人胎胸腺素的製備方法

2023-07-27 02:18:11 1

專利名稱：人胎胸腺素的製備方法
技術領域：
本發明是涉及一種醫學上應用的人胎胸腺素的製備方法。
人胎胸腺素(Human Embryo Thtmosin縮寫為HFT以上同)是人胎胸腺中提取的生物活性製劑，具有內含胸腺素、胸腺生長素、胸腺體液因子、胸腺因子等多種免疫活性物質，對調節機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤抗體的產生及抗衰老方面起著重要的作用，在臨床上可廣泛應用於治療腫瘤、感染、支氣管哮喘、肝臟疾患，自身免疫性疾病、口腔黏膜疾病等都具有較好的療效。據蘇聯學者把100個癌細胞接種到無胸腺小鼠體內，此鼠患癌症死亡，而把1000萬個癌細胞接種到有胸腺小鼠體內，該鼠不患癌症，說明胸腺可使用機體抗癌能力增加萬倍，國內有人把胎鼠胸腺移植到進入老年期的18個月齡的無生育能力的小鼠體內，結果已喪失生育能力的雄鼠和雌鼠都恢復了生育能力，直到24個月，說明胸腺移植能使青春期延長一倍，而研究表明，胸腺以上功能主要是通過胸腺素來完成的，因此，目前各國醫學專家為了尋找抗癌、抗病、抗衰老、提高對病毒性肝炎、空洞性肺結構等病的治癒率的方法，都在胸腺素的製備方法及產品的生化性質和生物活性方面進行系統的研究。
本發明的目的就是集多年研究的成果，提供一種利用人胎胸腺組織來生產胸腺素的人胎胸腺素的製備方法。
本發明的目的是這樣來實現的，用胎齡5-8個月的合法水囊引產的胎兒，無菌解剖出胸腺組織，用細胞分離器製成生理鹽水-胸腺細胞懸液，或用高速勻漿機勻漿、凍融、加熱、離心除去大分子蛋白質，得上清液後，再經一系列的精製過程和PH調整，除菌過濾，灌封亦可。
本發明方法簡單，成本低，療效好，易於推廣應用，造福於人類。
以下結合實施例對本發明作詳細說明。
以胎齡5-8月的合法水囊引產胎兒為例，其製備方法詳述如下一、人員及環境設備條件要求1)人員要求參與本項工作人員，必須身體健康，無傳染病，並定期進行體格檢查，主要負責製備和質量檢定人員必須是具有製備細胞勻漿，裂解組織細胞和進行相應動物試驗和免疫學試驗的技術人員。其它人員必須經嚴格無菌操作訓練，並掌握本項工作的基本知識和操作技術，所有人員應相對穩定或固定。
2)無菌室要求無菌室應按衛生部生物製品要求建立GMP(優良藥品製備標準)標準的百級生物淨化工作間。若是普通無菌室應有一定的面積，高度(2.4米)。室內安裝紫外光燈，並有層流郊化臺。製備室至少每月用乳酸加熱生成蒸氣進行空氣消毒一次。地面和工作檯面經常用1‰的新潔爾滅或2%的來蘇液擦試，玻璃用70%的酒精擦試。每次使用前應開紫外線燈30分鐘。無菌室內定期做細菌培養，並記錄結果。無菌室內各種用具應相對固定或專用。
3)設備及各項材料的要求一切與製品接觸的用具和器皿均應用無菌，無熱原的雙蒸水衝洗，用前均應以適宜的方法，進行消毒及除熱原處理。所用所有試劑均應符合中華人民共和國藥典或化學純的要求，並用不含熱原的餾水配製。
二、製備工藝(方法)
1)取材料本發明用的胎兒為母體健康，無傳染性疾病，胎兒發育正常，無畸形，胎齡5-8個月的合法水囊引產胎兒，從胎兒娩出到送至製備場所不多於8小時，並且無菌低溫(室溫以下)運送。立即無菌解剖胸腺，-20℃保存不得超過3個月。收集前胸腺細胞活度應在90%以上，除去包膜，脂肪和結締組織，衝去血跡。稱重;2)制懸液用細胞分離器將處理好的胸腺組織進行均漿至鏡檢無完整細胞，製成生理鹽水-胸腺細胞懸液，使其濃度為0.9%的生理鹽水中含胸腺組織為克組織/15ml，即每15毫升內含胸腺組織1克;3)快速凍融上述細胞懸液在溫度為-25℃的條件下，快速結冰，之後，再在溫度為30℃條件下快速融化，反覆進行三次(即快速凍融三次);4)製備上清液凍融後的懸液用4000轉/分的離心機進行沉澱處理，取得上清液;5)除雜蛋白把上述上清液在80℃的溫度下水浴一小時，除去雜蛋白;6)制一清液去除雜蛋白後，用4000轉/分的離心機再進行沉澱處理得一清液;7)去病毒把一清液用其濃度為1.83%的鹽酸調到PH值為4，放置4-12小時，除去病毒;8)制二清液把去除病毒的一清液，再用離心機澄清，製得二清液，把二清液用濃度為5%的NaHCO3(碳酸氫鈉)調至PH值為7.0;9)超微抽濾用超微濾膜(濾孔在2.2μ以下)正壓除菌抽濾;10)檢定除菌抽濾後，經無菌、熱原及過敏檢查合格後灌封分裝安瓶，或製成凍乾粉劑型備用。
成品檢定標準及辦法如下三、質量要求及檢定1)性狀本發明的成品應外觀無色透明，無異物或搖不散的沉澱物。
2)無菌試驗按生物製品無菌試驗規程執行，細菌及黴菌培養結果都必須是陰性。HBSAg檢測用敏性為3ng/ml以下的試劑檢測應為陰性。
3)熱原試驗按中華人民共和藥典關於《生物製品熱原試驗規程》進行，注射劑量按家兔體重3ml/kg。判斷標準按靜脈注射規定判定。
4)安全試驗豚鼠試驗，取體重300-400g豚鼠2隻，每隻腹腔注射待體檢品5ml觀察7天，動物健在，體重增加者為合格。如不符合上述要求，應用4隻豚鼠複試一次，判定標準同前。
小白鼠試驗，取體重18-20g小白鼠5隻，每隻從尾靜脈或腹腔注射待檢品0.5ml。半小時內動物不應有異常反應。繼續觀察7天，動物健存為合格。不合格可用10隻小白鼠複試，制定標準同前。
5)化學檢定①PH值應為7.0;
②紫外光吸收度在250-260nm處有高吸收峰;
③蛋白質反應20%磺基水楊酸等量混合，本品反應應為陰性或微混濁;
④多肽及蛋白含量按中華人民共和國藥典1985年版二部附錄42半微量定氮法，0.07g%即0.7mg/ml(不低於0.5mg/ml)。
⑤胺基酸測定HCL110℃22小時胺基酸含量為0.02g/100ml。
6)生物活性測定①E-玫瑰花環形成試驗按全量法活性花環形成試驗進行(血液病實驗診斷，天津科學技術出版社，1985，409)。常規固定染色，鏡下檢200個淋巴細胞，每一淋巴細胞結合3個或3個以上紅細胞者為一個E-玫瑰花結。E-玫瑰花結形成率比空白對照提高40%(不低於20%)為合格。
②外周血淋巴細胞轉化試驗按楊貴貞(醫學免疫學吉林人民出版社1980，380)形態學方法，用美國產1640和天津產小牛血清配製的培養基5ml加肝素抗凝全血0.3ml，實驗組加入胎腺素30mg或60mg，37℃培養72小時，收穫前4小時加秋水仙素0.4mg，常規製片染色，鏡下數1000個淋巴細胞，以淋巴母細胞加上過渡型淋巴細胞作為轉化細胞，計算淋巴細胞轉化率，比空白對照提高70%(不低於50%為合格)。
本發明和傳統的胸腺素製備方法相比有如下優越性1、本法採用細胞勻漿，鹽水提取，工藝簡單，每周期7天，而國內外丙酮法，工藝較複雜，每周期需30餘天。
2、本法設備低廉，需普遍離心機和無菌室等。值人民幣3萬餘元。國內外常規法，設備昂貴，高速離心機冷凍乾燥機等，值10萬美元。
3、本法正壓抽濾除菌，產品生物活性高，淋轉率提高88%，國內外常規法高壓滅菌，產品生物活性低，淋轉率提高56%。
4、本法產品蛋白純度高(電泳兩條帶)，分子量小(6-7kd)，臨床無不良反應。常規法產品蛋白純度差(電泳4-11條帶)，分子量大(9-58kd)，臨床5-26%不良反應。
由上述可知，本發明工藝簡單，周期短，成品及設備價格低，治療效果好，易於推廣應用，前景廣闊，社會與經濟效益巨大。
權利要求
1.一種以人胎作原料的人胎胸腺素的製備方法，其特徵在於將母體健康，胎兒發育正常的合法水囊引產胎兒，在無菌操作下解剖出胸腺，除去包膜，脂肪和結締組織，衝去血跡，用細胞分離器或勻漿機將胸腺組織進行勻漿，用濃度為0.9%的生理鹽水製成克組織15ml的胸腺細胞懸液，再快速重複凍融三次，快凍溫度為-25℃，快融溫度為30℃，凍融後的懸液沉澱後得上清液，之後，將上清液在80℃的溫度下水浴一小時除去雜蛋白，再用離心機澄清得一清液，把一清液用濃度為1.83%鹽酸調到PH值為4，放置4-12小時，除去病毒，再用離心機澄清，製得二清液，用濃度為5%的NaHCO3調PH值為7.0後，用濾孔在2.2μ以下的超微濾膜正壓除菌抽濾，再經無菌、熱源及過敏檢查合格後即為所需成品，成品可裝入安瓶或製成凍乾粉劑型備用。
2.根據權利要求1所述的人胎胸腺素的製備方法，其特徵在於所說的胎兒為胎齡在5-8個月的合法水囊引產胎兒，胎兒娩出到送至製備場所不多於8小時，無菌低溫運送，無菌解剖出的胸腺在-20℃的溫度下保存不得超過3個月，收集前胸腺細胞活度在90%以上。
全文摘要
本發明是涉及一種醫學上應用的人胎胸腺素的製備方法，主要是用5—8個月齡的正常胎兒的胸腺組織，去包膜、脂肪和結締組織，衝去血跡，用細胞分離器製成生理鹽水-胸腺細胞懸液，或高速勻漿後凍融三次，鏡檢無完整細胞，離心沉澱後，取上清液於80℃的溫度下水浴一小時，再用離心機除去大分子蛋白蛋，得上清液之後經一系列精製過程和pH調整，除菌過濾，灌封成品備用，本發明工藝方法簡單，費用低，所得產品成本低，價值低廉，療效好，易於推廣應用，造福於人類。
文檔編號A61K35/26GK1076361SQ9310106
公開日1993年9月22日 申請日期1993年1月19日 優先權日1993年1月19日
發明者祁巖超 申請人:祁巖超