一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒的製作方法

2023-07-26 12:43:06 3

一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒，屬於生物【技術領域】。本發明針對柑桔衰退病毒分離株FS-577全序列，設計了6對特異性引物，這些引物的擴增區域涵蓋了FS-577的全序列。將擴增片段經雙酶切後依次插入到改造後的雙元載體pUC119-Δ9後獲得的全長侵染性克隆與野生型FS-577相比，在序列、侵染能力和寄主範圍等性狀上完全一致。利用該方法建立的試劑盒，包括有第一鏈cDNA合成、PCR擴增、雙酶切緩衝液，以及連結反應緩衝液等，這些試劑盒可用於構建柑桔衰退病毒全長侵染性克隆。本發明為研究柑桔衰退病毒致病和蚜傳等機理，以及柑桔衰退病防治提供了極其重要的技術平臺。
【專利說明】一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒，尤其涉及一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]中國的柑桔種植面積和產量均居世界第一。柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus，CTV)引起的柑桔衰退病是一種重要的世界性柑桔病害，通過蚜蟲和帶病苗木傳播。我國廣泛分布著柑桔衰退病毒的多種強毒株和強力傳媒褐色桔蚜，隨著20世紀80年代末我國開始進行柑桔產業結構調整，柚類和甜橙的種植比例增加，柑桔衰退病對柚類和某些甜橙的為害日益加劇。
[0003]植物病毒侵染性載體是研究病毒功能基因組的至關重要的平臺，在分子生物學水平上研究病毒基因組結構與功能以及寄主與病毒直接的互作，必須要獲得病毒的侵染性克隆，在此基礎上才能獲得野生型分子或者突變型分子的均一群體，進而利用DNA重組技術進行突變、缺失、插入、置換以及互補實驗對病毒基因組進行功能區域的定位，從而能在寄主植物表型水平上反映和評價基因功能的表達，該技術是深入研究病毒的基因功能以及病毒與寄主植物互作的有效手段。
[0004]目前主要通過弱毒株交叉保護技術來防治柑桔衰退病，但是由於對柑桔衰退病毒的致病和蚜傳機理，以及交叉保護作用原理的認識還不全面，因此在防治上還存在許多局限，影響了防治效果。構建柑桔衰退病毒全長侵染性克隆是進行上述研究的關鍵環節。由於柑桔衰退病毒基因組通常含有19296個核苷酸，是已知最大的植物病毒，病毒顆粒極易斷裂，且缺乏適宜的草本寄主，因此構建全長侵染性克隆的難度極大。我國尚未開展此類研究。

【發明內容】

[0005]針對我國現有柑桔衰退病防治及研究中的瓶頸問題，本發明所要解決的技術問題在於提供一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法及試劑盒。
[0006]本發明所提供的柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法，包括以下步驟:
[0007]1)提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分離株FS-577的總RNA ；
[0008]2)以所述總RNA為模板，用隨機引物反轉錄合成第一鏈cDNA ；
[0009]3)用柑桔衰退病毒分離株FS-577的全序列設計的6對特異性引物，分段擴增所述步驟2中第一鏈cDNA的6個片段:cDNA片段1~6，所述的特異性引物的核苷酸序列分別為:
[0010]弓丨物1上遊引物序列ZYC214:
[0011]5 』 -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0012]弓丨物1下遊引物序列ZYC1293:
[0013]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；[0014]引物2上遊引物序列ZYC749:
[0015]5』 -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3』 ；
[0016]弓丨物2下遊引物序列ZYC1894:
[0017]5』 -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3』 ；
[0018]弓丨物3上遊引物序列ZYC253:
[0019]5』 -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3』 ；
[0020]弓丨物3下遊引物序列ZYC1436:
[0021]5』 -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3』 ；
[0022]引物4 上遊引物序列 ZYC126:5』 -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3』 ；
[0023]弓丨物4下遊引物序列ZYC1493:
[0024]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0025]弓丨物5上遊引物序列ZYC431:
[0026]5』 -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3』 ；
[0027]弓丨物5下遊引物序列ZYC1478:`[0028]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0029]弓丨物6上遊引物序列ZYC2158:
[0030]5』 -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3』 ；
[0031]引物6 下遊引物序列 ZYC114:5』 -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3』 ；
[0032]4)將步驟3中擴增得到的cDNA片段I與雙元載體pUC119_ Λ 9分別進行PmeI/PstI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後得到35S-143 ;將35S-143與cDNA片段2分別進行Pstl/Swal雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後，得到35S-144 ;將35S-144與cDNA片段3分別進行Xmal/Pmel雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後得到35S-145 ;將35S-145與cDNA片段4分別進行XmaI/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後得到35S-146 ;將35S-146與cDNA片段5分別進行Rsr II/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後，得到35S-147 ;將35S-147與cDNA片段6分別進行Rsr II/AscI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後，得到柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148。
[0033]所選的酶切位點使得擴增片段可以成功地插入雙元載體PUC119-A9中。所述步驟4中的雙元載體為PUC119-A9，使用該雙元載體可極大的提高柑桔衰退病毒全長克隆的侵染能力。通過生物學驗證表明，35S-148具有侵染能力不僅能侵染草本植物本生煙，還能侵染大翼來檬等不同的柑桔品種。由此證明本發明構建的35S-148是柑桔衰退病毒FS-577的全長侵染性克隆，具有與FS-577相同的侵染能力和寄主範圍。該全長侵染性克隆為研究柑桔衰退病毒致病和蚜傳等機理，以及柑桔衰退病防治提供了極其重要的技術平臺。
[0034]所述步驟3 中 PCR 擴增的反應條件為 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C，4min循環35次；最後72°C延伸lOmin，終止反應。
[0035]本發明還提供了一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的試劑盒，包括:
[0036]柑桔衰退病毒分離株FS-577全序列擴增的6對引物:[0037]弓丨物1上遊引物序列ZYC214:
[0038]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0039]弓丨物1下遊引物序列ZYC1293:
[0040]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；
[0041 ]弓丨物2上遊引物序列ZYC749:
[0042]5』 -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3』 ；
[0043]引物2下遊引物序列ZYC1894:
[0044]5』 -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3』 ；
[0045]弓丨物3上遊引物序列ZYC253:
[0046]5』 -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3』 ；
[0047]弓丨物3下遊引物序列ZYC1436:[0048]5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；
[0049]引物4 上遊引物序列 ZYC126:5』 -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3』 ；
[0050]弓丨物4下遊引物序列ZYC1493:
[0051]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0052]弓丨物5上遊引物序列ZYC431:
[0053]5』 -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3』 ；
[0054]弓丨物5下遊引物序列ZYC1478:
[0055]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0056]弓丨物6上遊引物序列ZYC2158:
[0057]5』 -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3』 ；
[0058]引物6 下遊引物序列 ZYC114:5』 -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3』 ；
[0059]所述的一種用於構建柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的試劑盒，其特徵在於:還包括以下溶液:
[0060]反應緩衝液:2X反應緩衝液:200mM ρΗ8.8Tris_HCl，lOOmM(NH4)2S04, lOOmMKCl,20mM MgS04, l%Triton X-100, lOmM dNTP，0.02M DTT,5mM MgCl2 ;反轉錄緩衝液:10X 反轉錄緩衝液:lOOmM ρΗ9.0Tris-HCl, 500mM KC1, l%TritonX-100, lOmM MgCl2，0.02M DTT ；
[0061]PCR 緩衝液:10XPCR 緩衝液:200mM pH8.8Tris_HCl，lOOmM(NH4)2S04, lOOmMKCl,20mM MgS04, l%Triton X-100, lOmM dNTP ；
[0062]雙酶切緩衝液:100XBSA，lOmMBis-Tris-Propane-HCl，lOmM MgCl2, ImM DTT ;連結反應緩衝液:300mM ρΗ7.8Tris_HCl，lOOmM MgCl2, lOOmM DTT, lOmMATP ；
[0063]裂解液I:2mg/ml 溶菌酶，1M pH8.0Tris HC1，0.5M EDTA ；
[0064]裂解液I1:0.2M NaOH, 1%SDS。
[0065]有益效果:本發明根據已公布的柑桔衰退病毒分離株FS-577全序列，在FS-577上篩選出6個可供使用的單一酶切位點，並由此設計了 6對特異性引物，這些引物的擴增區域涵蓋了 FS-577的全部序列。獲得的擴增序列按照篩選出的酶切位點進行不同的雙酶切，並將其依次插入改造後的雙元載體PUC119-Λ 9，從而獲得具有侵染力的全長克隆。該全長侵染性克隆不僅與野生型FS-577的序列完全一致，而且具有野生型FS-577同樣的侵染能力和寄主範圍，可以侵染本生煙和柑桔。利用該方法建立的試劑盒，包括有第一鏈cDNA合成、PCR擴增、雙酶切緩衝液，以及連結反應緩衝液等，這些試劑盒可用於構建柑桔衰退病毒全長侵染性克隆。本發明為研究柑桔衰退病毒致病和蚜傳等機理，以及柑桔衰退病防治提供了極其重要的技術平臺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0066]圖1為本發明35S-147和片段6經RsrII/AscI雙酶切產物電泳圖；A:35S_147經RsrII/AscI雙酶切產物；B:片段6經RsrII/AscI雙酶切產物；M:標準分子量為12000bpmarker ；
[0067]圖2為本發明本生煙接種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆後表現的症狀;A:健株；B:接種植株；
[0068]圖3為本發明大翼來檬接種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆後鑑定結果；1:正對照，16:負對照，2-15為待測樣品。
【具體實施方式】
[0069]本發明的柑桔衰退病毒分離株FS-577的全序列公布在NCBI網站上，ID號為KC517488.1。
[0070]本發明中的DTT為Dithiothreitol的簡稱，中文名稱為二硫蘇糖醇(鼎國，中國)。Triton X-100中文名稱為聚乙二醇辛基苯基釀(鼎國，中國)。Bis-Tris-Propane為1，3- 二 [三(輕甲基)甲氨基]丙烷(Sigma，美國)，用HCl調節為ρΗ7.8，得到Bis-Tris-Propane-HCl。ATP 為 Adenosine Triphosphate 的簡稱，中文名稱為三憐酸腺苷(鼎國，中國)。EDTA為Ethylene Diamine Tetraacetic Acid的簡稱，中文名稱為乙二胺四乙酸(鼎國，中國)。SDS為Sodium lauryl sulfate的簡稱，中文名稱為十二烷基硫酸鈉(鼎國，中國)。BSA為bovine serum albumin,中文名稱為小牛血清白蛋白(Bio Basic Inc,加拿大)。溶菌酶為來源於雞蛋白的溶菌酶(Sigma，美國)。
[0071]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明:
[0072]實施例一、柑桔衰退病毒分離株FS-577的鑑定、分離和保存
[0073](I)柑桔衰退病毒的鑑定、分離
[0074]從田間植株的四個不同方向採集已經老熟且帶有葉片的枝條。採用直接組織點免疫的方法進行檢測，具體操作如下:用剃鬚刀片橫切樣品的莖幹或葉柄，隨即均勻地壓在硝酸纖維素膜上，並設置正負對照，室溫下乾燥15min以上。將印跡膜置於含1%BSA的0.02Μ，ρΗ7.2 的磷酸緩衝液(0.13Μ NaCl, 0.02MNa2HP04.12H20，14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mMNaN3)中封閉Ih後直接加入1000:1 (v/v)鹼性磷酸酯酶(Ap)標記的CTV專化抗體IgG(BioRad，美國)中，在室溫下搖動反應2h。倒去含Ap-1gG的緩衝液，加入磷酸吐溫緩衝液(0.13M NaCl, 0.02M Na2HPO4.12H20,14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mM NaN3,0.5% 吐溫-20)洗膜3次，每次在室溫下搖動反應5min。倒出磷酸吐溫緩衝液，依次加入5ml鹼性磷酸緩衝液(1M Tris_base，0.15M NaCl, 0.34M MgCl2), 1.7 μ g 氯化硝基四氮唑藍(Promega，美國)和
0.85 μ g5-溴-4-氯_3_ Π引哚基-磷酸鹽(Promega,美國),在室溫下避光搖動15min後,用蒸餾水衝洗硝酸纖維素膜終止反應。通過觀察待測樣品的葉柄或枝條在硝酸纖維素膜上的印記是否與正對照一樣在其韌皮部處出現了黑褐色環狀物的方式來判斷植株是否感染了柑桔衰退病毒。如果在韌皮部出現了黑褐色環狀物，則說明感染了柑桔衰退病毒。
[0075]由於柑桔衰退病毒FS-577屬於T36基因型，因此使用Hilf Μ E等(Phytopathology，2005)發表的針對Τ36基因型柑桔衰退病毒的外殼蛋白基因、5』非翻譯區、K17和P0L的特異性引物對T36CP (正向引物:5』-ATGGACGACGAAACAAAGAAATTG_』3，反向引物:5 』 -TCAACGTGTGTTGAATTTCCCA-3 』 )，T36-5 (正向引物:5 』 -AATTTCACAAATTCAACCTG-3 』，反向引物:5』 -CTTTGCCTGACGGAGGGACC-3』)，T36K17F (正向引物:5 』 -GTTTTCTCGTTTGAAGCGGAAA-3，，反向引物:5 』 -CAACACATCAAAAATAGCTAGT-3 』 )，T36P0L (正向引物:5 』 -TGACGCTAACGACGATAACG-3，，反向引物:5 』 -ACCCTCGGCTTGTTTTCTTATG-3 』 )進行鑑定。具體操作如下:使用RNAisoplus試劑盒(Takara,日本)提取感染了柑桔衰退病毒的植株葉片中的總RNA。5 μ L總RNA在95°C下變性3min後置於冰上，並混入4 μ L7K，40 μ L2 X反應緩衝液(200mM ρΗ8.8Tris-HCl, lOOmM (NH4)2S04, lOOmM KCl,20mM MgS04, l%TritonX-100, lOmM dNTP，0.02M DTT,5mM MgCl2，lOmM 正反向引物)，1 μ L RT/Taq 酶(Invitrogen，美國)。反應條件為:42°C，20min，94°C，lmin，[94°C，30sec，45°C，30sec，72°C，60sec]循環35次，72°C，5min。RT-PCR產物經切膠純化後取lyL純化產物，與1 μ L平末端載體pSIMPLE-19EcoRV/BAP (Takara,日本)，2 μ L 水，5 μ L 連結緩衝液(300mM ρΗ7.8Tris_HCl，100mMMgCl2, lOOmM DTT, lOmM ATP), 1 μ L3U/μ L T4DNA連接酶(Promega，美國)混合，16°C反應30min，加入50yL感受態細胞JM109 (Promega，美國)輕輕混勻，冰上放置30min。42V水浴熱激90sec，冰浴2min。沿管壁輕輕加800 μ L室溫平衡後的LB液體培養基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)，37 °C，150rpm復甦培養lh。吸取50 μ L菌液塗布於含抗生素的LB培養基(0.1%氨苄青黴素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)中。37 °C過夜培養。挑取單個白斑在1ml LB液體培養基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)中37 °C，150rpm培養10h。按照質粒純化試劑盒(Takara,日本)純化質粒。純化方法參照試劑盒操作說明書，在此不做贅述。對分別插入到質粒中的4個PCR片段進行測序分析。如果上述4個PCR片段分別與NCBI資料庫中ID號為KC517488.1序列中的外殼蛋白基因、5』端區域、K17區域和P0L區域的序列都完全匹配時，則可確認分離到了柑桔衰退病毒分離株FS-577。
[0076](2 )柑桔衰退病毒FS-577的保存:
[0077]將田間感染了 FS-577的植株枝條的皮和芽嫁接於錦橙實生苗。每株錦橙實生苗上腹接毒源植株枝條的一個芽和兩塊皮，並各設立3株作為正負對照，接種後保存在網室中。每半個月觀察一次，若發現有接芽或接皮死亡，需立即補接，至少每株有兩塊皮存活。每隔一個月施用一次複合肥。接種3個月後用步驟1 「柑桔衰退病毒的鑑定、分離」中的直接組織點免疫方法檢測FS-577是否保存成功。
[0078]實施例二、一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法，按照以下步驟操作:
[0079](1)總RNA提取:採用Trizol試劑盒(Invitrogen,美國)提取病株中柑桔衰退病毒分離株FS-577的總RNA。提取方法參照Trizol試劑盒操作說明書，在此不做贅述。
[0080](2)第一鏈cDNA的合成:將8 μ L提取的總RNA，與1 μ L50ng/ μ L隨機引物(Promega公司，美國)，1 μ LlOmM dNTP混合後65°C下反應5min,冰上放置lmin。隨後在此反應液中加入 10μ L10X 反轉錄緩衝液(lOOmM pH9.0Tris-HCl, 500mM KC1, l%TritonX-100, lOmM MgC l2,0.02M DTT)，4U RNaseOUT (Invitrogen，美國)，2U SuperScript IIIRT (Invitrogen，美國)。混勻後分別在25°C下反應lOmin，50°C下反應50min，85°C下反應5min。隨後在冰上至少放置Imin再加入I μ L2U/ μ L RnaseH (Invitrogen,美國),在37。。下反應20min終止反應。-20°C保存。
[0081](3)cDNA片段的擴增:根據NCBI已公布的柑桔衰退病毒FS-577全序列(ID號KC517488.1)設計 6 對特異性引物 ZYC214/ZYC1293, ZYC749/ZYC1894, ZYC253/ZYC1436,ZYC126/ZYC1493, ZYC431/ZYC1478和ZYC2158/ZYC114，從而依次合成柑桔衰退病毒分離株FS-577 全序列上 PmeI 到 PstI (cDNA 片段 I), PstI 到 SwaI (cDNA 片段 2)，PmeI 到 XmaI(cDNA 片段 3)，XmaI 到 Bsu36I (cDNA 片段 4)，Rsr II 到 Bsu36I (cDNA 片段 5)和 Rsr II到AscI (cDNA片段6)的序列。200 μ L擴增體系中含有140 μ L10XPCR緩衝液(200mMpH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl，20mM MgSO4, l%Triton X-100, IOmM dNTP),10 μ M正反向引物，2 μ L4U/μ L Vent DNA聚合酶(ΝΕΒ，美國)，50 μ L水和4 μ L第一鏈cDNA。其中 cDNA 片段 I 使用引物 ZYC214/ZYC1293，cDNA 片段 2 使用引物 ZYC749/ZYC1894，cDNA片段3使用引物ZYC253/ZYC1436，cDNA片段4使用引物ZYC126/ZYC1493，cDNA片段5使用引物 ZYC431/ZYC1478，cDNA 片段 6 使用引物 ZYC2158/ZYC114。反應條件為 94°C，2min，[94°C，30sec，58°C，45sec，72°C，4min]循環 35 次，最後在 72°C延伸 lOmin，終止反應。
[0082]所述的根據柑桔衰退病毒分離株FS-577全序列設計的6對特異引物序列如下:
[0083]弓丨物I上遊引物序列ZYC214:
[0084]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0085]弓丨物I下遊引物序列ZYC1293:
[0086]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；
[0087]弓丨物2上遊引物序列`ZYC749:
[0088]5』 -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3』 ；
[0089]弓丨物2下遊引物序列ZYC1894:
[0090]5』 -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3』 ；
[0091]弓丨物3上遊引物序列ZYC253:
[0092]5』 -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3』 ；
[0093]弓丨物3下遊引物序列ZYC1436:
[0094]5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；
[0095]引物4 上遊引物序列 ZYC126:5』 -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3』 ；
[0096]弓丨物4下遊引物序列ZYC1493:
[0097]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0098]弓丨物5上遊引物序列ZYC431:
[0099]5』 -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3』 ；
[0100]弓丨物5下遊引物序列ZYC1478:
[0101]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0102]弓丨物6上遊引物序列ZYC2158:
[0103]5』 -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3』 ；
[0104]引物6 下遊引物序列 ZYCl 14:5』 -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3』 ；
[0105](4) PCR 產物的濃縮:200 μ L cDNA 片段 I 的 PCR 產物加入 20 μ L3M pH5.2Na0Ac和200 μ L無水乙醇。充分混勻後置於-80°c中15分鐘。12000rpm離心lOmin，去除上清。加入700 μ L70%乙醇清洗、乾燥後用87 μ L雙蒸水溶解待用。同樣的方法用於濃縮其餘的cDNA 片段 2-6。
[0106](5)改造pUC119獲得雙元載體pUC119-A9:在華大基因公司(中國)合成2條雙鏈DNA片段:多克隆位點I (其為ASC1-RSrI1-BSu361-XmaI酶切位點的序列:5』 -AGGCGCGCCTGCWGGWCCG CCTNAGGCCCCCGGGGG-3』，及相應的互補鏈)和多克隆位點 2 (為Xmal-Pmel-Pst1-Swa1-SacI 酶切位點的序列:CCCCCCGGGGGGITTAAACCTGCACTGCAGTGCAITTAAATTCCGAGCTCGGA，W:A/T, N:A/C/G/T)以及相應的互補鏈，由此構成雙鏈的多克隆位點I和雙鏈的多克隆位點2。
[0107]將5 μ g多克隆位點I的雙鏈DNA與25 μ L pUC119(Promega，美國)分別進行AscI/XmaI雙酶切。酶切體系為限制性內切酶AscI (NEB，美國)和XmaI (NEB，美國)各10U，10 μ L雙酶切緩衝液(100 X BSA，IOmMBis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImM DTT)，其餘用水將總體積定為100 μ L0 37°C下反應過夜。多克隆位點I和PUC119經Ascl/Xmal雙酶切後進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用20 μ L水溶解切膠回收、純化後的雙酶切產物，並取15.5 μ L混入
3.5μ L連結緩衝液(300mM pH7.8Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT，IOmM ΑΤΡ)，I μ L3U/μ L T4DNA連接酶(Promega，美國)。16°C下反應過夜。連結液中加入50 μ L感受態細胞JM109 (Promega，美國)，冰上放置30min，42°C水浴熱激90sec後，冰浴2min，加入400 μ LLB液體培養基(l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)，37°C，150rpm復甦培養Ih，菌液塗布於含卡那黴素的LB培養基(0.1%卡那黴素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖，1.5%瓊脂粉)中，37°C培養過夜。挑取陽性克隆置於40ml含卡那黴素的LB培養基(0.1%卡那黴素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)中，37°C，220rpm，過夜培養。
[0108]提取上述菌液中的質粒並進行純化:將上述培養過夜的菌液4°C，4000rpm離心15min，用 3ml 裂解液 I (2mg/ml 溶菌酶，IM pH8.0Tris HCl, 0.5Μ EDTA)溶解沉澱，並依次加入 6ml 裂解液 II (0.2M NaOH，1%SDS)，和 3.75ml3M pH5.8Na0Ac。12000rpm 離心 15min後在上清中加入20 μ L100mg/ml RnaseA。37°C處理30min。取上清，並加入等體積95%冰乙醇，-20°C過夜。4°C 1000Orpm離心lOmin。70%乙醇清洗沉澱。沉澱乾燥後用300 μ L水溶解，從而得到PUC119- Λ 7。通過測序進行驗證。
[0109]5 μ g多克隆位點2的DNA與25 μ LpUCl 19-Δ 7分別進行Xmal/SacI雙酶切。雙酶切時，除限制內切酶為XmaI (NEB，美國)和SacI (NEB，美國)各10U外，其餘酶切體系與多克隆位點I和PUC119雙酶切時相同。此外，後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒的純化方法都與獲得PUC119- Λ 7時的方法一致。由此得到改造後的載體pUC119- Δ 9，通過測序進行驗證。
[0110](6)355-143的獲得:將25 4 1^ pUCl 19-Λ 9載體與濃縮後的87 μ L cDNA片段I分別進行Pmel/PstI雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為PmeI (NEB，美國)和PstI (NEB，美國)各10U外，其餘酶切條件與步驟5中的雙酶切條件一致。後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。從而將cDNA片段I插入到pUCl 19- Δ 9中，由此得到35S-143。
[0111](7) 35S-144的獲得:取20 μ L35S-143與濃縮後87 μ L的cDNA片段2分別進行Pstl/Swal雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為PstI (NEB，美國)和SwaI (NEB，美國)各10U外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1和2的35S-144。[0112](8) 35S-145的獲得:取20 μ L35S-144與濃縮後87 μ L的cDNA片段3分別進行Xmal/Pmel雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為Xmal (NEB，美國)和Pmel (NEB，美國)各10U外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-3的35S-145。
[0113](9) 35S-146的獲得:取20 μ L35S-145與濃縮後87 μ L的cDNA片段4分別進行XmaI/Bsu36I雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為Xmal (NEB，美國)和Bsu36I (NEB，美國)各10U外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-4的35S-146。
[0114](10) 35S-147的獲得:取20 μ L35S-146與濃縮後87 μ L的cDNA片段5分別進行RsrII/Bsu36I雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為RsrII/Bsu36I各10U外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-5的35S-147。
[0115](11) 35S-148的獲得:取20 μ L35S-147與濃縮後87 μ L的cDNA片段6分別進行RsrII/AscI雙酶切。雙酶切時，除限制性內切酶為Rsr II (NEB，美國)和AscI (NEB，美國)各10U外，雙酶切體系與步驟5中的相同。此外，後續的切膠純化、連結、轉化反應和質粒純化方法也與步驟5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-6的35S-148，即柑桔衰退病毒全長克隆35S-148。
[0116]35S-147和cDNA片段6經RsrII/AscI雙酶切產物電泳圖如圖1所示。
[0117]將獲得的全長克隆35S-148測序，到NCBI網站與野生型FS-577序列(ID號KC517488.1)進行Blast比對，序列完全一致。
[0118]實施例二、柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148的應用實例
[0119]將2 μ g35S-148加入到50 μ L農桿菌ΕΗΑ105感受態細胞中，37°C熱激5min，冰上放置5min後加入1ml LB培養基(l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)，28°C，220rpm搖動生長4h後。菌液4000rpm離心5min，用lOOyL LB (l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)溶解沉澱，並塗布於含抗生素的LB培養基(0.1%卡那黴素，0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖，1.5%瓊脂粉)，28°C生長2天。挑單斑在5ml含抗生素的LB培養基(0.1%卡那黴素，0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖)中28°C,220rpm生長1-2天。取50 μ 1菌液接種到10ml LB (l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白腖，10mMpH5.85MES，20 μ Μ乙醯丁香酮，50 μ g/ml卡拉黴素，50 μ g/ml利福平)28°C搖菌過夜。菌液5000rpm 離心 15min。用 15ml 接種緩衝液(10mMpH5.85MES, 10mMMgC12,150 μ Μ 乙醯丁香酮)溶解沉澱。最後將溶液注射接種於1月齡的本生煙(25°C，16h光照，8h黑暗)。如圖2所示，接種1個月後植株發病，葉片出現斑駁症狀。由此證明35S-148具有侵染性，是柑桔衰退病毒分離株FS-577的全長侵染性克隆。
[0120]稱取5g表現症狀的本生菸葉片在液氮中研磨後，加入10ml40mM KP04，4°C，12000rpm離心15min。取上清液在其底部加入lml40mM ΚΡ04 (含70%鹿糖)進行鹿糖密度梯度離心(4°C，38000rpm離心1.5h)，穿刺取出病毒層溶液。將獲得的病毒提取液汁液接種於1年生大翼來蒙。接種3個月後，按照實施例一中步驟1「柑桔衰退病毒的鑑定、分離」的直接組織點免疫方法進行檢測，結果在待測樣品中發現韌皮部的印跡處出現了黑褐色環狀物，因此進一步證明本發明中構建的柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148具有與柑桔衰退病毒分離株FS-577 —致的侵染能力。如圖3所示，1為正對照，16為負對照，其餘為待測樣品，如果韌皮部出現黑褐色環狀物，則說明植株感染了柑桔衰退病毒分離株FS-577的全長侵染性克隆35S-148。待測樣品2-11中均在韌皮部出現黑褐色環狀物，說明植株感染了柑桔衰退病毒分離株FS-577的全長侵染性克隆35S-148，而樣品12-15未在韌皮部出現黑褐色環狀物，說明植株暫時未感染全長侵染性克隆35S-148。
[0121]將感染了柑桔裳退病毒全長侵染性克隆35S-148的大翼來檬植株的皮和芽分別嫁接接種於錦橙-北碚447，墨西哥來檬和鄧肯葡萄柚。每株接種2塊長度為10mm寬5mm的皮和1個芽。接種後植株放於25-28°C的溫室保存。接種3個月後，用上述直接組織點免疫方法對新梢進 行檢測，結果發現接種的植株都感染了柑桔衰退病毒。由此進一步證明全長侵染性克隆35S-148與野生型FS-577具有相同的侵染能力和寄主範圍。
【權利要求】
1.一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法，包括以下步驟: 1)提取柑桔病株中柑桔裳退病毒分尚株FS-577的總RNA； 2)以所述總RNA為模板，用隨機引物反轉錄合成第一鏈cDNA； 3)用柑桔衰退病毒分離株FS-577的全序列設計的6對特異性引物，分段擴增所述步驟2中第一鏈cDNA的6個片段:cDNA片段I~6,所述的特異性引物的核苷酸序列分別為: 引物I上遊引物序列ZYC214 :
5』 -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3』 ； 引物I下遊引物序列ZYC1293:
5』 -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3』 ； 引物2上遊引物序列ZYC749:
5』 -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3』 ； 引物2下遊引物序列ZYC1894:
5』 -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3』 ； 引物3上遊引物序列ZYC253:
5』 -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3』 ； 引物3下遊引物序列ZYC1436:
5』 -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3』 ； 引物 4 上遊引物序列 ZYC126:5』 -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3』 ； 引物4下遊引物序列ZYC1493:
5』 -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3』 ； 引物5上遊引物序列ZYC431:
5』 -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3』 ； 引物5下遊引物序列ZYC1478:
5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，； 引物6上遊引物序列ZYC2158:
5』 _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3』 ； 引物 6 下遊引物序列 ZYCl 14:5』 -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3』 ； 4)將步驟3中擴增得到的cDNA片段I與雙元載體pUC119-Δ 9分別進行Pmel/PstI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後得到35S-143 ；將35S-143與cDNA片段2分別進行Pstl/Swal雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後，得到35S-144 ;將35S-144與cDNA片段3分別進行Xmal/Pmel雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後得到35S-145 ;將35S-145與cDNA片段4分別進行XmaI/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後得到35S-146 ;將35S-146與cDNA片段5分別進行Rsr II/Bsu36I雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後，得到35S-147 ;將35S-147與cDNA片段6分別進行Rsr II/AscI雙酶切，雙酶切產物經切膠純化後混合進行連結，連結產物經轉化、質粒純化後，得到柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148。
2.根據權利要求1所述的一種柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的構建方法，其特徵在於:所述步驟 3 中 PCR 擴增的反應條件為 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec, 72°C，4min循環35次；最後72°C延伸lOmin，終止反應。
3.一種用於構建柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的試劑盒，其特徵在於:包括柑桔衰退病毒分離株FS-577全序列擴增的6對引物:引物1上遊引物序列ZYC214:5』 -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3』 ；引物1下遊引物序列ZYC1293:5』 -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3』 ；引物2上遊引物序列ZYC749:5』 -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3』 ；引物2下遊引物序列ZYC1894:5』 -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3』 ；引物3上遊引物序列ZYC253:5』 -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3』 ；引物3下遊引物序列ZYC1436:5』 -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3』 ；引物 4 上遊引物序列 ZYC126:5』 -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3』 ；引物4下遊引物序列ZYC1493:5』 -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3』 ；引物5上遊引物序列ZYC431:5』 -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3』 ；引物5下遊引物序列ZYC1478:5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；引物6上遊引物序列ZYC2158:5』 _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3』 ；引物 6 下遊引物序列 ZYC114:5』 -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3』。
4.根據權利要求3所述的一種用於構建柑桔衰退病毒全長侵染性克隆的試劑盒，其特徵在於:還包括以下溶液:反應緩衝液:2X 反應緩衝液:200mM pH8.8Tris_HCl，100mM(NH4)2S04, lOOmMKCl, 20mMMgS04, l%Triton X-100, lOmM dNTP，0.02M DTT,5mM MgCl2 ;反轉錄緩衝液:10X 反轉錄緩衝液:100mM ρΗ9.0Tris-HCl,500mM KC1,l%TritonX_100,lOmM MgCl2，0.02M DTT ；PCR 緩衝液:10XPCR 緩衝液:200mM pH8.8Tris-HCl, 100mM(NH4)2S04, lOOmMKCl, 20mMMgS04,l%Triton X-100,lOmM dNTP ；雙酶切緩衝液:100XBSA，lOmM Bis-Tris-Propane-HCl, lOmM MgCl2, ImM DTT ;連結反應緩衝液:300mM ρΗ7.8Tris-HCl, lOOmM MgCl2, lOOmM DTT, lOmMATP ；裂解液 I:2mg/ml 溶菌酶，1M pH8.0Tris HC1，0.5M EDTA ；裂解液 II:0.2M NaOH, 1%SDS。
【文檔編號】C12N15/82GK103642835SQ201310703583
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】周彥, 周常勇, 李中安 申請人:中國農業科學院柑桔研究所