一種基於螢光通用引物的多重定量rt-pcr基因表達譜分析方法

2023-07-26 18:25:41 1

專利名稱：：一種基於螢光通用引物的多重定量rt-pcr基因表達譜分析方法
技術領域：
：本發明涉及涉及生物技術基因表達分析領域，具體涉及一種基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法。
背景技術：
：隨著現代分子生物學技術和相關檢測儀器的發展，基因表達譜分析也迅速發展起來。基因表達譜分析在分析基因功能，確定轉錄調控途徑，闡明信號傳導或代謝通路，研究表達水平多態性等方面中都發揮著至關重要的作用，並為分子藥物、疾病診斷和治療領域提供了幫助。人類複雜性狀疾病的研究和相關基因的定位是當前的研究熱點。糖尿病、癌症、早老性痴呆和精神分裂症等疾病的遺傳機理和相關效應基因仍不為人知。通過全基因組轉錄圖譜來查找候選基因(candidategenes)是複雜性疾病研究的第一步，也對進一步理解人類複雜性疾病和分子藥物的研發提供了幫助。轉錄圖譜也被用於癌症診斷和療效比較等臨床分析中。基因表達譜可以用於腫瘤分類，進一步研究發現大約30個基因的表達情況可用來預測腫瘤對化學治療藥劑的生物反應狀況。全基因組表達晶片(Genome-widemicroarrays)能成功的從各種反應條件下篩選出差異表達的基因，這些基因也被作為候選基因進行假設驗證和功能分析。晶片技術的優勢是通量大，一次實驗所能檢測的基因量很大，樣本量也較多，但同時也存在著明顯的劣勢就是晶片的定量準確度較低，並且實驗成本很高，只能在經濟實力雄厚的實驗室推廣。基因表達分析中最常用的技術就是實時逆轉錄定量PCR(real-timeqPCR)，它具有Northernblots等技術所不具有的定量分析能力，因此被廣泛的用於基因表達定量分析中。Real-timeqPCR技術被證明具有穩定性好、靈敏度高和7個數量級的定量線性等優勢，但同時它也具有檢測通量小、樣本處理費時費力成本高等缺點。有研究表明人類細胞大約還含有3萬個基因，每個細胞平均有大約1萬個基因參加表達，而10到50個基因表達和一種特定的疾病相關，10到50個基因和一個特定的通路和藥物反應相關。考慮到多基因性狀(multigenictraits)受到基因-環境的相互作用影響，發現它們的生物學基礎需要在不同的環境條件下處理大量的樣本，需要針對對適量的基因在適量的個體或樣本中進行分析，因此一種中通量的基因表達分析方法亟待開發。這種基因表達譜檢測平臺能解決基因表達中高通量與低成本的瓶頸，一種對於定量的、高通量的、經濟的基因表達分析簡單最佳的多重解決方案。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種定量通量高(10-30個基因/反應)、成本低、樣本需要量低、檢測靈敏性高的多基因表達分析方法。本發明針對11個目的基因和3個看家基因設計了螢光通用引物和嵌合特異引物。通用引物的長度為20bp，上遊通用引物5'端用Fam螢光標記，通用引物對小鼠基因組特異。嵌合特異引物長度為38bp，3，端為特異引物序列段(18bp)，5，端為通用引物序列段(20bp)。設計的特異引物段要求理論退火溫度均為55t:，並且有相似的GC含量。擴增產物的長度在100400bp間，相鄰產物長度差為57bp。本發明的方法有兩種優化方案1.單序列螢光通用引物方案；設計單序列螢光通用引物，使通用引物的上下遊序列採用同一序列。這樣可以減少通用引物的引物二聚體對擴增反應影響，提高通用引物的擴增效率。2丄遊嵌合特異引物降落式(Touchdown)PCR結合螢光通用引物補加方案。在PCR反應過程前期加入一個上遊嵌合特異引物的降落式(Touchdown)PCR過程，使各個目的基因的上遊嵌合特異引物能最佳退火，同時通用引物的補加也能克服擴增反應初期的通用引物二聚體影響，提高了反應效率。本發明提供的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於包括下列步驟(1)通用引物及上下遊嵌合特異引物的引物序列設計通用引物的長度為20bp，上遊通用引物5'端用Fam螢光標記，通用引物對小鼠基因組無非特異性匹配。針對11個目的基因和3個看家基因設計嵌合特異引物長度為38bp，3'端為特異引物序列段(18bp)，5，端為通用引物序列段(20bp)(2)多重RT-PCR反應過程a逆轉錄反應階段，利用下遊嵌合特異引物(chimericreverseprimer，3，端為一段基因特異序列，5'端為一段通用引物序列)逆轉錄合成目的基因的cDNA第一鏈；bPCR反應過程，前3個循環，上遊嵌合特異引物將通用引物序列加到目的基因DNA片段的兩端；PCR反應的餘下循環，高濃度的螢光通用引物取代上遊嵌合特異引物完成整個PCR反應過程；c根據螢光標記的PCR產物長度的不同，用ABI377測序儀凝膠電泳予以分析檢測。步驟1中所述的通用引物設計上採用上下遊同一序列作為通用引物序列。步驟2中所述的PCR反應過程，前期加入一個上遊嵌合特異引物的降落式(Touchdown)PCR過程，為11個循環。本發明結合了終點PCR法(end-pointPCR)和螢光檢測法(fluorescentdetection),將多對嵌合特異引物的PCR反應轉變為一對通用引物的PCR反應大大降低了PCR反應的複雜性，並且所有待擴目的基因片段也在一對通用引物的作用下被等效率擴增、比例的放大，從而實現多重定量檢測。本發明適用於10-30個基因/反應的研究特定藥物代謝途徑或信號傳導通路等特定候選基因表達分析，是一種對於定量的、高通量的、經濟的基因表達分析簡單最佳的多重解決方案。圖l為本發明的原理示意圖，圖中以一個目的基因模板表示(A)為利用下遊嵌合特異引物的逆轉轉錄反應；(B)為逆轉錄反應生成的目的基因cDNA單鏈；(C)為PCR反應的前三個循環，由上遊嵌合特異引物引導，將通用引物序列加到cDNA模板兩端；(D)為PCR反應餘下循環，由通用螢光引物取代嵌合引物完成擴增；(E)為螢光標記的PCR產物通過ABIPrism377型核酸分析儀予以分析檢測。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例11.通用引物及上下遊嵌合特異引物的引物序列設計試驗步驟(l)通用引物的設計根據GenBank資料庫的水稻序列信息，設計了兩條20bp長的序列作為通用引物。設計原則是保證該引物在小鼠基因組上進行PCR反應無產物條帶，避免通用引物帶來非特異產物。通用引物的理論退火溫度控制在55°C。上遊通用引物5'端用Fam螢光標記。通用引物序列為Fam-cgggctacgctatctacgac(上遊)與cgggcagtaagtaccgttgt(下遊)。(2)上下遊嵌合特異引物的設計根據GenBank資料庫的11個小鼠目的基因和3個看家基因的cDNA序列信息，設計了14對18bp長的序列作為嵌合特異引物3，端的特異引物序列段。設計的特異引物段要求理論退火溫度均為55。C，並且有相似的GC含量，設計完後在5'端加上通用弓I物序列。擴增產物的長度控制在100400bp間，相鄰產物長度差為57bp。目的基因和看家基因的嵌合特異引物的序列為:tableseeoriginaldocumentpage8(3)所有引物儘量選擇在mRNA特異的序列上設計，並經Blast和Oligomaster軟體分析減少非特異擴增和引物二聚體對反應的影響。2.樣本RNA的製備試驗步驟(1)總RNA抽提採用TRIzol法。微量分光光度儀(U-008OD,HITACHI)控制抽提RNA的OD26固o在1.7~2.0間，濃度調整到1嗎/pL。(2)用DNaseI(Invitrogen)消化TRIzol抽提的總RNA中混有的少量DNA汙染。DNaseI消化反應體系為RNA1^L、10xReactionBuffer1|_iL、DNaseI(1U/pL)1pL，補水至10pL。反應過程為20°C15min，然後加1EDTA(25mM)，65°C10min使DnaseI失活。反應後的RNA濃度是100ng;L。3.多重RT-PCR反應及產物檢測分析試驗步驟(1)逆轉錄反應體系為5xReactionBuffer4pL、MgCl2(25mM)4.8pL、dNTPMix(2mM)ljxL、ImProm-IIReverseTranscriptase(Promega)lpL、下遊嵌合引物(總濃度10pM)2pL、RNAtemplate(100ng/pL)2~3|iL，補水至20pL。反應過程為25。C5min，42。C60min，70。C15min。(2)PCR反應體系為PCRBuffer10xlpL、MgCl2(25mM)0.6pL、dNTPMix(2mM)1pL、5xQ-Solution2nL、DNAPolymerase(Qiagen)(5U/pL)0.1|jL、cDNAtemplate(1015ng/^iL)1pL、上遊嵌合特異引物對(總濃度10pM)0.5pL、通用上下遊引物對(10pM)0單，補水至10pL。反應過程為95°C15min;94°C30s，55°C90s，72°C60s，35cycles;72°ClOmin。(3)各取PCR反應產物1[iL、DNA分子標準1pL、3x上樣緩衝液1混勻。上述混合物經95。C變性3min，迅速置於冰浴2min，立即上377測序儀(AppliedBiosystemsInc.)檢測，電泳條件為電壓3KV，電泳時間2.5h。電泳結果經GeneScan和GeneMapperID軟體分析獲得產物大小、峰高、峰面積等數據。產物大小由DNA分子標準得出，峰高用來預判目的基因的表達強度，峰面積(即PCR產物條帶螢光強度)用於計算目的基因的相對表達量，公式如下目的基因相對表達量=目的基因峰面積—看家基因峰面積的幾何平均數實施例22品系15天齡小鼠睪丸組織的性發育起始候選基因的表達分析——上遊嵌合特異引9物降落式(Touchdown)PCR結合螢光通用引物補加優化方法試驗步驟(1)解剖小鼠取睪丸組織，TRIzolReagent(Invitrogen)抽提組織的總RNA。用DNaseI消化TRIzol抽提的總RNA中混有的少量DNA汙染。(2)下遊特異引物逆轉錄合成目的基因的cDNA單鏈模板。逆轉錄反應體系為5xReactionBuffer4pL、MgCI2(25mM)4.8pL、dNTPMix(2mM)lfJL、ImProm-IIReverseTranscriptase(Promega)lpL、下遊嵌合引物(總濃度lOpM)2pL、RNAtemplate(100ng/^iL)2~3^L，補水至20pL。反應過程為25。C5min，42。C60min，70。C15min。(3)上遊嵌合特異引物降落式(Touchdown)PCR結合螢光通用引物補加擴增。PCR反應分為兩個階段進行，第一個階段為前11個循環的TouchdownPCR循環，退火溫度為60°C~50°C，每一個循環退火溫度降低1°C。第二個階段為通用引物對補加後的30個循環的PCR擴增，退火溫度為55。C。反應體系為PCRBuffer1Ox1^1、MgCl2(25mM)0.6pl、dNTPMix(2mM)lpl、5xQ-Solution2^il、DNAPolymerase(5units4tl)0.1^1、cDNA模板(10~15ng4d)l|al、上遊嵌合特異引物對(總濃度10pM)0.5^1、通用上下遊引物對(10pM)0.5^1，補水至10^1。反應過程為95。C15min;94°C30s，退火90s，72°C60s，35cycles;72。C10min。(4)ABI377測序儀檢測PCR反應產物。上樣樣本體系為PCR反應產物1^1(視濃度大小可稀釋)、DNA分子標準(Rox螢光標記，分子片段大小為79bp、105bp、131bp、151bp、201bp、254bp、306bp)1^1、3x藍色葡聚糖上樣緩衝液1^1。配完上樣體系經變性後(95°C3min後迅速置於冰浴放置5min)上377測序儀檢測分析結果，電泳條件為電壓3KV，電泳時間2.5h。電泳結果經GeneSc肌和GeneMapperID軟體分析得到片段大小、各個目的產物的峰高值及峰面積值等有關數據。產物大小由DNA分子標準得出，峰高用來預判目的基因的表達強度，峰面積(即PCR產物條帶螢光強度)用於計算目的基因的相對表達量，公式如下目的基因相對表達量=目的基因峰面積+看家基因峰面積的幾何平均數(5)計算目的基因的相對表達量，篩選2品系小鼠睪丸組織間差異表達的基因。權利要求1.一種基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於包括下列步驟(1)通用引物及上下遊嵌合特異引物的引物序列設計通用引物的長度為20bp，上遊通用引物5』端用Fam螢光標記，嵌合特異引物長度為38bp，3』端為特異引物序列段，5』端為通用引物序列段；(2)多重RT-PCR反應過程a逆轉錄反應階段，下遊嵌合特異引物逆轉錄合成目的基因的cDNA第一鏈；bPCR反應過程，前3個循環，上遊嵌合特異引物將通用引物序列加到目的基因DNA片段的兩端；PCR反應的餘下循環，高濃度的螢光通用引物取代上遊嵌合特異引物完成整個PCR反應過程；(3)測序儀凝膠電泳予以分析檢測。2.根據權利要求1所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於步驟(1)中設計擴增產物的長度在100400bp間，相鄰產物長度差為57bp。3.根據權利要求1所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於步驟(1)中所述的通用引物為上下遊同一序列。4.根據權利要求1所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於步驟(2)中所述的PCR反應過程，前期加入一個上遊嵌合特異引物的降落式PCR過程，為11個循環。5.根據權利要求1或2或3或4所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於所述的通用引物根據水稻序列設計，引物序列為FWD,5，-cgggctacgctatctacgac-3',REV,5，-cgggcagtaagtaccgttgt-3，。6.根據權利要求1或2或3所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於所述的嵌合特異引物根據11個小鼠目的基因和3個看家基因的cDNA序列信息設計，引物序列為ph傷FWD:c卿ctecgctefctecgacCGCAAAGGAAGACCGAGAREV:cgrgrgrcagteasffaccfif的n"GGACCTGCTGTCTTCTGG產物長度98bpPlaclFWD:c卿cfacgcfafcfacgacATCCGCATCAAGGCTGTCREV:cgrgfgrcagteagfaccg收fGATGAGCCCTTGGAAGCA產物長度114bpTmem32FWD:c卿ctecgcfafctecgacCCCACGAGCATGAACACAREV:cgggcagrteagfaccgr的fAGGCGGGGTTCCTATCAA產物長度122bpUsp26FWD:cgggctecgctete/acgacATGCCCAGACACAGCACAREV:cggrgcagteagteccg的fTGACACCGAACCATTCCA產物長度138bpDdx26bFWD:cgggctecgctetetecgacACGTGGCATTGAGGGAAAREV:cfifg^cagteagteccg^gfTCATGGAGGCGGACGTAT產物長度145bpPPIAFWD:c卿ctecgctetefacgacACGCCACTGTCGCTTTTCREV:cggrgrcasffaasrfaccsfffgfTGCAAACAGCTCGAAGGA產物長度152bpmospdlFWD:cggfgcfacgctetefacgacTTCCGAGGAGCCAGTGTTREV:cgggcagffaafifteccgffgffTGGCACTGGATCCCACTT產物長度164bpHsbst2FWD:c卿cfecgrfafctecgacTTCGGCCAGGTTTGTACCREV:cgggrcafifteagteccgrffgfAGGTGACGGCCAAAAGTG產物長度178bpGm773FWD:cgggcfacgcfafcfacgacAACCACATCACGGCAGGTREV:cgggrcagteagteccg^gfTCCAGGAAAGCCATTTGC產物長度187bpMbnl3FWD:cgggrcfacgcfafcfacgracTGGGCGTGGAGACAGTTTREV:cgggcagfteasfteccg的K3GCCTGACTTTTGCCAGA產物長度197bpGapdhFWD:cgggfCfacgcfafcfacgacCAATGTGTCCGTCGTGGAREV:cgggcagteagrfaccgtfg/GGCATCGAAGGTGGAAGA產物長度218bpFhllFWD:cgrgrgfcfacgctefcfacsracCAGGTGCAAAGGGTGCTTREV:cgfsrsfcagfaagteccsr收n"GGCCTTGTTGCACTTCA產物長度249bpCxxlb/CxxlaFWD:cgsfSfctecgctetetecsfacATGGCGAGATGGACAAGCREV:cggrgcagtaagteccg的fCGAACACCCGC丌CATCT產物長度256bpBeta-actinFWD:cgrgsfcfacgctefcfacsracCAACTGGGACGACATGgAREV:cgrgrgfcagrteagfaccgr的rcCATCACAATGCCTGTGG產物長度270bp7.根據權利要求1或2或3或4所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於步驟(2)中所述的逆轉錄反應體系為5xReactionBuffer4nL、4.8濃度為25mM的MgCl2、lpL濃度為2mM的dNTPMix、l^L濃度為lJ/nL的ImProm-IIReverseTranscriptase,下遊嵌合引物2pL總濃度10pM、23^L濃度為lOOng/pL的RNAtemplate,補水至20^L，反應過程為25。C5min，42。C60min，7(TC15min。8.根據權利要求1或2或3或4所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於步驟(2)中所述的PCR反應過程反應體系為PCRBuffer10xlpL、0.6pL濃度為25mM的MgCl2、1pL濃度為2mM的dNTPMix、5xQ-Solution2^L、0.1濃度為5U/pLDNAPolymerase、1nL濃度為1015ng4iL的cDNAtemplate、上遊嵌合特異引物對0.5總濃度10pM、0.5pL通用上下遊引物對10^M，補水至10^L，反應過程為95。C15min;94°C30s,55°C90s，72°C60s，35cycles;72°C10min。9.根據權利要求4所述的基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，其特徵在於:所述降落式PCR反應過程退火溫度為6(TC5(TC，每一個循環退火溫度降低1°C。全文摘要本發明涉及基於螢光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析方法，包括下列步驟(1)通用引物及上下遊嵌合特異引物的引物序列設計，通用引物的長度為20bp，上遊通用引物5』端用Fam螢光標記，嵌合特異引物長度為38bp，3』端為特異引物序列段，5』端為通用引物序列段；(2)多重RT-PCR反應過程；(3)測序儀凝膠電泳予以分析檢測。本發明適用於10-30個基因/反應的研究特定藥物代謝途徑或信號傳導通路等特定候選基因表達分析，是一種對於定量的、高通量的、經濟的基因表達分析簡單最佳的多重解決方案。文檔編號C12Q1/68GK101463389SQ200810207238公開日2009年6月24日申請日期2008年12月18日優先權日2008年12月18日發明者周宇荀,凱李,王勤熙,肖君華,趙麗亞申請人:東華大學