一種玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G315431的製作方法

2023-08-09 02:10:16 1

一種玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G315431的製作方法【專利摘要】本發明涉及植物基因工程【
技術領域：
】，提供了一個玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G315431，該啟動子能夠被玉米紋枯病菌YWK-196,水稻白葉枯病病菌及細菌性條斑病病菌激活；通過對啟動子截短驗證，確定了-1564bp至-1428bp和-1243bp至-1211bp這兩個區段為受病原菌誘導的關鍵區域，可以利用本發明啟動子構建植物表達載體，用於通過植物基因工程技術改善植物對各種病害的抗性。【專利說明】—種玉米病原菌誘導啟動子pGRMZM2G315431【
技術領域：
】[0001]本發明涉及植物基因工程【
技術領域：
】，提供了一個玉米病原菌誘導啟動子，該啟動子可用於通過植物基因工程技術改善植物抗病性和其他有益生產性狀。【
背景技術：
】[0002]由真菌、細菌、病毒以及線蟲引起的植物疾病為作物生產帶來巨大影響。植物擁有兩套不同的抗性機制:一是被動防禦機制，是指一些抗性相關的形態結構，如表皮和堅硬的細胞壁(BradyJD,FryS.Formationofd1-1sodityrosineandlossofisodityrosineinthecellwallsoftomatocell—suspensionculturestreatedwithfungalelicitorsorH2O2.PlantPhysioll997,115:87-92.)。另一個是主動防禦，主動防禦是抗性基因與病原菌識別並且互作引起的。病原物無毒基因(avr)編碼的激發子與寄主植物響應的抗病基因(R)編碼激發子的受體分子相互作用產生抗病反應。植物抗病防衛反應一般經歷信號識別、信號傳導、防衛基因表達三個環節。主動防禦中所有類型的抗病機制都要依靠防衛基因表達，抵抗的有效性取決於基因表達的時空特性。正是由於防衛基因的時空表達特性，其啟動子往往具有某些特殊的順式作用元件，人們可以利用防衛基因、尤其是其順式元件為基因工程改良提供有利的工具。植物中絕大部分抗病基因都編碼具有核苷酸結合位點以及亮氨酸重複的蛋白(NBS-LRR),(McHaleL,TanX,KoehlP,MichelmoreRff.PlantNBS-LRRproteins!adaptableguards.GenomeBiol2006,7:212.)。但是對於這類基因的啟動子研究還比較少。[0003]植物基因啟動子是重要的順式作用元件，是位於結構基因5』端上遊區的DNA序列，是轉錄調控的中心。從1983年第一株轉基因植物問世以來，啟動子一直是基因工程的研究熱點，選擇合適並有效表達的啟動子將為基因工程的研究奠定堅實的基礎。組織特異啟動子可以使外源基因的表達只發生在某些特定的器官或組織部位，並往往表現出發育調節特性；誘導型啟動子可以使外源基因對某些`信號產生響應，只在特殊信號刺激下表達。這些啟動子的最大優點是:它克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異性的持續、高效表達所造成的浪費，並且滿足某些需要外源基因特異表達的需求。組織特異性或誘導表達啟動子一直以來都是植物基因工程研究的重點和難點。[0004]目前，已經找到一些組織特異性或誘導表達啟動子，並發現其上存在的相應的順式因子，為後來的啟動子研究奠定了基礎。菸草的Sar8.2b基因受水楊酸(SA)誘導，在其啟動子上發現了幾個順式作用因子，包括as-Ι因子、GT21和Dof結合序列。SA誘導Sar8.2b基因表達可能存在於-728至_927bp和-197至_351bp的區域的順式因子中(SongF，GoodmanRM.CloningandidentificationofthepromoterofthetobaccoSar8.2bgene,ageneinvolvedinsystemicacquiredresistance.Gene2002,290:115-124.X玉米鹿糖合成酶I只在韌皮部細胞中表達(YangNS,RussellD.Maizesucrosesynthase-promoterdirectsphloemcellspecificexpressionofgusgeneintransgenictobaccoplants.ProcNatlAcadScil990,87:4144-4148.)。PsGNS2啟動子只在種子中特異表達(BuchnerP，RochatCjWuillemeS，BoutinJP.Characterizationofatissue-specificanddevelopmentalIyregulatedbeta-1,3-glucanasegeneinpea(Pisumsativum).PlantMolBiol2002，49:171-186.)。[0005]玉米是最重要的糧食作物之一，玉米紋枯病是由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)引起的真菌性病害，是我國玉米產區的主要病害之一。玉米抗病基因的克隆以及啟動子的分離可以使我們更好地了解寄主與病原菌的互作並為基因工程改良奠定基礎。因此如何利用玉米抗病基因的克隆以及啟動子的分離獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一。【
發明內容】[0006]本發明的發明人針對上述現有技術的情況，提供了一個玉米病原菌誘導啟動子，該啟動子能夠被水稻白葉枯病病菌黃單胞菌PX099，水稻細菌性條斑病病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196所激活，可見該啟動子對病菌的響應具有廣譜性。通過對該啟動子進行截短，確定了-1564bp至-1428bp和-1243bp至-1211bp為病原誘導關鍵區域。可以利用本發明啟動子構建成各種植物表達載體，用於通過植物基因工程技術改善植物品質和其他有益生產性狀。[0007]發明人首先提供了一個玉米病原菌誘導啟動子，命名為pGRMZM2G315431，該啟動子基因序列中含有如序列表SEQIDN0.1所不的DNA序列。[0008]該啟動子來源於玉米B73(Zeamays),是下述核苷酸序列之一:[0009]序列表中SEQIDN0.1所示的DNA序列或部分DNA序列。[0010]序列表中的SEQIDN0.1由2027個鹼基組成，自5』端第1834位鹼基為轉錄起始位點，記為+1。[0011]其中TATA框位於轉錄起始位點上遊-227至-221位鹼基，而CAAT框位於-260至-257位鹼基,這些元件在轉錄中是基本啟動子元件。[0012]自5』端第-1345位，-1072位，+11位，+27位，+66位鹼基為黃化誘導元件ACGTATERD1；自5』端第+6位鹼基為胚和胚乳特異表達元件CANBNNAPA；自5』端第-1795位，-1485位，-1219位，-646位鹼基為熱激蛋白基因表達元件CCAATB0X1；自5』端第-1743位，-1018位，-467位，-323位鹼基為銅離子誘導表達元件CUREC0RECR；自5』端第-1733位，-1665位，-1653位，-1519位，-1448位，-1427位，-1377位，-1223位，-1199位，-1088位，-914位，-875位鹼基為DNA結合蛋白基因表達元件D0FC0REZM;自5』端第-1678位，-1627位，-1608位，-1387位，-1358位，-1315位，-1250位，-1180位，-946位，-674位，-613位，-502位，+10位，+26位，+65位鹼基為貯藏蛋白基因表達元件EB0XBNNAPA；自5』端第+107位鹼基為增強子元件EECCRCAH1；自5』端第-452位鹼基為氮響應元件EMHVCH0RD；自5，端第-1424位，-1128位，-872位，-817位，-194位，-170位鹼基為光誘導元件GATAB0X；自5』端第-1811位，-1522位，-555位鹼基為病原菌和鹽離子誘導表達元件GT-1；自5』端第-1666位鹼基為GA誘導元件PYRMIDINEB0X0SRAMY1A;自5』端第-1804位，-1411位，-707位鹼基為水楊酸誘導元件WB0XATNPR1。GRMZM2G315431啟動子PGRMZM2G315431的序列分析結果表明GRMZM2G315431基因在水稻抗性和脅迫誘導過程中受複雜因素的調控。[0013]同時通過截短驗證,確定了病原誘導相關區段位於_1564bp至_1428bp和_1243bp至-1211bp，在確定了上述的病原誘導關鍵區域後，可以方便的與其他抗病相關基因通過基因工程改造來改善植物抗病性。[0014]除此之外，本發明的發明還提供了含有pGRMZM2G315431的重組載體，並命名為pC1391::pGRMZM2G3154310[0015]綜上所述，本發明的發明人在國際上首次提供了一個玉米病原菌誘導啟動子PGRMZM2G315431，水稻轉基因證明發現轉基因植株受到黃單胞菌PX099，水稻細菌性條斑病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196誘導後⑶S活性有顯著上升，說明pGRMZM2G315431含有相應的應答反應因子。PGRMZM2G315431在模式植物中的表達特徵表明其是一個病原相關的啟動子。PGRMZM2G315431的功能研究可為揭示GRMZM2G315431的表達調控機理以及具體功能打下基礎，還可應用於水稻抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。【專利附圖】【附圖說明】[0016]圖1.本發明所述啟動子轉化水稻中花植株受到黃單胞菌PX099、細菌性條斑病菌RS105誘導後GUS染色觀察結果灰度圖；[0017]圖2本發明所述啟動子轉化水稻中花植株受到黃單胞菌PX099、細菌性條斑病菌RS105誘導後⑶S定量檢測結果；[0018]其中H20為對照，接種24h後進行染色及定量檢測，結果發現接種4h後⑶S活性有明顯提高，隨後逐漸降低，說明該啟動子受到上述病原細菌的誘導；[0019]圖3.本發明所述啟動子轉化水稻中花植株受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導後GUS染色觀察結果灰度圖；[0020]圖4本發明所述啟動子轉化水稻中花植株受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導後GUS定量檢測結果；[0021]不接菌CK為對照，接種24h後進行⑶S染色及定量檢測，結果發現接種4h後⑶S活性有明顯提高，隨後逐漸降低，說明該啟動子受到上述病原真菌的誘導；[0022]圖5.為本發明實施例5所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時表達後受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導後GUS定量檢測結果；[0023]結果發現，接種24h後進行⑶S定量檢測，在截去-1833bp至_1427bp和_1428bp至-1004bp這兩個區段後，⑶S活性明顯減弱，說明與病原誘導相關的元件存在於這兩個區段；[0024]圖6.為本發明實施例7所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時表達後受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導後GUS定量檢測結果；[0025]結果發現，接種24h後進行⑶S定量檢測，在截去-1564bp至_1428bp和_1323bp至_1211bp這兩個區段後，⑶S活性明顯減弱，說明與病原誘導相關的元件存在於這個區段；[0026]圖7為本發明所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時表達後受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導後GFP螢光觀察結果灰度圖；[0027]結果發現，接種24h後進行螢光觀察，_1243bp至_1211bp能夠檢測到報告基因表達，其他區段沒有表達，說明與病原誘導相關元件位於_1243bp至-1211bp這個區域。【具體實施方式】[0028]以下實施例中進一步定義本發明，根據以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊註明外，本發明所採用的均為本領域現有技術；實施例1玉米GRMZM2G315431基因啟動子pGRMZM2G315431序列分析[0029]首先，根據資料庫中GRMZM2G315431基因序列信息，確定其起始密碼子ATG上遊2027bp的序列為其啟動子，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。[0030]用PLACE(HigoK,UgawaY,IwamotoM,KorenagaT.Plantcis-actingregulatoryDNA_elements(PLACE).NuclAcidsResl999,27:297-300.)軟體對玉米GRMZM2G315431的啟動子核苷酸序列(序列表中的SEQIDN0.1)進行序列分析。[0031]用上述軟體對GRMZM2G315431基因啟動子pGRMZM2G315431中的順式作用元件進行搜索、預測，結果該啟動子中含有眾多與已知真核生物的順式元件的同源序列。其中，將GRMZM2G315431cDNA序列的第一個鹼基定義為轉錄起始位點(記為+1)，即序列表中SEQIDN0.1自5』端的第1834位鹼基，其中TATA框位於轉錄起始位點上遊-227至-221位鹼基,而CAAT框位於-260至-257位鹼基,這些元件在轉錄中是基本啟動子元件。自5』端第-1345位，-1072位，+11位，+27位，+66位鹼基為黃化誘導元件ACGTATERD1(SimpsonSDjNakashimaK，NarusakaY，SekiMjShinozakiK,Yamaguch1-ShinozakiK.Twodifferentnovelcis-actingelementsoferdl，aclpAhomologousArabidopsisgenefunctionininductionbydehydration-stressanddark-1nducedsenescence.PlantJ2003,33:259-270.);自5』[0032]端第+6位鹼基為胚和胚乳特異表達元件CANBNNAPA(EllerstromM，StalbergK,EzcurraI，RaskL.Functionaldissectionofanapingenepromoter:1dentificationofpromoterelementsrequiredforembryoandendosperm-specifictranscription.PlantMolBiol1996，32:1019-1027.);自5』端第-1795位，-1485位，-1219位，-646位鹼基為熱激蛋白基因表達元件CCAATB0X1(RiepingMjSchofflF.Synergisticeffectofupstreamsequences,CCAATboxelements,andHSEsequencesforenhancedexpressionofchimaericheatshockgenesintransgenictobacc0.MolGenGenetl992，231:226-232.);自5，端第-1743位，-1018位，-467位，-323位鹼基為銅離子誘導表達元件CUREC0RECR(QuinnJMjMerchantS.Twocopper-responsiveelementsassociatedwiththechlamydomonasCyc6genefunctionastargetsfortranscriptionalactivators.PlantCelll995,7:623-628.)；自5』端第-1733位，-1665位，-1653位，-1519位，-1448位，-1427位，-1377位，-1223位，-1199位，-1088位，-914位，-875位鹼基為DNA結合蛋白基因表達元件D0FC0REZM(YanagisawaS.DoflandDof2transcriptionfactorsareassociatedwithexpressionofmultiplegenesinvolvedincarbonmetabolisminmaize.PlantJ2000，21:281-288.);自5』端第-1678位，-1627位，-1608位，-1387位，-1358位，-1315位，-1250位，-1180位，-946位，-674位，-613位，-502位，+10位，+26位，+65位減基為肥!藏蛋白基因表達兀件EBOXBNNAPA(StalbergK,EllerstomMjEzcurraI,AblovS，RaskL.DisruptionofanoverlappingE-box/ABREmotifabolishedhightranscriptionofthenapAstorage-proteinpromoterintransgenicBrassicanapusseeds.Plantal996，199:515-519.);自5，端第+107位減基為增強子兀y^EECCRCAHl(YoshiokaS，TaniguchiF，MiuraK，InoueT，YamanoTjFukuzawaH.ThenovelMybtranscriptionfactorLCRlregulatestheC02_responsivegeneCahljencodingaperiplasmiccarbonicanhydraseinChlamydomonasreinhardti1.PlantCell2004，16:1466-1477.);自5』端第-452位鹼基為氮響應元件EMHVCHORD(MullerM，KnudsenS.ThenitrogenresponseofabarleyC-hordeinpromoteriscontrolledbypositiveandnegativeregulationoftheGCMandendospermbox.PlantJ1993，4:343-355.);自5，端第-1424位，-1128位，-872位，-817位，-194位，-170位減基為光誘導兀件GATABOX(GilmartinPM,SarokinLjMemelinkJjChuaNH.Molecularlightswitchesforplantgenes.PlantCell1990，2:369-378.);自5』端第-1811位，-1522位，-555位鹼基為病原菌和鹽離子誘導表達元件GT-1(ParkHC，KimML,KangYHjJeonJMjYooJHjKimMCjParkCY，JeongJCjMoonBCjLeeJH，YoonHWjLeeSHjChungWSjLimCO，LeeSYjHongJCjChoMJ.Pathogen-andNaCl-1nducedexpressionoftheSCaM~4promoterismediatedinpartbyaGT-1boxthatinteractswithaGT-l-liketranscriptionfactor.PlantPhysiol2004,135:2150-2161.)；自5』端第-1666位鹼基為GA誘導元件PYRMIDINEB0X0SRAMY1A(MenaMjCejudoFJjIsabel-LamonedaI，CarboneroP.ArolefortheDOFtranscriptionfactorBPBFintheregulationofgibberelIin-responsivegenesinbarleyaleurone.PlantPhysiol2002,130:111-119.);自5，端第-1804位，-1411位，-707位鹼基為水楊酸誘導兀件WB0XATNPR1(ChenWjProvartNJjGlazebrookJjKatagiriF，ChangHS，EulgemTjMauchF，LuanS，ZouGjWhithamSAjBudworthPR，TaoY.ExpressionprofilematrixofArabidopsistranscriptionfactorgenessuggeststheirputativefunctionsinresponsetoenvironmentalstresses.PlantCell2002，14:559-574.)。[0033]GRMZM2G315431啟`動子pGRMZM2G315431的序列分析結果表明GRMZM2G315431基因在水稻抗性和脅迫誘導過程中受複雜因素的調控。[0034]表1GRMZM2G315431啟動子序列中的調控元件分析[0035]【權利要求】1.一種玉米病原誘導啟動子，其特徵在於:其基因序列如SEQIDN0.1所示。2.根據權利要求1所述的啟動子，其特徵在於:該啟動子可以被玉米紋枯病菌或水稻白葉枯病病菌或水稻細菌性條斑病病菌激活。3.權利要求1所述的啟動子在抗紋枯病、水稻白葉枯病和水稻細菌性條斑病抗性改良中的應用。`【文檔編號】A01H5/00GK103820457SQ201410104914【公開日】2014年5月28日申請日期:2014年3月20日優先權日:2014年3月20日【發明者】儲昭輝,丁新華,李寧申請人:山東農業大學