val Gin 74 79 84
ccc act gat gtt gcg gga cct age gag ggg gcg gca gtg ate tec 435
Pro Thr Asp Val Ala Gly Pro Ser Glu Gly Ala Ala Val lie Ser 8994 99
aaa ggg aag gta ggg ccg aac egg tgc age act tgc agg aag agg 480
Lys Gly Lys Val Gly Pro Asn Arg Cys Ser Thr Cys Arg Lys Arg 104 109 114
gtt gga ctt aca gga ttc aac tgc egg tgt ggg aac ttg tat tgt 525
Val Gly Leu Thr Gly Phe Asn Cys Arg Cys Gly Asn Leu Tyr Cys
119 124 129
gca etc cac cgc tac tec gac aag cat gac tgc aag ttc gac tat 570 Ala Leu His ARG Tyr Ser Asp Lys His Asp Cys Lys Phe Asp Tyr 134 139 144
egg act get get agg gat gcc att gcc aag get aat cca gtg gtg 615 Arg Thr Ala Ala ARG Asp Ala lie Ala Lys Ala Asn Pro Val Val
149 154 159
aag gcg gac aaa etc gac aag ate tag ggtttcctac ggttggctca 662 Lys Ala Asp Hys Leu Asp Lys lie 164 169
aggaagattg caacctgtgg tacttcttca tcatgcggaa ttgctgcttt gcccatgcct 722
ttccctttca tgtttgctgc tacaatcttg ttcggcattg cagtgcgtgg tgcacacttc 782
cgcagcctgc ctcsagaatt cttctcgcct ctgcatctgg tcagttcasa tgatttgcat 842
gttggctatg ttgtgtaagc ttttatttat ggtcgtctcg etcagaeggt atttggcttc 902
gcatttagct agctatgtga tgtactattg tccctggtgt gttacactgc aaccagtaat 962
嗎taagctgc aactgtccgt caaaaaaa犯aa咖aaaaa a犯aaa 1008
2 171 PRT
甘庶(Sacc/zorw/w q^cz'warww丄.) 2
Met Glu His Lys Glu Thr Gly 1 6 Leu Cys lie Asn Asn Cys Gly 16 21 Asn Met Cys Ser Lys Cys His 31 36 Gin Ala Lys Leu Ala Ala Ser 46 51 Asn Asp Ala Val Met Glu Pro
12
Cys Gin Ala Pro Glu Gly Pro lie 12
Phe Phe Gly Ser Ala Ala Thr Met 27
Lys Glu Met lie Met Lys Gin Glu 42
Ser lie Asp Ser lie Val Asn Gly 57
Val Val Ser Gly Asn Thr Val Val
616672
ThrVal Ala Gin Val Glu Leu Gin Thr Met AsnValGin Pro Thr
768187
AspVal Ala Gly Pro Ser Glu Gly Ala Ala VallieSer Lys Gly
91恥102
LysVal Gly Pro Asn Arg Cys Ser Thr Cys Arg LysArg Val Gly
106111117
LeuThr Gly Phe Asn Cys Arg Cys Gly Asn LeuTyrCys Ala Leu
121126132
HisARG Tyr Ser Asp Lys His Asp Cys Lys PheAspTyr Arg Thr
136141147
AlaAla ARG Asp Ala lie Ala Lys Ala Asn ProValVal Lys Ala
151156162
AspLys Leu Asp Lys lie
166m
權利要求
1、一種甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFP1基因序列，其特徵在於其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、 一種甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFPl基因序列，其特徵 在於其胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
全文摘要
本發明公開了一種甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白ShZFP1基因序列，是以近源物種水分脅迫相關鋅指蛋白基因CDS序列的保守區設計簡併引物，從受乾旱處理的甘蔗組織中提取總RNA，用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到甘蔗受水脅迫相關的鋅指蛋白(ShZFP1)基因的全長表達序列。本發明為研究甘蔗水分脅迫相關鋅指蛋白基因在抗旱反應中的作用，進而為探討甘蔗抗旱發生機理及為甘蔗抗旱性遺傳改良的研究奠定基礎。
文檔編號C07K14/415GK101381729SQ20081010907
公開日2009年3月11日 申請日期2008年5月22日 優先權日2008年5月22日
發明者張樹珍, 楊本鵬, 蔡文偉, 萍 陳 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所