一種分離和培養臍帶間充質幹細胞的方法
2023-07-26 19:56:06 2
一種分離和培養臍帶間充質幹細胞的方法
【專利摘要】本發明屬於生物醫藥領域，更具體而言屬於幹細胞領域。本發明提供了一種分離UC-MSCs的方法。所述方法包括步驟：1）將臍帶組織碎塊與胰酶和膠原酶混合後孵育；2）然後加入透明質酸酶後孵育。
【專利說明】-種分罔和培養胳帶間充質幹細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，更具體而言屬於幹細胞領域。
【背景技術】
[0002] 幹細胞是一類能夠自我更新和具有多向分化潛能的細胞，在組織工程和細胞治療 中，具有廣泛的應用前景。幹細胞可分為兩大類：胚胎幹細胞和成體幹細胞。
[0003] 胚胎幹細胞（Embryonic Stem Cells, ESCs)是一類高度未分化的細胞，具有全能 性。但由於ESCs來源困難，且容易產生安全問題和倫理問題，極大的限制了 ESCs的研究和 應用。
[0004] 成體幹細胞（Adult Stem Cells)是一類存在於已經分化組織中的多潛能細 胞，這類細胞能夠自我更新並且能夠特化形成組成該類型組織的細胞。間充質幹細胞 (MesenchymalStem Cells, MSCs)是成體幹細胞中的一種，來源於中胚層。目前，MSCs的研 究以骨髓來源的間充質幹細胞（Bone Marrow MesenchymalStem Cells, BMSCs)為主。大量 的研究表明，BMSCs可以向成骨、軟骨、脂肪、神經等多種組織細胞分化，在細胞治療中，具有 廣泛的臨床應用前景。但人體骨髓中的BMSCs含量極其稀少，並隨著年齡的增加，骨髓中的 BMSCs的數量、增殖和分化能力均有顯著的下降，而且BMSCs的取材操作會給受試者造成傷 害。這使得MSCs的研究和應用，尤其是臨床應用，受到極大的限制。
[0005] 近年的研究發現，臍帶中的沃頓膠體富含臍帶間充質幹細胞（Umbilical Cord MesenchymalStem Cells, UC-MSCs)，且大量研究表明，UC-MSCs具有與BMSCs相似的幹細胞 特性--良好的自我更新和多向分化能力，免疫原性低等特點。臍帶作為分娩後的廢棄物， 取材方便，不會對受試者產生影響，且沒有倫理限制。因此，臍帶來源的MSCs引起了人們的 廣泛關注。
[0006] 目前，用於分離UC-MSCs的酶消化法中，存在著許多缺陷。例如，有方法直接使用 膠原酶或者使用胰酶和膠原酶分離UC-MSCs(如專利公開文本CN102321575A、CN102517251A 和CN102533643A公開的方法)。沃頓膠體經過IV型膠原酶或者II型膠原酶和胰酶消化 後，透明質酸無法被有效水解而殘留，導致消化液過於黏稠，需用大量PBS緩衝液進行稀釋 或增加離心力和離心時間，很大程度上會造成大量UC-MSCs損失或損傷。也有方法(如專利 公開文本CN102191229A公開的方法）將中性蛋白酶、膠原酶和透明質酸酶混合進行長時間 的共消化，雖然可以充分水解沃頓膠體中的透明質酸，降低了消化液的黏性，但共消化期間 膠原酶、中性蛋白酶會對暴露的UC-MSCs造成傷害，最終難以獲得大量活性好的UC-MSCs。 另外，在一些方法(如專利公開文本CN102321575A、CN102660501A公開的方法）中，使用過 多的臍帶組織進行UC-MSCs分離，導致其中許多組織都無法被充分消化而殘留，需要使用 濾網進一步過濾，這不僅增加了實驗操作，而且組織塊消化需要使用大量的消化酶，增加了 UC-MSCs分離成本。
[0007] 現有技術需要解決部分或全部上述分離UC-MSCs的問題。
【發明內容】
[0008] 本發明的方法中，先使用胰酶和IV型膠原酶的混合消化液對沃頓膠體的組織結 構進行水解，再使用透明質酸酶對消化液中的透明質酸進行高效水解。這樣採用酶序消化 的方法不僅可以解決沃頓膠體經過膠原酶、胰酶消化後，UC-MSCs難收集的問題，還可以解 決沃頓膠體經過透明質酸酶、膠原酶和胰酶的長時間共消化後，UC-MSCs細胞活性不佳的問 題。而且，在本發明的方法中，組織塊消化充分，增加了 UC-MSCs的獲得量，可以減少臍帶組 織的使用量，減少酶的使用量，降低UC-MSCs分離成本。
[0009] 在第一方面，本發明提供了一種分離UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟：
[0010] 1)將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合後孵育；
[0011] 2)然後加入透明質酸酶後孵育。
[0012] 在第二方面，本發明提供了一種分離和培養UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟：
[0013] 1)將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合後孵育；
[0014] 2)然後加入透明質酸酶後孵育；
[0015] 3)回收細胞並將其培養，獲得UC-MSCs。
[0016] 在一個實施方案中，製備本發明第一和第二方面的方法的步驟1)中的臍帶組織 碎塊通過如下方式製備：剔除臍帶的動脈和靜脈，用等滲緩衝液衝洗(例如用PBS緩衝液衝 洗)，在鈍性分離或不分離沃頓膠體後製成組織碎塊。
[0017] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟1)中的胰酶和IV型膠原酶混合在低糖 DMEM溶液中。優選地，胰酶和IV型膠原酶的濃度分別是0. 05%和200U/ml。在優選的方案 中，組織碎塊與低糖DMEM溶液的體積比是1:3。
[0018] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟1)中孵育在37°C下進行。在優選的方案 中，孵育時間是3-5小時。
[0019] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟2)中加入的透明質酸酶至濃度25 ii g/ ml〇
[0020] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟2)中孵育在37°C下進行。在優選的方案 中，孵育時間是5-10分鐘。
[0021] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟3)回收細胞通過離心進行，並優選用含 有FBS的低糖DMEM培養基洗滌沉澱。
[0022] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟3)培養用含有FBS的低糖DMEM培養基 懸浮細胞鋪板進行。
[0023] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟3)中培養在37°C、5%C02的培養箱中進 行。
[0024] 本發明對現有的UC-MSCs的酶分離方法進行優化，避免以下問題：
[0025] 1)沃頓膠體經過胰酶、膠原酶消化過後，其中的結構蛋白可被有效水解，而透明質 酸因無法有效水解被殘留下來，導致消化液的黏稠度過大，細胞不易被離心收集。
[0026] 2)透明質酸酶聯合胰酶、膠原酶對組織塊進行長時間消化，消化期間膠原酶、胰酶 會對暴露的細胞造成傷害，最終難以獲得大量活性好的細胞。
[0027] 3)使用過多組織塊分離UC-MSCs，造成組織塊消化不充分，消化液需要過濾。這不 僅增加後續工作量，還浪費消化酶，增加UC-MSCs的分離成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖 l、MSCs成脂分化誘導結果。P3代UC-MSCs，使用GIBC0的STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit誘導培養21天，油紅0染色結果，胞質中可見明顯脂滴(如箭頭所 示)。
[0029] 圖2、MSCs細胞成骨分化誘導結果。P3代UC-MSCs，使用GIBC0的STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit誘導培養21天，茜素紅S染色結果，確定興分泌及沉 積情況，鈣沉積如箭頭所示。
[0030] 圖3、MSCs細胞表面抗原檢測結果。P3代UC-MSCs，使用流式細胞儀分別對其表面 抗原⑶73+、⑶90+、⑶105+、⑶34-以及⑶45-的檢測結果（Ml為陽性面積)。
【具體實施方式】
[0031] 在第一方面，本發明提供了一種分離UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟：
[0032] 1)將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合後孵育；
[0033] 2)然後加入透明質酸酶後孵育。
[0034] 在第二方面，本發明提供了一種分離和培養UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟：
[0035] 1)將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合後孵育；
[0036] 2)然後加入透明質酸酶後孵育；
[0037] 3)回收細胞並將其培養，獲得UC-MSCs。
[0038] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟1)中的胰酶和IV型膠原酶混合在低糖 DMEM溶液中。使用低糖DMEM作為酶液的稀釋液有兩個優點：1、低糖DMEM在消化過程中， 可為細胞提供基礎營養，保證細胞的存活率；2、穩定細胞在分離時和培養時的滲透壓，避免 變化過劇。
[0039] 優選地，胰酶和IV型膠原酶的濃度分別是0. 05%和200U/ml。
[0040] 在優選的方案中，組織碎塊與低糖DMEM溶液的體積比是1:3。
[0041] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟3)回收細胞通過離心進行，並優選用含 有FBS的低糖DMEM培養基洗滌沉澱。
[0042] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟3)培養用含有FBS的低糖DMEM培養基 懸浮細胞鋪板進行。
[0043] 在一個實施方案中，本發明的方法的步驟3)中培養在37°C、5%C02的培養箱中進 行，對所獲得的UC-MSCs細胞進行純化，擴繁。
[0044] 在一個具體實施方案中，本發明提供了一種低損傷高效的MSCs的分離方法，具體 包括如下步驟：
[0045] 1)在無菌情況下，剔除臍帶的動脈和靜脈，用PBS緩衝液衝洗後，鈍性分離或不分 離沃頓膠體，製成組織碎塊；
[0046] 2)步驟1獲得的組織塊，按1:3的體積比與含有胰酶和IV型膠原酶的低糖DMEM 混合液混合，在恆溫水浴鍋中37°C水浴消化3-5小時，得到混合物1 ;
[0047] 3)在步驟2獲得的混合物1中，加入透明質酸酶37°C水浴消化5-10分鐘，得到混 合物2 ;
[0048] 4)將步驟3獲得的混合物2, 500g離心5分鐘，獲得沉澱1 ;
[0049] 5)將步驟4獲得的沉澱1，用含有FBS的培養基洗滌1次，500g離心5分鐘，獲得 沉澱2 ;
[0050] 6)將步驟5獲得的沉澱2,用含有10%FBS+2ng/ml bFGF+2mM/mlGln的低糖DMEM 培養基重懸細胞沉澱，鋪板培養，最終獲得UC-MSCs。
[0051] 沃頓膠體中含有豐富的UC-MSCs，組織塊越多，相同的時間內所得到的UC-MSCs細 胞也越多。但組織量的增加，相應的消化酶的使用量也要增加，從而增加了 UC-MSCs分離的 成本費用。本方法中，UC-MSCs分離培養只用2ml臍帶組織(約3cm長)，結合酶序消化的方 法，先使用3倍體積的胰酶和IV型膠原酶混合消化液消化3-5小時，對其組織結構進行破 壞，再使用低濃度的透明質酸酶快速水解消化液中的透明質酸，高效釋放被透明質酸包裹 著的 UC-MSCs。
[0052] 組織塊被胰酶和IV型膠原酶消化3-5小時之後，組織結構通常可以被充分破壞， 不需要再對消化液進行過濾，這不僅減少了組織量，減少實驗操作，還減少了消化酶的使用 量，節省UC-MSCs分離的成本。另外，胰酶和膠原酶對組織塊進行初步的消化，膠體中的 UC-MSCs被透明質酸包裹著，胰酶和IV型膠原酶都無法對透明質酸進行有效水解，因此，短 時間內UC-MSCs受到胰酶和IV型膠原酶的影響較小。當組織結構被胰酶和IV型膠原酶充 分水解後，再使用低濃度的透明質酸酶進行短時間消化，有效水解消化液中的透明質酸，充 分釋放UC-MSCs，並降低UC-MSCs收集難度，保證了 UC-MSCs的獲得量和細胞的活性。
[0053] 定義：
[0054] PBS :憐酸鹽緩衝溶液（Phosphate Buffered Solution)
[0055] FBS :胎牛血清（Fetal Bovine Serum)
[0056] Gin :穀氨醯胺（Glutamine)
[0057] bFGF :喊性成纖維生長因子（basic Fibroblast Growth Factor)
[0058] 實施例
[0059] 1)在無菌條件下，剪取足月健康新生兒臍帶，儲存於含200U/ml青黴素/鏈黴素 (碧雲天，ST488)的PBS緩衝液中，4°C保存。保存時間最長不超過一周。
[0060] 2)在超淨工作檯中，剪取3cm左右的臍帶，用PBS緩衝液洗滌，並擠出血管中殘餘 的血塊。
[0061] 3)用剪刀縱行剪開臍帶基膜，剔除臍帶中的2條動脈和1條靜脈。
[0062] 4)用PBS緩衝液洗滌3遍，儘可能的把組織上的血跡洗滌乾淨。
[0063] 5)鈍性分離除臍帶基膜以外的沃頓膠體，收集膠體並剪碎為約1mm3大小的組織 塊。
[0064] 6)組織塊與含有0? 05%胰酶（GIBC0,15090-046)和200U/ml IV型膠原酶 (INVITR0GEN，17104-019)的低糖 DMEM (GIBC0，cll885500bt)混合液，按 1:3 的體積比例混 合，在恆溫水浴鍋中37°C水浴消化3-5小時，再加入終濃度為25 ii g/ml的透明質酸酶共消 化5-10分鐘。
[0065] 7) 500g離心5分鐘，棄上清。力口 2ml含有10%FBS的低糖DMEM培養基洗滌沉澱1 次。500g離心5分鐘，棄上清。
[0066] 8)加入 2ml 含有 10%FBS (Hyclone，sh30084. 03)+2mM/ml Gin (Sigma，G3126) +2ng/ml bFGF (INVITROGEN，13256-029)的低糖DMEM培養基重懸細胞沉澱，培養於35mm的 培養皿中。第3天全量換液，以後每2天換一次液，待細胞匯合達到80-90%時，用0. 05%的 胰酶（INVITROGEN，25300062)消化，按1:3比例傳代培養。
[0067] 9)根據本發明的方法與專利公開文本CN102321575A和
[0068] CN102191229A報導的方法，對比它們之間UC-MSCs的分離效果。採用等量的組織 塊，根據各自方法的消化，最後得到細胞懸液，統計各方法的細胞得率，數據如下表所示：
[0069] 表1、採用不同的酶消化方法對1ml沃頓膠體組織消化後，所得到的UC-MSCs數量。
[0070]
【權利要求】
1. 一種分離UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟： 1) 將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合後孵育； 2) 然後加入透明質酸酶後孵育。
2. -種分離和培養UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟： 1) 將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合後孵育； 2) 然後加入透明質酸酶後孵育， 3) 回收細胞並將其培養，獲得UC-MSCs。
3. 權利要求1或2的方法，其中用於製備步驟1)中臍帶組織碎塊通過如下方式獲得： 剔除臍帶的動脈和靜脈，在鈍性分離或不分離沃頓膠體後製成組織碎塊。
4. 權利要求1或2的方法，其中步驟1)中的胰酶和IV型膠原酶混合在低糖DMEM溶液 中。
5. 權利要求1或2的方法，其中胰酶和IV型膠原酶的濃度分別是0. 05%和200U/ml。
6. 權利要求4的方法，其中組織碎塊和低糖DMEM溶液的體積比是1: 3。
7. 權利要求1或2的方法，其中步驟1)中孵育在37°C下進行，孵育時間是3-5小時。
8. 權利要求1或2的方法，其中步驟2)中加入透明質酸酶至濃度25 ii g/ml。
9. 權利要求1或2的方法，其中步驟2)中孵育在37°C下進行，孵育時間是5-10分鐘。
10. 權利要求2的方法，其中步驟3)培養用低糖DMEM培養基溶液懸浮細胞進行鋪板。
【文檔編號】C12N5/0775GK104450609SQ201310442644
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】吳亮, 商周春, 劉聰, 王全磊, 陳杰, 董國藝, 葛玉萍, 李靜 申請人:深圳華大基因科技有限公司