一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法
2023-08-09 08:37:21
一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法
【專利摘要】本發明提供一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，包括雞胚成纖維細胞的製備、病毒的培養、病毒滅活、疫苗乳化等步驟。與現有技術相比本發明採用了本土分離的禽呼腸孤病毒，免疫原性好，具有更高的保護率；本發明採用雞胚成纖維細胞取代利用雞胚絨毛尿囊膜接種方式繁殖禽呼腸孤病毒，節省了疫苗製備成本，各批間質量差異降低，產量大，病毒毒價和疫苗質量提高；本發明利用均質機對疫苗進行乳化，製備的疫苗為水包油包水型，相對於傳統的油包水劑型而言該疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本發明選用的佐劑在疫苗製備過程中無需要額外添加任何表面活性劑成分，製備的疫苗安全性好，避免了傳統油佐劑難以吸收造成的副作用。
【專利說明】一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及獸用疫苗【技術領域】，具體涉及一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法。
【背景技術】
[0002]禽呼腸孤病毒是雞病毒性關節炎和腱鞘炎的主要病原之一,屬於呼腸孤病毒科，呼腸孤病毒屬的一種。該毒株自1954年首次從患慢性呼吸道病的雞呼吸道分離得到以來，多種禽呼腸孤病毒分離株相繼被報導。隨著近年來相關研究的深入，已發現禽呼腸孤病毒可能導致除病毒性關節性和腱鞘炎外的其他病症，在患有呼吸道病、腸道病、心肝病損、藍翅病、肉雞矮小綜合症、暫時性消化系統紊亂等疾病的雞體內均分離到禽呼腸孤病毒。
[0003]禽呼腸孤病毒在世界範圍內均有分布，廣泛流行於雞、火雞中，其他禽類感染禽呼腸孤病毒的病例也有報導。由禽呼腸孤病毒導致的關節炎、腱鞘炎以及其他病症會造成雞的廢棄率高和生長抑制，飼料轉化率低等問題，因此禽呼腸孤病毒的流行往往造成巨大的經濟損失，尤其對於養雞場這種禽類集中的環境，如果禽呼腸孤病毒大規模爆發會形成難以控制的局面。
[0004]現有技術中，控制禽呼腸孤病毒發病的主要手段是接種滅活全病毒疫苗，通過免疫接種來控制典型的雞呼腸孤病毒感染，但目前滅活疫苗多為油包水型，注射時阻力大，不易吸收，並具有一定的毒副作用。因此有必要開發一種劑型更合理，更易吸收同時具有更好的免疫應答效應的疫苗產品。
【發明內容】
[0005]為克服現有技術的技術缺陷，本發明提供一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法。
[0006]為實現以上技術目的，本發明採用以下技術方案:
[0007]一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，包括以下步驟:
[0008]1)病毒的培養、收穫:取9-11日齡的SPF雞胚，製備原代雞胚成纖維細胞，以
2.5X 106-3.5X 106細胞量/mL的接種量將製備的細胞接種於含有8%(v/v)胎牛血清的M199培養基中，於37°C條件下搖瓶培養過夜；當細胞長滿培養基單層時，按細胞懸液
0.1-0.3%(v/v)的接種量向細胞懸液中接種毒價≥106 5TCID50/0.1mL的禽呼腸孤病毒，控制溫度在37°C繼續搖瓶培養60-84小時，收穫細胞培養物，反覆凍融3次，得到含上清液的細胞毒液；
[0009]2)病毒的滅活:將步驟2)得到的含上清液的細胞毒液置於滅菌容器內，根據病毒液體積加入甲醛溶液並調整甲醛終濃度至0.5-2%。(v/v)，充分搖勻毒液，在搖床上調整搖床轉速為180r/min於37°C條件下滅活12-48小時；
[0010]3)疫苗的製備:將滅活的病毒液以3500r/min離心20min，再經8層紗布過濾，棄去沉澱，用磷酸鹽緩衝液將滅活的病毒液做1.5-2倍(v/v)稀釋，並置於28-32°C水浴鍋中進行預熱至水浴鍋溫度，即為水相；取法國賽比克公司的montanide?iSA206VG型佐劑，充分混勻後置於28-32°C水浴鍋中預熱至水浴鍋溫度，即為油相；將上述預熱後的水相和油相按1:0.8-1:1.2 (w/w)比例混合,利用磁力攪拌裝置進行預混合Ih,然後採用ATS工業系統有限公司的AH100D型均質機調整二級閥壓力為20-30bar、一級閥壓力為400_500bar對該混合物乳化2-3次，即得到一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗。
[0011]上述方法中，步驟I)所述的細胞接種量優選為3X IO6細胞量/mL ;步驟I)所述的病毒接種量優選為細胞懸液的0.2%(v/v);步驟2)所述的甲醛終濃度優選為1%。(v/v);步驟3)所述的病毒液稀釋倍數優選為1.7倍(v/v);步驟3)所述的水相預熱溫度優選為31°C;步驟3)所述的油相預熱溫度優選為31°C ;步驟3)所述的水相與油相比例優選為l:l(w/w);步驟3)所述的均質機參數優選為二級閥壓力20bar、一級閥壓力450bar ;步驟3)所述的乳化次數優選為2次。
[0012]本發明的有益效果包括:採用了本土分離的禽呼腸孤病毒，免疫原性好，具有更高的保護率；本發明採用雞胚成纖維細胞取代利用雞胚絨毛尿囊膜接種方式繁殖禽呼腸孤病毒，節省了疫苗製備成本，各批間質量差異降低，產量大，病毒毒價和疫苗質量提高；本發明利用均質機對疫苗進行乳化，製備的疫苗為水包油包水型，相對於傳統的油包水劑型而言該疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本發明選用的佐劑在疫苗製備過程中無需要額外添加任何表面活性劑成分，製備的疫苗安全性好，避免了傳統油佐劑難以吸收造成的副作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為疫苗接種後產生抗體水平對比圖
【具體實施方式】
[0014]實施例1
[0015]1.1病毒的培養、收穫
[0016]取10日齡的SPF雞胚，製備原代雞胚成纖維細胞，以3X IO6細胞量/mL的接種量將製備的細胞接種於含有8%(v/v)胎牛血清的M199培養基中，於37°C條件下搖瓶培養過夜；當細胞長滿培養基單層時，按細胞懸液0.2%(v/v)的接種量向細胞懸液中接種毒價^ 106_5TCID5(i/0.1mL的禽呼腸孤病毒，控制溫度在37°C繼續搖瓶培養72小時，收穫細胞培養物，反覆凍融3次，得到含上清液的細胞毒液；
[0017]1.2病毒的滅活
[0018]將以上得到的含上清液的細胞毒液置於滅菌容器內，根據病毒液體積加入甲醛溶液並調整甲醛終濃度至1%。(V/V)，充分搖勻毒液，在搖床上調整搖床轉速為180r/min於37 °C條件下滅活16小時；
[0019]1.3疫苗的製備
[0020]將滅活的病毒液以3500r/min離心20min，再經8層紗布過濾，棄去沉澱，用磷酸鹽緩衝液將滅活的病毒液做1.7倍(v/v)稀釋，並置於31°C水浴鍋中進行預熱至31°C，即為水相；取法國賽比克公司的montanide?iSA206VG型佐劑，充分混勻後置於3i°c水浴鍋中預熱至31°C，即為油相；將上述預熱後的水相和油相按1:1 (w/w)比例混合，利用磁力攪拌裝置進行預混合lh，然後採用ATS工業系統有限公司的AH100D型均質機調整二級閥壓力為20bar、一級閥壓力為450bar對該混合物乳化2次，即得到一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗。
[0021]1.4禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗的質量檢測
[0022]取上述製得的禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗，進行如下檢測:
[0023]1.4.1外觀檢測
[0024]通過肉眼觀察發現疫苗為乳白色乳劑，合格。
[0025]1.4.2劑型檢測
[0026]取一清潔吸管，吸取少許疫苗滴於清潔冷水表面，液滴呈雲霧狀擴散，合格。
[0027]1.4.3離心穩定性檢測
[0028]取IOmL疫苗,3000r/min離心15min,不分層，析出約30uL水相,合格。
[0029]1.4.4粘度檢驗
[0030]用ImL吸管(下口的內徑1.2_，上口內徑2.7_)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其垂直自然流出，流出0.4mL所需的時間為4秒。同時採用Brookfield DVI粘度計檢測，該劑型疫苗粘度為28mPa.s，合格。
[0031]1.4.5粒徑檢測
[0032]用移液槍精確取乳液IOuL於測試杯中，加入290uL磷酸鹽緩衝液充分混勻，確保乳化顆粒良好分散，將測試杯放入粒度儀中測定，測定溫度設定為25°C，平均粒徑為280nm,合格。
[0033]1.5禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗安全檢驗
[0034]取上述製得的禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗，進行如下檢驗:
[0035]將疫苗分別進行I次超劑量(ImL)和單劑量重複接種(0.3mLX2)的安全試驗。觀察14天，試驗雞均無任何局部和全身不良反應，表明上述疫苗安全性良好.[0036]1.6禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗效力檢驗
[0037]用上述滅活後的病毒液再製備出油包水型疫苗，用於同製備出的禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗做效力比較。
[0038]1.6.1血清學方法檢驗
[0039]取3-4周齡SPF雞30隻，分為3組，每組10隻雞，第I組皮下或肌肉注射油包水型疫苗0.3mL，第2組注射水包油包水型疫苗，第3組注射磷酸鹽緩衝液作為對照，同樣條件下飼養，實驗條件見表1免疫後每周採集血清，利用美國IDEXX公司的禽呼腸孤病毒抗體檢測試劑盒(產品編號99-09264)對呼腸孤病毒特異性抗體進行檢測。
[0040]表1兩種不同劑型的禽呼腸孤病毒油乳劑滅活疫苗免疫劑量及分組
[0041]
【權利要求】
1.一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於包括以下步驟: O病毒的培養、收穫:取9-11日齡的SPF雞胚，製備原代雞胚成纖維細胞，以2.5X 106-3.5X 106細胞量/mL的接種量將製備的細胞接種於含有8%(v/v)胎牛血清的M199培養基中，於37°C條件下搖瓶培養過夜；當細胞長滿培養基單層時，按細胞懸液0.1-ο.3%(v/v)的接種量向細胞懸液中接種毒價106 5TCID50/0.1mL的禽呼腸孤病毒，控制溫度在37°C繼續搖瓶培養60-84小時，收穫細胞培養物，反覆凍融3次，得到含上清液的細胞毒液； 2)病毒的滅活:將步驟I)得到的含上清液的細胞毒液置於滅菌容器內，根據病毒液體積加入甲醛溶液並調整甲醛終濃度至0.5-2%。(v/v)，充分搖勻毒液，在搖床上調整搖床轉速為180r/min於37°C條件下滅活12-48小時； 3)疫苗的製備:將滅活的病毒液以3500r/min離心20min，再經8層紗布過濾，棄去沉澱，用磷酸鹽緩衝液將滅活的病毒液做1.5-2倍(v/v)稀釋，並置於28-32°C水浴鍋中進行預熱至水浴鍋溫度，即為水相；取疫苗佐劑，充分混勻後置於28-32°C水浴鍋中預熱至水浴鍋溫度，即為油相；將上述預熱後的水相和油相按1:0.8-1:1.2 (w/w)比例混合，利用磁力攪拌裝置進行預混合lh，然後採用均質機調整二級閥壓力為20-30bar、一級閥壓力為400-500bar對該混合物乳化2_3次，即得到一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗。
2.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟I)所述的細胞接種量為3 X IO6細胞量/mL。
3.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟I)所述的病毒接種量為細胞懸液的0.2%(v/v)。
4.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟2)所述的甲醛終濃度為1%。(v/v)。
5.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟3)所述的病毒液稀釋倍數為1.7倍(v/v)。
6.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟3)所述的水相預熱溫度為31°C。
7.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟3)所述的油相預熱溫度為31°C。
8.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟3)所述的水相與油相比例為1:1 (w/w)。
9.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟3)所述的均質機參數為二級閥壓力為20bar、一級閥壓力為450bar。
10.根據權利要求1所述的一種禽呼腸孤病毒水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟3)所述的乳化次數為2次。
【文檔編號】A61P31/14GK103479997SQ201310439029
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】張立霞, 康亞男, 王壽山, 毛雅元, 何召慶, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司