紫菜藻膽蛋白光敏抑制肝癌活性的測定方法
2023-07-26 11:40:06
專利名稱：紫菜藻膽蛋白光敏抑制肝癌活性的測定方法
技術領域：
本發明涉及藻膽蛋白對腫瘤細胞的光敏抑制作用活性的測定方法，特別是涉及條斑紫菜藻膽蛋白對人肝癌細胞的光敏抑制作用活性的測定方法。
背景技術：
光動力療法是近20年來建立和發展起來的一種新型腫瘤療法。其原理主要通過光敏劑富集於病灶處，並在光照下產生光敏損傷來實現對腫瘤細胞的殺傷作用。光動力治療在很大程度上取決於採用的光敏劑的性質。
傳統光敏劑具有嚴重的皮膚光毒性等缺點，開發新型光敏劑成為研究熱點。藻膽蛋白是很好的純天然色素，可用於食物、化妝品、螢光檢測等領域，近年來，根據其吸收光譜的特徵和產生自由基特點，藻紅蛋白、藻藍蛋白均可作為光敏劑，國內首先有蔡心涵、何立明等報導100ug/mL螺旋藻藻藍蛋白經銅泵雷射器輻照12 J/cm2，使人大腸癌細胞HR8348存活率僅為22. 2% 。之後又有李冠武、王廣策等報導用提取自多管藻的藻紅蛋白處理人口腔8113細胞和小鼠S180細胞，再經488nm氬離子雷射器輻照25 J/cm2，發現細胞存活率分別為25%和24%。藻膽蛋白以其高效、無毒、副作用小等優點，被認為是光動力學治療法中一種非常有前景的光敏劑。相比螺旋藻、多管藻，條斑紫菜在我國己大量人工栽培，具有量上的優勢，其本身作為高等紅藻也富含藻膽蛋白。
以條斑紫菜為原料，進行藻膽蛋白抑瘤活性的研究，可以為藻膽蛋白藥物的開發提供更多的原料選擇，及光敏劑藥物製備的詳實依據。藻膽蛋白抑制肝癌活性的研究模型的建立，能為有效藥物的合理開發與完善提供簡便有效的技術方案。
發明內容
本發明的目的是提供藻膽蛋白光敏抑制肝癌活性的測定方法，以建立一種紫菜藻膽蛋白光敏劑抑制肝癌活性研究的模型，為抑瘤光敏劑藥物的開發製備提供新技術方案。本發明的目的是這樣實現的
藻膽蛋白抑制肝癌活性的測定方法，包含以下步驟
(1) 培養人肝癌7721細胞株，當細胞生長旺盛時，用胰酶消化細胞，接種於96孔板；
(2) 將濃度為100-250yg/mL的藻膽蛋白無血清培養基替代上述培養基，培養4小時；
(3) 用碘鎢燈或He-Ne雷射器輻照上述96孔板；碘鎢燈輻照時隔熱，輻照結束後再換入新鮮培養液繼續培養24h;
(4) 用MTT法測定殺傷率，測定藻膽蛋白抑制肝癌的活性。其特徵在於所述的細胞培養液為10%小牛血清的1640培養液。所述的細胞培養條件為37T:、 5%0)2濃度及飽和溼度。所述的隔熱，是指被照射樣品與光源之間加隔熱水槽以消除溫度影響。所述的雷射輻照能量為35-100J/cm2。
由於本發明以條斑紫菜藻膽蛋白和人肝癌7721細胞為材料，通過碘鎢燈或He-Ne雷射器輻照殺傷腫瘤細胞，因此，具有以下優點
1、 藻膽蛋白來源豐富，我國是紫菜生產大國，年產量20億張左右，目前市場上大多是自然涼幹的紫菜，銷售價格在每千克20 - 30元，而每噸飼料級螺旋藻乾粉6-8萬元人民幣(60 - 80元/千克)，曾一度高達每kg 30美元
(約240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本發明所用原料來源廣泛，無需加工，成本相對於螺旋藻便宜的多；
2、 藻膽蛋白提取方便，根據之前製備流程(發明專利申請號2004100990370)，目前從條斑紫菜提取高純度藻膽蛋白工藝簡單，成本低廉，得率較高；
3、 我國是肝癌的高發地區，發病率佔全球的45%，佔癌症死亡率的第三位，光動力治療腫瘤副作用小，該方法一旦應用於臨床，市場前景廣闊；
4、 該方法以碘鎢燈或He-Ne雷射器為光源，可根據具體情況靈活使用；
5、 從結果看，條斑紫菜藻紅蛋白和藻藍蛋白均對人肝癌7721細胞有較高殺傷率，是一種有效的光敏劑。
圖l:藻膽蛋白光動力殺傷對7721細胞存活率的影響
具體實施例方式
以下結合實施例，對本發明所公開的的藻膽蛋白抑制肝癌活性的測定方法作進一步詳細的描述。條斑紫菜(採自江蘇呂泗條斑紫菜栽培海區)，藻膽蛋白
(按2004100990370提取)，人肝癌7721細胞株(購自中科院細胞庫)。其餘試劑為化學分析純按常規配製。
實施例一
本實施例中所用的材料為條斑紫菜藻紅蛋白(R-PE，紫菜藻紅蛋白)和人肝癌7721細胞株，所用光源為碘鎢燈，具體步驟如下
(1) 、人肝癌7721細胞株用含10%小牛血清的1640培養液培養，培養條件為37°C、 5%0)2濃度及飽和溼度。
(2) 、當細胞生長旺盛時，用含EDTA的胰酶消化細胞，洗滌吹散細胞稀釋至106/ml，每孔100uL接種於96孔板。
(3) 、將終濃度IO、 25、 50、 100ug/mL純度為5. 5 (A564nm / A280nm)的藻紅蛋白的無血清培養基替代上述培養基，培養4小時。
(4) 、用碘鎢燈(購自上海順麗照明電器有限公司，型號J118)輻照上述96孔板4h，被照射樣品與光源之間加隔熱水槽，以消除溫度影響；並加有相應濾光片以濾去雜波，輻照功率密度約70mW/cm2，累計能量密度50J/cm2。
(5) 、碘鎢燈輻照結束後再換入新鮮培養液繼續培養24h，用MTT法測定各孔吸光度。
(6) 、以不加任何處理的培養細胞為空白對照，以單用藻膽蛋白不加碘鎢燈輻
照以及不加蛋白單用碘鎢燈輻照的培養細胞作為陰性對照。
(7) 、結果顯示100 ug/mL濃度藻紅蛋白對人肝癌7721細胞的光動力學殺傷率最高，為39%。見圖1中曲線R-PE。
實施例二本實施例中所用的材料為條斑紫菜藻藍蛋白(C-PC，紫菜藻藍蛋白)和人肝癌7721細胞株，所用光源為碘鎢燈，具體步驟如下
(1) 、人肝癌7721細胞株用含10%小牛血清的1640培養液培養，培養條件為37°C、 5%0)2濃度及飽和溼度。
(2) 、當細胞生長旺盛時，用含EDTA的胰酶消化細胞，洗漆吹散細胞稀釋至106/ml，每孔100tiL接種於96孔板。
(3) 、將終濃度IO、 25、 50、 100ug/mL純度為4.0 (A615nm / A280nm)藻藍蛋白的無血清培養基替代上述培養基，培養4小時。
(4) 、用碘鎢燈(購自上海順麗照明電器有限公司，型號J118)輻照上述96孔板4h，被照射樣品與光源之間加隔熱水槽，以消除溫度影響；並加有相應濾光片以濾去雜波，輻照功率密度約70mW/cm2，累計能量密度50J/cm2。
(5) 、碘鎢燈輻照結束後再換入新鮮培養液繼續培養24h，用MTT法測定各孔吸光度。
(6) 、以不加任何處理的培養細胞為空白對照，以單用藻膽蛋白不加碘鉤燈輻照以及不加蛋白單用碘鉤燈輻照的培養細胞作為陰性對照。
(7) 、結果顯示100 u g/mL濃度藻藍蛋白對人肝癌7721細胞的光動力學殺傷率最高，為28%。見圖1中曲線C-PC。
實施例三
本實施例中所用的材料為條斑紫菜藻紅蛋白(R-PE，紫菜藻紅蛋白)和人肝癌7721細胞株，所用光源為He-Ne雷射器(QHP型，上海玻璃儀器一廠)，具體步驟如下
(1) 、人肝癌7721細胞株用含10%小牛血清的1640培養液培養，培養條件為37°C、 5%0)2濃度及飽和溼度。
(2) 、當細胞生長旺盛時，用含EDTA的胰酶消化細胞，洗滌吹散細胞稀釋至106/ml，每孔100uL接種於96孔板。
(3) 、將終濃度30、 60、 120、 250ug/mL純度為5. 5 (A564nm / A280nm)的藻紅蛋白的無血清培養基替代上述培養基，培養4小時。
(4) 、用波長514nm的氬離子雷射器(美國Coherent公司，I麗OVR 400)逐照射上述96孔板，雷射器輸出功率100mW，每孔15min，累計能量密度100J/cm2。
(5) 、輻照結束後再換入新鮮培養液繼續培養24h，用MTT法測定各孔吸光度。
(6) 、以不加任何處理的培養細胞為空白對照，以單用藻膽蛋白不加雷射輻照 以及不加蛋白單用雷射輻照的培養細胞作為陰性對照。
(7) 、結果如表l，顯示250ug/mL濃度藻紅蛋白對人肝癌7721細胞的光動力 學殺傷率最高，為80%。
表1 R-PE光動力殺傷對7721細胞存活率的影響(100J/cm2,哭土S)
R-PE濃度梯度 /(u g.mL")0 (對照)3060120250
重複例數1212121212
R-PE組存活率X/59±5.0*40±6.1**27±6.4"20±5.6**
t檢驗，*p<0.05， **/ <0.01
實施例四
本實施例中所用的材料為條斑紫菜藻藍蛋白(C-PC，紫菜藻藍蛋白)和人 肝癌7721細胞株，所用光源為He-Ne雷射器，具體步驟如下
(1) 、以純度為4.0(A615nm/A280nm)藻藍蛋白替代藻紅蛋白做實施例三中(1) -(3)各步操作。
(2) 、用波長632.8nm的He-Ne雷射器逐孔照射上述96孔板，雷射器輸出功率 約為30mW，每孔20min，累計能量密度約為35 J/cm2。
(3) 、按實施例三中(5) - (6)各步操作。
結果見表2，顯示250ii g/mL濃度藻藍蛋白對人肝癌7721細胞的光動力學
殺傷率最高，為59%。
表2 C-PC光動力殺傷對7721細胞存活率的影響(35J/cm2, X±S)
C-PC濃度梯度 /(u g-ml/1)0 (對照)3060120250
重複例數1212121212
C-PC組存活率^/73+6.0*65±4.8**47±6.7**41±7.1**
t檢驗，*/ <0.05， **p<0.01
權利要求
1、藻膽蛋白抑制肝癌活性的測定方法，其特徵在於包含以下步驟(1)培養人肝癌7721細胞株，當細胞生長旺盛時，用胰酶消化細胞，接種於96孔板；(2)將濃度為100-250μg/mL的藻膽蛋白無血清培養基替代上述培養基，培養4小時；(3)用碘鎢燈或He-Ne雷射器輻照上述96孔板；碘鎢燈輻照時隔熱，輻照結束後再換入新鮮培養液繼續培養24h；(4)用MTT法測定殺傷率，測定藻膽蛋白抑制肝癌的活性。
2、 如權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述的細胞培養液為10%小牛血清的1640培養液。
3、 如權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述的細胞培養條件為37°C、 5%0)2濃度及飽和溼度。
4、 如權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述的隔熱，是指被照射樣品與光源之間加隔熱水槽以消除溫度影響。
5、 如權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述的雷射輻照能量為35-100J/cm2。
全文摘要
本發明提供一種藻膽蛋白抑制肝癌活性的測定方法以條斑紫菜藻膽蛋白作為光敏劑，以碘鎢燈或He-Ne雷射器為光源，通過對人肝癌7721細胞抑制作用的研究，測定紫菜藻膽蛋白對肝癌細胞的抑制活性。為紫菜藻膽蛋白在抑瘤方面的開發應用，提供新的研究模型；為抑制肝癌的光敏劑的開發提供更為豐富廉價且有效的原料。
文檔編號C12Q1/18GK101633949SQ20091019450
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月25日 優先權日2009年8月25日
發明者何培民, 李春霞, 卿 汪, 源 王, 蔡春爾 申請人:上海海洋大學