幹細胞條件培養基組合物的製作方法

2023-07-27 02:31:41 2

專利名稱：幹細胞條件培養基組合物的製作方法
幹細胞條件培養基組合物本發明涉及用於藥學、美容和藥用美容(cosmeceutical)應用的組合物,特別是用於包括病變和燒傷的治療在內的傷口癒合的組合物。幹細胞由於其形成多種類型的細胞的能力而在許多治療、美容和藥用美容領域十分引人關注。參見例如EP 0980270。此外，已披露了用於供細胞(包括幹細胞)生長的培養基，其因生長細胞將蛋白質和其它因子分泌到培養基中而用於治療、美容和藥用美容應用。參見例如US7, 118. 746、US7, 160，726和W02008/020815。仍然需要鑑定用於治療、美容和藥用美容目的的備選組合物。特別需要鑑定產生不被用於支持幹細胞生長的蛋白質性物質汙染的條件培養基的方法。此外，可能特別需要鑑定製備條件培養基的有效的可規模化的方法。按照本發明的第一個方面，提供包含如下獲得的條件細胞培養基的藥物組合物 a)將選自真皮鞘細胞、真皮成纖維細胞或真皮乳頭細胞的保持幹細胞潛能的分化人細胞培養在生長培養基中；和b)將培養基與細胞分離。可用於本發明的第一個方面的生長培養基是足以滿足細胞生長的培養基。細胞培養方法和培養基為本領域所熟知，包括補充血清的基礎培養基、無血清培養基、無蛋白質培養基或化學成分確定的生長培養基。生長培養基通常包含必需胺基酸、糖、鹽、維生素、礦物質/無機鹽、痕量金屬、脂質和核苷，並補充有支持細胞增殖所必需的各種其它組分，例如血清、蛋白質(例如胰島素、運鐵蛋白、生長因子和其它激素)、抗生素(例如慶大黴素、鏈黴素、青黴素)、附著因子(例如纖連蛋白、膠原、層粘連蛋白)。可組合(例如在血清的情況下)或單獨加入補充成分。生長培養基為細胞提供滿足特定細胞類型在受控體外環境中生長的營養需要的必需成分。在一個實施方案中，細胞培養過程在一個培養容器中操作，將細胞直接接種到裝有微載體的培養容器中，細胞增殖直到達到所需細胞密度。在其它實施方案中，細胞培養過程在至少兩個完全不同的細胞培養容器/系統中操作，例如一個或多個種子細胞擴繁容器接著是細胞生產容器。這種多重種子細胞擴繁過程優選利用尺寸遞增的培養容器直到得到足夠的細胞數目用於最終生產細胞培養容器的接種。種子細胞擴繁培養容器可為相同類型(例如組織培養瓶、搖瓶、滾瓶、轉瓶(spinner flask)、wave生物反應器、攪拌爸生物反應器)，但尺寸隨種子細胞擴繁進程遞增，或者可為隨著種子細胞培養擴繁準備妥要轉移到生產生物反應器而尺寸遞增的混合培養系統(例如組織培養瓶至搖瓶至轉瓶至攪拌釜生物反應器系統)。通常控制體外環境以保持最適生長溫度、溶解氧、二氧化碳、pH和重量摩爾滲透壓濃度。許多細胞培養基配方是領域已知的，或者可容易地獲自商用來源。本領域技術人員已知可通過將細胞接種到允許細胞在細胞培養期間生長的生長培養基中來產生條件細胞培養基。在細胞培養結束時或在培養期間的選定點，取出細胞，收穫條件培養基。條件培養基可含有許多原始細胞培養生長培養基的成分，但還可含有細胞代謝物和由細胞分泌的其它蛋白質。分泌性蛋白可以是有生物活性的生長因子、細胞因子、蛋白酶和其它胞外蛋白質和肽。在許多實施方案中，本發明第一個方面的組合物包含Gro-a、1-309、IL_6、IL_8、IL-13、MIF、PAI-I、SDF-I和TGF- P蛋白的一種或多種，尤其包含TGF- ^ I。按照本發明的第二個方面，提供用於製備條件細胞培養基的方法，所述方法包括
a)將真核細胞培養在具有有效支持細胞生長的組成的生長培養基中；
b)將培養細胞與生長培養基分離；
c)將培養細胞維持在具有適於維持細胞存活率但不支持實質性細胞生長的組成的基礎培養基中。可用於本發明第二個方面的真核細胞披露於『Basic Cell Culture』 OxfordUniversity Press (2002) J. M. Davis 主編；以及 『Animal Cell Culture』 Oxford University Press (2000) John. R. ff. Masters主編；兩份文獻通過引用以其整體結合到本文中。術語「幹細胞」描述了可產生多種組織類型的細胞的細胞。幹細胞是來自胚胎、胎兒或成體的細胞，當與特殊信號轉導複合物(其提供成為不同細胞類型的指導)一起出現時，其具有成為不同細胞類型的能力。存在不同類型的幹細胞。當精子使卵受精時便形成一個全能細胞，並因此具有形成整個生物體的能力。在受精後頭幾個小時內，該細胞分裂成相同的全能細胞。受精後大約4天以及幾個細胞分裂循環後，這些全能幹細胞開始特化。在全能細胞變得更加特化時，因此而被稱為「多潛能」。多潛能細胞可分化成體內的每種細胞類型，但不產生胎盤或胎兒發育所必需的支持組織。由於多潛能細胞分化的潛力是不「完整的」，因此這類細胞不能稱為「全能」，且它們不是胚胎。多潛能幹細胞進行進一步特化成為多能幹細胞，所述多能幹細胞定向分化成特化用於特殊功能的特定譜系的細胞。多能細胞可分化成存在於其從中衍生的組織中的細胞類型；例如多能(成體)幹細胞例如間充質幹細胞，例如真皮鞘細胞、真皮乳頭細胞和真皮成纖維細胞。細胞可來源於成體、新生兒或胎兒組織，並且可以是自體或同種異體細胞。可採用本領域充分確立的方法對細胞進行遺傳修飾。可採用遺傳修飾改變分泌到細胞生長條件細胞培養基或條件基礎細胞培養基中的一種或多種成分的濃度，例如以增量調節或減量調節蛋白質、引入新的蛋白質、或調節離子濃度。在某些實施方案中，使細胞作為共培養物生長。共培養細胞是生長在一起的兩種或更多種不同種類的細胞的混合物。適用於第二個方面的方法的細胞可通過本領域已知方法獲得。具體地講，細胞可從組織中分離、由之前已建立的細胞母液中的細胞擴繁、傳代並培養以產生細胞生長條件細胞培養基或條件基礎細胞培養基。細胞生長條件細胞培養基或條件基礎細胞培養基可使用未分化或分化細胞產生。用於本發明第二個方面的方法的細胞優選為保持幹細胞潛能的選自真皮鞘細胞、真皮成纖維細胞或真皮乳頭細胞的分化人細胞。可用於本發明第二個方面的生長培養基如上文有關第一個方面中所述。將細胞培養在生長培養基中，直到達到所需細胞密度。用於本發明第二個方面的基礎培養基具有適於維持細胞存活率的組成(例如pH和重量摩爾滲透壓濃度)以避免細胞溶解但不支持實質性細胞生長、優選不支持細胞生長。基礎培養基包含基礎組分例如無機鹽、胺基酸、維生素和能源(包括糖)，但不補充例如血清、蛋白質、激素和附著因子等成分。優選的能源包含穀氨醯胺。基礎培養基在引入培養細胞前無蛋白質，並且在引入培養細胞後不向基礎培養基中添加蛋白質補充成分。選擇基礎培養基的組成以維持培養細胞的存活率以供輸出細胞代謝物並分泌到基礎培養基中。可使用的基礎培養基的實例包括Ames培養基、Eagle基礎培養基、Click培養基、Dulbecco改良的Eagle培養基、Ham養分混合物F-12、Glasgow極限必需培養基、Iscove改良的Dulbecco培養基、Eagle極限必需培養基和RPMI-1640培養基。在本發明第二個方面的許多優選實施方案中，在從生長培養基分離後並在引入基礎培養基之前洗滌細胞。合適的細胞洗滌溶液的實例為本領域所熟知，包括緩衝液，例如磷酸緩衝鹽溶液。在一些優選的實施方案中，所用洗滌溶液為基礎培養基，例如上述基礎培養基，通常為與隨後維持細胞的培養基相同的基礎培養基。可以以細胞生長期結束時達到的相同細胞濃度將培養細胞引入基礎培養基，或者更優選以較高濃度引入以提高基礎培養基中分泌成分的濃度。如果使細胞生長在2D培養中，則細胞一般生長產生高度匯合的單層培養物。這種細胞濃度通常為IxlO4-IxIO5個細胞/cm2，優選2x104-5xl04個細胞/cm2。如果與基礎培養基的接觸以2D模式進行，則也是利用 這種高度匯合的細胞單層。如果細胞生長在3D培養中，例如附著於微載體上，則細胞一般生長至Ixl07-lxl012個細胞/升的濃度範圍，優選為IxIO8-IxIOltl個細胞/升。在許多實施方案中，在2D或3D培養任一種中，所用基礎培養基的體積低於支持細胞生長所用培養基體積，至少 1/15、一般 1/10-1/2、1/6-1/4，例如 1/5。一般將培養細胞維持在基礎培養基中直到培養基具有所需組成，一般為期超過12小時，通常為18-26小時，例如約24小時。在這種再培育期結束時，取出細胞以產生無細胞的條件基礎細胞培養基。條件基礎細胞培養基可含有細胞代謝物和分泌性蛋白。分泌性蛋白可為生物活性生長因子、細胞因子、蛋白酶和其它胞外蛋白質和肽。使用不同術語描述培養物中的細胞。『細胞培養物』一般是指取自活的生物體並生長在受控條件下的細胞。原代細胞培養物是在第一次繼代培養前直接取自生物體的細胞、組織或器官的培養物。當將細胞在促進生長和/或分裂的條件下置於生長培養基中時，細胞進行擴繁，產生較大的細胞群。細胞系是通過對原代細胞培養物進行一次或多次繼代培養所形成的細胞群。每輪繼代培養亦稱為傳代。本領域技術人員應理解的是，在傳代期間，可能有多次群倍增。依賴貼壁細胞或依賴附著細胞是在組織培養中需要附著某一表面以繁殖和生長的細胞。在一些實施方案中，用於實施本發明的細胞能夠生長在懸浮培養物中。本文所用的有懸浮能力的細胞是能夠生長在懸液中而又不會產生大的堅實聚集體的細胞，即是單分散性的細胞，或者是生長在其中每個聚集體僅有少數細胞的疏鬆聚集體中的細胞。有懸浮能力的細胞包括而不限於在不需要適應或操作時生長在懸液中的細胞，以及通過依賴附著細胞對懸液生長逐步適應而成為有懸浮能力的細胞。如果使用這類細胞，則細胞的繁殖可在懸液中進行，因此可僅在生產生物反應器本身中的最終繁殖階段和在生產階段使用微載體。在懸液適應的細胞的情況下，所用微載體通常為大孔載體，其中細胞通過物理截留在載體的內部結構中而附著。本文所用術語「微載體」意指適於細胞附著和生長的小的分立顆粒。雖不總是如此，但微載體通常為由聚合物形成的多孔珠粒。微載體還可具有帶凹痕的緻密表面。細胞常常附著並生長在這類珠粒的外表面上。
通過在有利於細胞生長的條件下培養細胞來實施本發明的方法。培養條件，例如溫度、pH、溶解氧(包括低氧條件)等，是已知最適於特定細胞的培養條件，並且對本領域的技術人員或操作人員而言是顯而易見的(參見例如Animal Cell Culture: A PracticalApproach 第 2 版,Rickwood, D.和 Hames，B. D.,主編,Oxford University Press, NewYork (1992))o在本發明的第一和第二個方面，有利的是，對附著在固體支持培養基上的細胞進行培養。大規模生產的選擇包括組織培養瓶、滾瓶、基於灌注的系統(例如中空纖維生物反應器、內部和外部自旋過濾器(internal and external spin filter)、聲學細胞滯留裝置(acoustic cell retention device)、基於過濾的細胞滯留裝置)、單板、多板或堆積板細胞培養系統、細胞立方體(cell cube)和微載體。還可使用由可供細胞與之附著並且可供細胞以不止一層生長的任何材料和/或形狀組成的三維支架培養細胞。構架的結構可包括網格、海綿或可由水凝膠形成。一個合適的三維構架是Integra Dermal RegenerationTemplate (Integra Life Sciences)。可將細胞直接培養在三維支架上,或者可從組織培養瓶、滾瓶、中空纖維系統、單板、多板或堆積板細胞培養系統、細胞立方體和微載體中收穫細胞後，將細胞重新接種在三維支架上以產生細胞生長條件細胞培養基或條件基礎細胞培 養基。還可利用灌注細胞培養來培養細胞。在灌注細胞培養中，使用細胞滯留裝置例如過濾器(例如內部或外部自旋過濾器)、細胞截留網格、細胞沉澱器、聲學裝置等，將細胞保留在生物反應器中。連續或定期向生物反應器中提供細胞培養生長培養基，並連續或周期性地取出不含細胞的『耗盡』培養基。在某些優選的實施方案中，細胞附著在固體微載體的表面上，或者附著在大孔微載體的內部結構上，或通過物理截留在大孔微載體的內部結構內而附著，其中微載體是明膠(水解膠原)微載體。這類微載體可包含用作載體材料上的塗層的明膠顆粒、交聯明膠顆粒或明膠，例如聚苯乙烯或玻璃顆粒。明膠可得自天然來源或者重組或合成產生。在一些實施方案中，細胞培養過程在一個培養容器中操作。將細胞直接接種到裝有微載體的培養容器中後，細胞增殖，直到達到所需細胞密度。在無菌下收穫含有增殖細胞的微載體並洗滌。然後，將經洗滌的微載體重新懸於基礎培養基中，並在維持細胞存活率的最適條件下培育一段時間(通常24小時)。然後收穫條件培養基。洗滌步驟可進行一次或多次。在其它實施方案中，細胞培養過程在至少兩個完全不同的細胞培養容器/系統中操作，例如一個或多個種子細胞擴繁容器，接著是細胞生產容器。這種多種子細胞擴繁過程優選使用尺寸遞增的培養容器，直到得到足夠的細胞數目用於最終生產細胞培養容器的接種。種子細胞擴繁培養容器可為相同類型(例如組織培養瓶、搖瓶、滾瓶、轉瓶、wave生物反應器、攪拌釜生物反應器)，但尺寸隨種子細胞擴繁進程遞增，或者可為隨著種子細胞培養擴繁準備妥要轉移到生產生物反應器而尺寸遞增的混合培養系統(例如組織培養瓶至搖瓶至轉瓶至攪拌釜生物反應器系統)。如有需要，可通過使微載體沉澱到細胞培養瓶底，之後取出選定百分比(至多全部並包括全部)的生長培養基體積，任選洗滌微載體，將相應百分比的新鮮細胞培養生長培養基加到細胞培養瓶中，來進行培養基更換。然後將微載體重新懸浮於培養基中後繼續培養。可重複培養基取出和置換的這個過程，直到達到所需細胞密度。
可用於本發明方法的明膠微載體通常為大致球狀的，但可具有其它形狀，並且可以是多孔的，或可以是固體。多孔和固體類型的微載體兩者可獲自商品供應商。大孔明膠微載體是市售可獲得的，例如可獲自Percell Biolytica AB, Sweden的「Cultispher」微載體。明膠大孔微載體的特徵在於顆粒以高度交聯的明膠基質為基礎，粒徑為10-500 ii m，由包封直徑為1-50 的大量空穴的聚合物基質組成。細胞附著微載體的使用有利於用於依賴貼壁細胞生長的攪拌釜和相關生物反應器的使用。細胞一般附著在懸浮的顆粒上。懸浮的需要性通常限制可使用的微載體的物理參數。一般選擇這樣的微載體粒徑範圍，即粒徑足夠大以容納依賴貼壁細胞類型，同時又足夠小以形成其性質適用於細胞培養生物反應器的懸液，細胞培養生物反應器例如搖瓶、滾瓶、轉瓶、wave生物反應器和攪拌釜生物反應器系統。明膠或膠原可通過賴氨酸的氨基、通過穀氨酸或天冬氨酸的羧基或其組合交聯。通過本領域已知方法，例如採用細胞沉澱和傾析、間歇離心或連續離心和/或微量過濾，從細胞在其中生長或維持的培養基中將其分離。可採用例如超濾、滲濾或色譜純化，對所得到的無細胞培養基進一步加工以濃縮或減少一種或多種因子或成分。在本發明第二個方面的方法中產生的條件培養基優選用作藥物組合物。因此，這 類藥物組合物構成本發明的第三個方面。藥物組合物，尤其是得自真皮鞘細胞、真皮成纖維細胞或真皮乳頭細胞的藥物組合物一般可應用於傷口和病變癒合。組合物還可用於已知培養基的成分對之有效的其它應用。優選的組合物包含IL-6、Gro_a、SDF_1、FGF_2、SPARC、PAI-1、IL-8、膠原、纖連蛋白、1-309、IL-13、MIF和SDF-I和TGF-3蛋白的一種或多種，尤其包含TGF-3 I。尤其優選的組合物包含表2、3或4中所列舉的一種或多種蛋白質。本發明第一和第三個方面的組合物可用於作為液體劑的藥物，或可冷凍、凍幹、形成膜劑或乾燥成散劑。可將組合物稀釋、濃縮、與其它成分混合，或者將組合物部分或完全純化。可通過任何合適的方法，將組合物遞送至人體或動物體。可將條件培養基與作為用於內部給予的溶媒的藥學上可接受的載體一起配製、直接施用於傷口 /病灶、與用於局部施用的油膏或軟膏一起配製、或者例如製成或加入或分散於生物可降解的聚合物或水凝膠中以產生創傷敷料、可植入組合物和醫療裝置塗層。分散於生物可降解聚合物中的一個優勢是該系統可用於緩釋遞送系統。這對於將聚合物的生物活性成分遞送至慢性傷口是特別有利的，其必須抵抗傷口蛋白水解環境的快速降解並且具有生物活性成分的緩釋。對技術人員而言將是顯而易見的是，遞送方法將取決於待遞送條件培養基的具體體內應用，並且技術人員應能夠確定為此要應用哪一種方法。可通過應用細胞分泌物而不是細胞或者除細胞以外應用細胞分泌物加強內源組織修復，來使組織再生或修復組織。本發明基於以下前提，即包括多種蛋白質的差異性表達/分泌的多個複雜過程是最適組織修復和重塑所必需的。本發明中產生的條件培養基含有據信對組織修復、重塑和傷口癒合是重要的並且在例如傷口癒合體內模型中顯示已被消耗的許多調節蛋白。這類蛋白質的實例包括TGF-P、IL-6、Gro-a、SDF-U FGF-2、SPARC、PAI-U IL-8、膠原、纖連蛋白、1-309、IL-13、MIF 和 SDF-I0TGF-P I是在皮膚傷口癒合中的主要TGF-P蛋白。在傷口癒合中，TGF-^ I在炎症、血管生成、上皮再形成和結締組織再生中是重要的。已經表明在發生損傷時表達增加(Kopecki Z, Luchetti MM, Adams DH, Strudwick X, Mantamadiotis T, StoppacciaroA，Gabrielli A，Ramsay RGj Cowin AJj J Pathol 2007;211:351-61。Kane CJj HebdaPA，Mansbridge JNj Hanawalt PC, J Cell Physiol 1999 ;148:157-73)。體外研究表明，TGF-P I通過增加與胞外基質(ECM)形成有關的基因表達(包括纖連蛋白、纖連蛋白受體及膠原和蛋白酶抑制劑)而有助於啟動肉芽形成(White L A, Mitchell T I，BrinckerhoffC E, Biochimica et biophysica acta, 2000 ；1490 (3):259-68。 Mauviel A， Chung KYjAgarwal A，Tamai K，Uitto J，J Biol Chem 1996;271:10917-23。PapakonstantinouE, Aletra AJj Roth M，Tamm M，Karakiulakis G，Cytokine 2003，24: 25-35。ZengG, McCue HMj Mastrangelo L, Mills AJj Exp Cell Res 1996; 228:271-6)。更多的體外研究表明，TGF-^ I通過促進膠原基質的成纖維細胞收縮而在傷口收縮中起重要作用(Meckmongkol TTj Harmon R, McKeown-Longo P，Van De Water L, Biochem BiophysRes Cornnun 2007;360:709-14)。在傷口癒合的基質形成和重塑階段，TGF-P I參與膠原產生，特別是 I 型和 II 型的產生(Papakonstantinou E, Aletra AJj Roth M, Tamm MjKarakiulakis G, Cytokine 2003 ;24:25_35)。已經表明，當過量表達時，已知TGF-0 I剌激同樣已知在肥厚性瘢痕和瘢痕瘤性瘢痕的發展中起重要作用的結締組織生長因子(CTGF)(Colwell AS， Phan TTj Kong W, Longaker MT， Lorenz PHj Plast Reconstr Aesthet Surg 2005 ; 116:1387-90)。已經表明，IL-6在啟動傷口癒合反應中重要，和在受傷後表達增加，在陳舊傷口中趨於持續存在(Sogabe Y，Abe M, Yokoymana Y，Ishikawaj 0，Wound RepairRegen 2006 ;14:457_62。Grellner W, Georg T, Wilske J, Forensic Sci Int 2000 ；113:251_640Finnerty CCj Herndon DNj Przkora R， Pereira CTj Oliveira HMj QueirozDM, Rocha AM，Jeschke MG，Shock 2006;26:13-9)。11-6 對角質形成細胞具有促有絲分裂作用(Randle M Gallucci, Dusti K Sloan, Julie M Heck, Anne R Murray 和 SijyJ O』Dell，Journal of Investigative Derma to logy (2004) 122, 764-772)和增殖作用(Sato M, Sawamura D，Ina S，Yaguchi T，Hanada K，Hashimoto I，Arch Dermatol Res1999 ;291:400-4。Peschen M， Grenz H， Brand-Saberi B， Bunaes M， Simon JCj SchopfE, Vanscheidt W，Arch Dermatol Res 1998 ;290:291-7)，並且對嗜中性粒細胞有趨化性。Gro- a (CXCLl)趨化因子是CXC家族成員，是嗜中性粒細胞趨化作用的有效調節齊U，並且在急性傷口中被增量調節。體外研究表明通過促進角質形成細胞迀移而在上皮再形成中起作用(Englehardt E, Toksoy A, Goebeler M, Debus S，Brocker EBj GillitzerRj Am J Pathol 1998 ； 153:1849-60oChristopherson K II，Hromas R, Stem Cells 2001 ；19:388-96)oSDF-I (CXCL12)通過將淋巴細胞募集至傷口並促進血管生成而在炎症反應中起作用。當急性傷口的穩態被擾亂時，在傷口邊緣觀察到水平升高的SDFl (Toksoy A, MullerV，Gillitzer R, Goebeler Mj Br J Dermatol 2007 ;157:1148-54) ADF-l促進上皮細胞的增殖和遷移(Salcedo R, Wasserman K，Young HAj Grimm MC，Howard OMj Anver MR,Kleinman HKj Murphy WJj Oppenheim JJj Am J Pathol 1999;154:1125-35)。SDF-1 還可提高角質形成細胞增殖從而有助於上皮再形成(Florin L, Maas-Szabowski N，WernerS，Szabowski A，Angel P，J Cell Sci 2005 ；118(Pt9) :1981-9) 0FGF-2 (bFGF)在上皮再形成期間調節各種ECM成分的合成和沉積、增加角質形成細胞運動性(Sogabe Y，Abe M, Yokoymana Y，Ishikawaj 0，Wound Repair Regen 2006 ；14:457-62。Grellner W，Georg T，Wilske J，Forensic Sci Int 2000;113:251-64。Di Vita G, Patti R，D』 Agostino P，Caruso G，Arcara M，Buscemi S，BonventreS, Ferlazzo V，Arcoleo F，Cillari E，Wound Repair Regen 2006 ； 14:259-64)和促進成纖維細胞的迀移並剌激其產生膠原酶(Sasaki T, J Dermatol. 1992年11月；19(11) :664-6) o在重塑和修復(例如癒合皮膚傷口)期間，SPARC (富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)在不同組織中表達(Reed MJj Puolakkainen P，Lane TFj Dickerson D, BornsteinP，Sage EHj J Histochem Cytochem 1 993，41:1467-1477)，這就表明了在再生中的功能(Louise H. Jorgensen，Stine J. Petersson，Jeeva Sellathurai，Ditte C. Andersen,Susanne Thayssen, Dorte J. Sant, Charlotte H. Jensen 和 Henrik D. Schroder，Journal of Histochemistry and Cytochemistry,第 57 卷(I) : 29-39，2009)。多種基質細胞蛋白顯示因響應損傷而增加表達(Bradshaw ADj Sage EHj J Clin Invest2001，107:1049-1054)。SPARC是基質細胞糖蛋白，調節細胞與ECM的相互作用。據報導在SPARC失效小鼠中，皮膚傷口閉合加速，膠原沉積改變(Bradshaw ADj Reed MJj Sage EHjJ Histochem Cytochem 2002，50:1-10)。從傷口部位的表達模式和體外研究來看，SPARC涉及傷口癒合的控制(Basu A, Kligman LHj Samulewicz SJj Howe CCj BMC Cell Biol.2001 ；2:150 2001年8月7日網上發表)。PAI-I (SerpineEl)是纖溶酶產生的重要生理調節劑。雖然在表皮中PAI-1通常不是由角質形成細胞表達的，但已經表明在體外和體內傷口損傷後其表達增加(Romer JjLund LR，Eriksen J, Ralfkiaer E, Zeheb R, Gelehrter TDj Dano K，Kristensen P，JInvest Dermatol 1991， 97:803—811。Staiano—Coico I， Carano K， Allan VMj SteinerMG， Pagan-Charry I， Bailey BBj Babaar P， Rigas B， Higgins PJj Exp Cell Res 1996，227:123-134) o支持PAI-I在傷口癒合中的作用的一項研究表明，PAI-I功能的喪失導致傷口癒合力口快(Joyce C. Y. Chan, Danielle A. Duszczyszyn, Francis J. Castellino和 Victoria A Ploplis， American Journal of Pathology. 2001;159:1681-1688)。研究表明，在上皮再形成過程的角質形成細胞和結締組織細胞迀移以及與傷口癒合有關的組織重塑期間，uPA和PAI-I的表達在空間和時間上被調節(Romer J, Lund LR，EriksenJ, Ralfkiaer E, Zeheb R, Gelehrter TDj Dano K， Kristensen P， J Invest Derma to I1991,97:803-811)。在急性傷口中IL_8表達增加(E，Toksoy A，Goebeler M, Debus S，Brocker EBjGillitzer R，Am J Pathol 1998 ; 153:1849-60)，並且已被證實通過增加角質形成細胞迀移和增殖而在上皮再形成中起作用(Michel G, Kemeny L, Peter RU，Beetz A，Reid C，Arenberger P， Ruzicka T， FEBS Lett 1992 ;305:241_30Tuschil A, Lam C， HaslbergerA，Lindley I，J Invest Dermatol. 1992年9月；99(3) :294-8)。它還在白細胞中誘導MMP的表達，剌激組織重塑(Englehardt E, Toksoy A, Goebeler M, Debus S，Brocker EBjGillitzer Rj Am J Pathol 1998 ; 153:1849-60)。它是嗜中性粒細胞強有力的化學引誘物，因此參與炎症反應(Rennekampff HO，Hansbrough JFj Kiessig V，Dore C，SticherlingMj Schr5der JMj J Surg Res. 2000 年 9 月；93 (I) : 41-54)。此外，加入高水平的 IL-8降低角質形成細胞增殖和由成纖維細胞引起的膠原晶格收縮(Iocono JA, Colleran KR,Remick DG, Gillespie Bff, Ehrlich HP, Garner WL, Wound Repair Regen. 2000年5-6月；8(3) :216-25)。膠原和纖連蛋白一傷口癒合的增生期的特徵在於血管生成、膠原沉積、肉芽組織形成、上皮形成和傷口收縮(Midwood K. S. , Williams L. V.,和 SchwarzbauerJ. E. 2004, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (6):1031-1037)。在纖維組織形成和肉芽組織形成中，成纖維細胞生長，並通過分泌膠原和纖連蛋白形成新的 ECM (Midwood K. S. , Williams L. V.和 Schwarzbauer J. E. 2004, TheInternational Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (6) : 1031—1037)。在受傷後2-5天成纖維細胞開始進入傷口部位，因為炎症期結束，且其數目在受傷後1-2周達到高峰(de la Torre J., Sholar A. (2006), Wound healing: Chronic wounds.Emedicine. com, 2008年I月20日訪問)。到第一周結束時，成纖維細胞是傷口中的主要細胞(Stadelmann ff. K. , Digenis A. G.和 Tobin G. R. (1998), American Journal ofSurgery 176 (2) : 26S-38S)。在受傷後2_4周，纖維組織形成結束。在損傷後頭2或3、天，成纖維細胞主要增殖並遷移，而之後，它們是沉積在傷口部位膠原基質上的主要細胞(Stadelmann ff. K. , Digenis A. G.和 Tobin G. R. (1998) ,American Journal of Surgery176 (2) : 26S-38S)。來自正常組織的成纖維細胞從其邊緣遷移至傷口區域中。成纖維細胞最初利用在炎症期形成的血纖蛋白痂遷移過去，附著在纖連蛋白上(Romo T.和PearsonJ. M. 2005, Wound Healing, Skin. Emedicine. com, 2006 年 12 月 27 日訪問)。然後成纖維細胞將基質沉積在傷口床上,稍後沉積它們可附著以遷移的膠原(Rosenberg L.，dela Torre J. (2006), Wound Healing, Growth Factors. Emedicine. com, 2008 年 I 月 20日訪問)。膠原沉積被認為是重要的，因為它增加傷口的強度；在其沉積下來之前，血纖蛋白-纖連蛋白凝塊保持傷口閉合(Greenhalgh D. G. (1998), The International Journalof Biochemistry & Cell Biology 30 (9): 1019-1030)。同樣,參與炎症、血管生成和結締組織構建的細胞附著在成纖維細胞所沉積的膠原基質上，生長並分化(Ruszczak Z. 2003，Advanced Drug Deli very Reviews, 55 (12) : 1595-1611)。人細胞因子1-309是一種小的糖蛋白，在結構上與許多炎性細胞因子相關，其在血管生成期間特異性刺激人單核細胞(Miller MD, Krangel MS, Proc Natl Acad Sci USA1992b 89:2950-2954)。一般認為在治療傷口時需要通過直接加入這些因子來增加生長因子的供應。使用該方法，可排除與基於細胞的療法相關的現有問題，例如但不限於免疫相容性和腫瘤發生。因為許多已知是所需要的一系列因子存在於申請人的細胞生長條件細胞培養基和條件基礎細胞培養基中，因此本發明的細胞生長條件細胞培養基和條件基礎細胞培養基還可用於治療其中需要組織修復和/或再生或損害的其它類型的組織損害。在不受限制的情況下，通過下列實施例對本發明進行說明。細胞系的建立
基本上按EP980270中所述以及下述修改來分離毛囊間充質細胞。將人皮膚組織樣品用含有I U g/ml兩性黴素和10 ug /ml慶大黴素的極限必需培養基(MEM, Sigma M4655)洗滌3次。在解剖顯微鏡下，使用精細手術剪切下毛髮生長初期『端球』，並放入小體積(通常100-200 yl)的MEM中。用針將端球倒置，切開乳頭，抽出鞘。然後將乳頭和鞘分別轉移到4孔細胞培養板(Nunc)中。每孔補充了 20%胎牛血清(FBS)、0. 5 u g/ml兩性黴素和5U g /ml慶大黴素的Iml MEM中轉移10個乳頭和10個鞘。將4孔細胞培養板在無菌和標準條件(37°C、5% 二氧化碳)下培育。細胞生長10天後，將細胞從各孔中剝離(採用本領域充分確立的標準方法)，並分別轉移到35mm直徑細胞培養皿(Nunc)中。當細胞生長匯合時，將真皮鞘(下文稱為『AVDS』 )和真皮乳頭(下文稱為『AVDP』 )細胞系按前述剝離，並轉移到T25細胞培養瓶(Nunc)中用於在上述條件下進一步擴繁。從上述相同的人皮膚組織樣品中建立真皮成纖維細胞(下文稱為『AVDF』 )細胞系。將乳頭真皮與網狀真皮和脂肪層相分離，然後在顯微鏡下切成表面積約2-3_2的片。將切割組織轉移到裝有如上述用於真皮鞘和真皮乳頭細胞系的補充成分的MEM的T25細胞培養瓶(Nunc)中。將裝有真皮成纖維細胞(AVDF)細胞系的T25細胞培養瓶在無菌和標準條件下培育(如前所述)。當培養物達到匯合時，採用相同條件使真皮成纖維細胞(AVDF)細胞系進一步擴繁。從多個不同的人組織樣品建立AVDS、AVDP和AVDF細胞系。在下列實施例中描述的這些細胞系的概況見下表I。表I :細胞系概況
權利要求
1.一種用於製備條件細胞培養基的方法，所述方法包括 a)將真核細胞培養在具有有效支持細胞生長的組成的生長培養基中； b)將培養細胞與生長培養基分離； c)將培養細胞維持在具有適於維持細胞存活率但不支持實質性細胞生長的組成的基礎培養基中。
2.權利要求I的方法，其中所述細胞為真皮鞘細胞、真皮乳頭細胞或真皮成纖維細胞。
3.前述權利要求中任一項的方法，其中所述基礎培養基在引入培養細胞前不含蛋白質。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中將所述細胞附著在微載體上進行培養。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中將所述細胞在與生長培養基分離後並且在引入所述基礎培養基前進行洗滌。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中對步驟c)的產物進行隨後的下列一種或多種過程 a)部分或完全純化； b)冷凍； c)凍幹；和 d)乾燥。
7.一種組合物，其通過前述權利要求中任一項的方法產生。
8.—種藥物組合物，其通過權利要求1-6中任一項的方法產生。
9.權利要求8 的組合物，其包含 IL-6、Gro-α、SDF-U FGF-2、SPARC, PAI-U IL-8、膠原、纖連蛋白、1-309、IL-13、MIF和SDF-1和TGF-β蛋白的一種或多種。
10.權利要求8或9的藥物組合物在用於傷口癒合中的用途。
11.一種藥物組合物，其包含如下獲得的條件細胞培養基a)將選自真皮鞘細胞、真皮成纖維細胞或真皮乳頭細胞的保持幹細胞潛能的分化人細胞培養在生長培養基中；和b)將培養基與細胞分離。
12.權利要求11 的組合物，其包含 Gro-α、1-309、IL-6、IL-8、IL-13、MIF、PAI-USDF-I和TGF-β蛋白的一種或多種。
13.權利要求11或12的組合物，進一步對其進行一種或多種下列過程 a)部分或完全純化； b)冷凍； c)凍幹；和 d)乾燥。
14.權利要求11-13中任一項的組合物在用於傷口癒合中的用途。
15.權利要求8、9、11、12或13中任一項的組合物作為藥物的用途。
全文摘要
本文提供製備條件細胞培養基的方法。所述方法包括a)將真核細胞培養在具有有效支持細胞生長的組成的生長培養基中；b)將培養細胞與生長培養基分離；和c)將培養細胞維持在具有適於保持細胞存活率但不支持實質性細胞生長的組成的基礎培養基中。細胞優選為真皮鞘細胞、真皮乳頭細胞或真皮成纖維細胞。所述組合物可用作藥物組合物，尤其用於傷口癒合的藥物組合物。
文檔編號A61P17/02GK102712899SQ201080052044
公開日2012年10月3日 申請日期2010年9月16日 優先權日2009年9月18日
發明者B.V.卡拉 申請人:富士膠片戴奧辛思生物技術英國有限公司