南瓜蛋白及其編碼基因的製作方法

2023-08-09 09:43:01 1

專利名稱：：南瓜蛋白及其編碼基因的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物化學領域，特別是涉及到生物化學中一種核糖體失活蛋白-一南瓜蛋白及其編碼基因與其在製備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒的藥物中的應用。
背景技術：
：從高等植物中提取的核糖體失活蛋白(Ribosome-InactivatingProtein,簡稱RIP)，核糖體失活蛋白是一類能使真核生物細胞的核糖體失活，從而抑制細胞內蛋白質合成的細胞毒素，其作用機制是具有RNAN-糖苷酶或叫多核苷酸"腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根據蛋白分子及其基因的結構，RIP可以分為3類，類型lRIP是具RNAN-糖苷酶活性的單肽鏈蛋白，例如，來自葫戶科植物栝樓塊根的天花粉蛋白(Trichosanthin，簡稱TCS)，白瀉根蛋白(Bryodin，簡稱BRY)，苦瓜種子的a，e-苦瓜蛋白(a，3-Momorcharin，簡稱MMA，MMB)和絲瓜種子的絲瓜蛋白a，b(Luffina,b簡稱LUA，LUB)。類型2RIP是雙肽鏈蛋白，例如，來自大戟科植物蓖麻種子的蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思樹種子的相思子毒素(Abrin)，它是由一條具有RNAN-糖苷酶活性的A鏈和一條具凝集素活性的B鏈通過二硫鍵連接而成的。類型3RIP是一類茉莉酮誘導的蛋白(jasmonate-inducedprotein),它是由具有RNAN-糖苷酶功能的N端結構域和一個未知功能的C端結構域組成，例如來自大麥的JIP60。從葫蘆科植物中分離出來的類型l核糖體失活蛋白，例如天花粉蛋白、苦瓜蛋白、絲瓜蛋白、白瀉根蛋白等，均具有抗腫瘤,抗病毒活性，特別是抗愛滋病毒活性。中國南瓜(Cucurbitamoschata(Duch.)Poiret)是葫蘆科植物南瓜屬的一個種，CN1263107提供了從中國南瓜瓜瓤中分離出的類型1核糖體失活蛋白——南瓜蛋白(Cucurmosin，簡稱CUS)，並公開了它的製備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為27kDa.CN1603340提供了南瓜蛋白的糖苷酶活性和抗腫瘤活性。CN1603339提供了南瓜蛋白N端27個胺基酸順序。Barbieri等(BarbieriL，PolitoL，BolognesiA,etal.RJbosome國inactivatingproteinsinedibleplantsandpurificationandcharacterizationofanewribosome-inactivatingproteinfromCucurbitamoschata[J]BiochimicaetBiophysicaActa(2006)，1760783—792)提供了從中國南瓜瓜瓤中提取一種新的RIP:C.moschataRIP，它的分子量為30665Da，並測定了它的N端30個胺基酸順序。Xia等人(XiaHC,LiF,LiZ，etal.PurificationandcharacterizationofMoschatin,anoveltypeIribosomeinactivatingproteinfromthematureseedsofpumpkin(Cucurbitamoschata),andpreparationofitsimmunotoxinagainsthumanmelanomacells[J]CellResearch(2003)13:369-374)從中國南瓜子中提取出moschatin,它的分子量為29kDa，並測定了它的N端10個胺基酸順序。陳明晃等人報導了南瓜蛋白的初步結晶學研究(ChenMH，YeXM，CaiJH，etal.Crystallizationandpreliminarycrystallographicstudyofcucurmosin,aribosome-inactivatingproteinfromthesarcocarpofCucurbitamoschata[J]ActaCryst.Biol.Cryst.2000,D-56665-666)石小莉等報導了南瓜蛋白與天花粉蛋白結構的同源性(石小莉，陳明晃，陳荔清等，MolecularReplacementStudiesofCucurmosinfromCucurbitaMoschataStructureHomologywithTrichosanthin.[J]ChineseJ.Structure.Chem.200322165-168).陳明晃等報導了南瓜蛋白結構功能初步研究及製備免疫毒素用於治療腫瘤細胞(ChenMH，ShiXL,YeXM，etal;Structure-functionstudiesofCucurmosin,aribosome—inactivatingproteinfromsarcocarpofCucurbitamoschata，[J].Toxicology200319148).謝捷明等人報導了南瓜蛋白對黑色素瘤B16細胞的誘導分化作用(謝捷明，許建華，陳明晃，等.南瓜蛋白對B16細胞的誘導分化作用(簡報)[J]，福建醫科大學學報.2004，38(4)393-398;謝捷明，俞昌喜，陳明晃，等.南瓜蛋白對B16細胞的誘導分化作用[J].中國藥理學報，2006，22(3)，329_332)。陳明晃等報導了南瓜蛋白的抗腫瘤活性(陳明晃，謝捷明，王梓壬，南瓜核糖體失活蛋白的生物學活性及其結果[J]毒理學雜誌2005，19(3)增刊，274)上述專利和文獻表明，提取自南瓜屬植物中國南瓜的核糖體失活蛋白一南瓜蛋白，是類型1核糖體失活蛋白，具有抗腫瘤，抗病毒作用等多種生物學功能，尤其南瓜蛋白具有較強的抗腫瘤活性，並首次報導了南瓜蛋白的誘導腫瘤細胞分化的作用，促使我們進一步了解南瓜蛋白的一級結構和空間結構及其基因，闡明南瓜蛋白的結構與功能，研究基因的表達、調控，開展蛋白質工程和基因工程，並為獲得藥用蛋白質或製備免疫毒素提供基礎知識。
發明內容本發明的目的是基於上述現有技術基礎，提供一種核糖體失活蛋白一南瓜蛋白的成熟蛋白的全長胺基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。通過一級結構比較分析和晶體結構(三級結構)的分析，為製備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病病毒的藥物和製備免疫毒素提供關鍵技術。本發明提純了南瓜蛋白，並在生物質譜儀上測定了它的精確分子量為28228Da(ESI-MS)，或28169Da(MALDI-TOF-MS測定)。本發明從中國南瓜種子發芽後長出來的第一片真葉，按天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒說明書上操作要求，提取南瓜總的DNA。本發明根據南瓜蛋白的N端胺基酸順序(NVRFDLS)設計寡核苷酸上遊引物(5'-AATGTTAGGTTCGATTTGTC-3')，並根據南瓜蛋白的晶體學判斷C端胺基酸順序(VVTQNIQLLLNIGATA)設計寡核苷酸的下遊引物(5'-TTGGATGTT[T/C]TGGGTTACAAC-3')。PCR擴增反應程序為首先模板94°〇變性2111讓，然後進行35個循環包括94"C變性50s，47""C退火45s，72'C延伸lmin20s，最後再延伸10min結束PCR反應。按照《精編分子生物學試驗指南》(北京科學出版社，1998)中的操作說明進行瓊脂糖凝膠電泳及DAN片段回收.測序公司測定核苷酸順序.上述方法獲得的南瓜蛋白全長DNA基因序列，見序列表SEQIDNo:2。結合南瓜蛋白全長DNA基因順序所推斷出的胺基酸順序、南瓜蛋白的晶體學研究判斷出來的C端順序，獲及了南瓜蛋白的成熟蛋白的全長胺基酸序列，見序列表SEQIDNo:l。將南瓜蛋白全長胺基酸序列與已報導的幾種具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒活性的類型l核糖體失活蛋白進行同源性比較，其中與MMB(SwissPort蛋白資料庫登陸號為P29339gil32581)相比較，相同的胺基酸殘基佔63%，相似的胺基酸殘基佔79%，與TCS(登陸號為P132599,gil32599)相比較，相同的佔62%，相似的佔76%，與BRY(登陸號為P33185,gil2644214)相比較，相同的佔60%,相似的佔75%，與MMA(登陸號為:P誦4，gil32578)相比較，相同的佔59%,相似的佔73%，與LUA(登陸號為Q00465,gil32590)相比較，相同的佔58%，相似的佔75%。並且這6種蛋白一起比較，同一位置6種蛋白都相同的殘基共95個，佔38%見附圖。晶體學研究表明，組成蛋白活性中心位點的胺基酸殘基為Tyr(Y)70'Tyr(Y)111，Glu(E)160，Arg(R)163(標記胺基酸殘基的數字以TCS為標準)，並且其周圍的胺基酸殘基都是相同的，這就從蛋白質一級結構和晶體結構(三級結構)上闡明了南瓜蛋白具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒活性，並為蛋白質的改造和構造免疫毒素提供了關鍵技術。同時，這幾種RIP各自所具有不同的胺基酸殘基，及其在不同位置所帶(或不帶)的不同數量的糖基，構成了各自不同的分子表面電荷基團和抗原決定簇，這就為南瓜蛋白的結構和功能研究提供了技術平臺。尤其是南瓜蛋白具有對腫瘤細胞誘導分化作用，本發明提供了重要的結構信息。與現有技術相比，本發明具有以下積極效果1、本發明提供了南瓜蛋白的成熟蛋白的全長胺基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。2、本發明提供了南瓜蛋白在製備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒的藥物中的應用。3、本發明所提供的方法與傳統的cDNA測序方法相比更快速、方便。南瓜蛋白(CUS)245個胺基酸序列與天花粉蛋白(TCS)、白瀉根蛋白(BRY)，a，卩-苦瓜蛋白(MMA，MMB)和絲瓜蛋白a(LUA)胺基酸順序比較，其中6個蛋白胺基酸殘基都一樣的以陰影標出。具體實施例方式實施例l:南瓜蛋白(Cucurmosin，簡稱CUS)的胺基酸順序測定a、引物設計在對已知葫蘆科植物核糖體失活蛋白系統比較的基礎上，選取上下遊高度保守的胺基酸序列和核苷酸順序及其密碼子的偏愛性設計引物，為了提高PCR正確性及其得率儘量避免使用簡併引物(同時設計多條引物進行篩選)，其中正確的引物如下上遊引物，5，-AATGTTAGGTTCGATTTGTC-3，下遊引物，5'-TTGGATGTT[T/C]TGGGTTACAAC-3,b、總DNA的提取試劑天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒液氮、(3-巰基乙醇、氯仿、無水乙醇取自己培育的南瓜苗第一片真葉100mg置於預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀加到離心管中，按照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取南瓜蛋白的基因組DNA。c、PCR擴增反應體系為超純水39.3plIOXPCR緩衝液(含15mMMg+)5^1d證s(2.5mM)化l上遊引物(IOO一)0.2pl下遊引物(100一)0.2^1總醒1^1PfuDNA聚合酶(250U)0.3pl總體積50^1反應程序為首先模板94。C變性2min，然後進行35個循環包括94。C變性50s,47。C退火45s，72。C延伸lmin20s，最後再延伸10min結束PCR反應。d、瓊脂糖凝膠電泳及DAN片段回收按照《精編分子生物學試驗指南》(北京科學出版社，1998)中的操作說明進行。e、測序公司測定核苷酸順序，由此推斷南瓜蛋白的胺基酸順序。序列表〈110〉中國科學院福建物質結構研究所福建醫科大學〈120〉南瓜蛋白及其編碼基因〈160〉2〈170〉PatentlnVersion2.1〈210〉1〈211〉245〈212〉PRT〈213〉葫戸科植物南瓜屬中國南瓜種(Cucurbitamoschata)〈400〉tableseeoriginaldocumentpage9130135140AlaAlaSerAlaLeuLeuValLeulieGinThrThrSerGluAlaAla145150155160ArgPheArgTyrlieGluLeuGinlieAlaAsnAsnValGlyThrLys165170175PheLysProSerGinThrlielieSerLeuGluAsnAsnTrpSerAla180185190LeuSerLysGinlieGinlieAlaLysAsnLysAsnGlyGinPheGlu195200205ThrProVallieLeulieAspProGinGlyAsnArgValGinlieThr210215220AsnValThrSerAsnValValThrGinAsnlieGinLeuLeuLeuAsn225230235240lieGlyAlaThrAla245〈210〉2〈211〉690〈212〉隨〈213〉葫戸科植物南瓜屬中國南瓜種(Cucurbitamoschata)〈400〉1gatttgtccagtgccacaagctcatcttacaaaacttttataaaaaatttgagggaagca60cttccaaaggatgggaaagtgtatgacattcctgtgttactttcgactgtaatggactcg120aggcgcttcatactaatagatctcgtcaattacgacggtcaatccatcacagctgccata180tacEtcaggta3tt3cgagaaccttceia^ctgctgc333aa3gct朋g3gsaa^catcgag360cttggactcccagctctagacagtgccattaccaccttgtttcattacaacgccgaggct420gctgcttcagcgctgctcgttctcattcaaacgacctctgaagctgcaaggtttagatat480agcttggaaaacaactggtctgcgctctccaa^caaatccaaattgccaag肪caaaaat600gggcaatttgaaactccagttatccttatagaccctcaaggaaatcgtgttcaaataaca660aacgtgacttcgaacgttgtaacccaaaac690權利要求1.一種從中國南瓜中提取的核糖體失活蛋白-南瓜蛋白，其特徵在於，具有序列表中的SEQIDNo1胺基酸殘基序列的蛋白質。2.編碼權力要求1所述的南瓜蛋白的基因，其特徵在於，具有序列表中的SEQIDNo:2核苷酸序列的基因。3.根據權力要求1的一種南瓜蛋白，其特徵在於，該蛋白作為製備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒藥物的應用。全文摘要南瓜蛋白及其編碼基因涉及生物化學領域。本發明公開了從中國南瓜(Cucurbitamoschata)瓜瓤中提取的一種核糖體失活蛋白--南瓜蛋白cucurmosin的成熟蛋白的胺基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。一級結構和晶體結構分析表明它是類型1核糖體失活蛋白，具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒作用，為獲得藥用蛋白質或製備免疫毒素提供關鍵技術。文檔編號C07K14/415GK101215327SQ20071000840公開日2008年7月9日申請日期2007年1月4日優先權日2007年1月4日發明者侯曉敏,盈許,謝捷明,陳明晃申請人:中國科學院福建物質結構研究所;福建醫科大學