一種組成型表達載體及其構建方法與應用的製作方法
2023-07-26 15:37:21
專利名稱：一種組成型表達載體及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種組成型表達載體及其構建方法與應用，特別涉及一種組成型表達載體及其構建方法與該表達載體在表達GL-7-ACA醯化酶中的應用。
背景技術：
7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成頭孢菌素的重要原料，主要由頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通過化學法或酶法裂解脫去7-位的D-α-氨基己二醯側鏈得到。
使用酶法替代傳統的化學法裂解頭孢菌素C生產7-ACA，具有工藝簡單、高效、安全、無汙染及產品質量穩定等優點，在經濟和環境保護上均有較大的競爭優勢。近年來，人們已對酶法生產半合成抗生素的研究和開發投入了大量人力和物力。用酶法裂解生產7-ACA，分為一步酶法和兩步酶法。其中一步酶法，利用頭孢菌素C醯化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化頭孢菌素C，脫去7-位的D-α-氨基己二醯側鏈，生成7-ACA。雖然該法步驟簡單，但目前已發現的CPC醯化酶活力都十分低，遠不能滿足工業催化的需要。兩步酶法是利用來源不同的兩個酶進行兩步催化，首先，頭孢菌素C在D-胺基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，產生一個具有酮基的中間體，這個中間體較不穩定，很容易被同時生成的H2O2化學氧化脫羧，轉變成戊二醯基-7-氨基頭孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanicAcid，GL-7-ACA)；然後在GL-7-ACA醯化酶的作用下脫去其側鏈，生成7-ACA。
大部分產生GL-7-ACA醯化酶的菌株為假單胞菌(Pseudomonas sp.)，可把具有催化GL-7-ACA生成7-ACA活性的酶分為5類，同一類酶的基因都有95％以上的同源性，且酶學性質幾乎完全相同。隨著生物技術的發展，人們越來越重視用基因工程的方法來生產酶和改造酶。羅暉等(羅暉等，產GL-7-ACA醯化酶重組大腸桿菌的構建和表達，微生物學通報，2004，31(4)，38-42)使用了一種快速獲取基因的方法，經過微生物選擇性培養和特異性PCR擴增的方法從自然界中快速獲取了GL-7-ACA醯化酶基因，並構建了基因工程菌BL21(DE3)/pET-Acy，實現了GL-7-ACA醯化酶的克隆與表達。
基因在大腸桿菌中的表達可以分為誘導性表達和組成型表達。很多外源基因都是在可操控的誘導啟動子的作用下進行表達的，未誘導的時候該基因不表達或極少量表達，需要時則可改變條件(加入某種化學物質、改變溫度、增加輻射等)誘導該基因的高效表達，這樣避免了其對宿主生長發育的不利影響，又可高效提取該基因表達的特異蛋白質，但誘導劑的使用不但提高了生產成本，還存在汙染問題。也有一些基因的表達是穩定地保持在一個水平，而不因器官或細胞種類的不同而不同，這類基因稱為組成型表達基因；有些基因調節因子(包括調節蛋白或調節順序)的突變而使基因不受調控地表達，這類基因亦稱組成型表達基因。而這類突變稱為組成型突變。
發明內容
本發明的目的是提供一種組成型表達載體。
本發明所提供的組成型表達載體，是調節基因被敲除或缺失的誘導型質粒達載體。
其中，用於構建所述組成型表達載體的出發載體可為基因工程領域中現有的由laq Iq阻遏蛋白調控的誘導型表達載體，如pMAL-p2x、pGEX、pMBP、pKK223等含tac啟動子的質粒表達載體；優選為pMAL-p2x。
所述組成型表達載體優選為pMALC(其物理圖譜如圖1所示)，它是雙鏈環狀DNA，長度為5.6kb。該載體的lacIq基因缺失，含有氨苄青黴素抗性基因(Ampr)、tac啟動子，tac啟動子位於多克隆位點之前。
本發明還提供了一種構建上述組成型表達載體的方法，該方法通過PCR擴增lacIq基因之外的整個質粒，將lacIq基因缺失。
本發明所提供的構建方法，包括以下步驟1)以含有tac啟動子的質粒表達載體為模板，用由下述正向引物和反向引物組成的引物對進行PCR擴增所述正向引物為序列表中的序列1，所述反向引物為序列表中的序列2；或所述正向引物和反向引物的5′末端均含有一個同種限制性核酸內切酶或同組同尾酶識別序列，且所述正向引物是3′末端為序列1的自5′端第9-25位鹼基的25-40nt的寡核苷酸序列，所述反向引物是3′末端為序列2的自5′端第9-26位鹼基的25-40nt的寡核苷酸序列；2)將得到的PCR擴增產物用可識別所述引物對具有的識別序列的限制性核酸內切酶進行酶切，然後用T4DNA連接酶進行連接得到組成型表達載體。
所述含有tac啟動子的質粒表達載體可為pMAL-p2x、pGEX、pMBP、pKK223等。
所述模板優選為pMAL-p2x，所述組成型表達載體優選為pMALC。
本發明的表達載體可用於表達對宿主生長發育沒有明顯不利影響的外源蛋白，如GL-7-ACA醯化酶。
本發明還提供了利用該組成型表達載體表達GL-7-ACA醯化酶的方法。
本發明所提供的表達GL-7-ACA醯化酶的方法，是將GL-7-ACA醯化酶基因插入上述組成型表達載體得到GL-7-ACA醯化酶基因表達載體，導入宿主細胞，表達得到GL-7-ACA醯化酶。
所述GL-7-ACA醯化酶基因具有序列表中序列3的核苷酸序列。
所述組成型表達載體優選為pMALC。
所述GL-7-ACA醯化酶基因表達載體優選為pMALC-Acy，它是雙鏈環狀DNA，長度為7.8kb。
所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、枯草桿菌；優選為大腸桿菌；更優選為E.coliTB1。
被導入載有所述GL-7-ACA醯化酶基因組成型表達載體的宿主細胞的發酵培養基和發酵條件與其相應的宿主細胞相同。
實驗證明利用本發明的方法獲得的菌體乾重約為1g/L，總蛋白含量約為200mg/L，酶佔總蛋白的40～50％，表達的GL-7-ACA醯化酶的量與誘導表達沒有顯著差別，酶活為220U/L。採用本發明的組成型表達載體表達外源蛋白可以大大簡化發酵和表達的過程，並避免誘導劑的使用所造成的成本和汙染問題。本發明的組成型表達載體將在外源蛋白(特別是GL-7-ACA醯化酶)的生產中發揮重要作用。
圖1為組成型質粒載體pMALC的物理圖譜圖2為重組質粒pMAILC-Acy的物理圖譜圖3為基因工程菌誘導表達後的全菌SDS-PAGE電泳圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用酶如無特別說明均為TaKaRa公司產品。
實施例1、組成型表達質粒pMALC的構建以表達質粒pMAL-p2x(Ampr，tac啟動子；購自NEB公司)為模板，以引物1和引物2為引物進行PCR擴增。其中，引物1:5』-TAGGGCCCGCGCAACGCAATTAATG-3』(帶下劃線的鹼基為ApaI識別位點)(序列表中序列1)；引物2:5』-TAGGGCCCATTCACCACCCTGAATTG-3』(帶下劃線的鹼基為ApaI識別位點)(序列表中序列2)。在一滅菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入20μL無菌水、5μL的10×PCR緩衝液、1μL的dNTP(10mM，塞百盛公司)、1μL的引物1(終濃度50pmol)、1μL的引物2(終濃度50pmol)、0.5μL的質粒pMAL-p2x溶液(濃度為50ng/μL)、0.5μL的LA-Taq DNA聚合酶(5U/μL，寶生物工程(大連)有限公司)，用無菌水補足至總體積50μL，將離心管置於變溫系統中。在PCR反應中，PCR反應的溫度變化過程為先升溫至94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環28次升溫至94℃，保持30秒，降溫至56℃，保持1分30秒，升溫至72℃，保持5分30秒；最後於72℃保持10分鐘，結束擴增反應。經PCR擴增，得到兩端分別帶有ApaI限制性內切酶識別位點的線性質粒，將得到的線性質粒用ApaI限制性內切酶酶切，並用T4DNA連接酶進行連接成為環狀質粒。將連接產物用CaCl2法轉化大腸桿菌TOP-10F』(F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mrBC)φ801acZΔM15ΔlacX74deoRrecAlaraD139(ara-leu)7697galU galK rpsL(StrR)endAl nupG，購自Invitrogen公司)感受態細胞，在含有100μg/mL氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16hr後，挑取若干個菌落於液體LB培養基中培養過夜，收集菌體並提取質粒，經ApaI酶切後，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到5.6kbp片段，證明所得質粒為缺失lacIq基因的質粒載體pMALC(其物理圖譜如圖1所示)。
實施例2、GL-7-ACA醯化酶基因的克隆按照文獻(羅暉等，產GL-7-ACA醯化酶重組大腸桿菌的構建和表達，微生物學通報，2004，31(4)，38-42)的方法構建含有GL-7-ACA醯化酶基因的重組載體pET-Acy。
以帶有GL-7-ACA醯化酶基因的重組質粒pET-Acy為模板，以引物3和引物4為引物進行PCR擴增。其中，引物3:5』-GACGAATTCATGGAGCCGACCTCGA-3』(帶下劃線的鹼基為EcoRI識別位點)；引物4:5』-TAGAAGCTTGTCATGGCTTGAAGTTG-3』(帶下劃線的鹼基為Hind III識別位點)。在-滅菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5μL無菌水、10μL的10×PCR緩衝液、0.3μL的dNTP(10mM，塞百盛公司)、1μL的引物3(終濃度50pmol)、1μL的引物4(終濃度50pmol)、0.5μL的質粒pET-Acy溶液(濃度為50ng/μL)、0.2μL的pfu DNA聚合酶(5U/μL，北京奇華盛生物技術發展中心)，用無菌水補足至總體積20μL，將離心管置於變溫系統中。在PCR反應中，PCR反應的溫度變化過程為先升溫至94℃，保持1分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環30次升溫至94℃，保持30秒，降溫至56℃，保持1分30秒，升溫至72℃，保持2分30秒；最後於72℃保持10分鐘，結束擴增反應。經PCR擴增，得到帶有EcoRI和HindIII酶切位點的GL-7-ACA醯化酶基因，並將得到的GL-7-ACA醯化酶基因用EcoRI和HindIII進行酶切，並與同樣用EcoRI和HindIII酶切的大腸桿菌組成型表達質粒pMALC用T4DNA連接酶進行連接，將連接產物用CaCl2法轉化大腸桿菌TOP-10F』感受態細胞(F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74deoRrecAlaraD139(ara-leu)7697galU galK rpsL(StrR)endAl nupG，購自Invitrogen公司)，在含有100μg/mL氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16hr後，挑取若干個菌落於液體LB培養基中培養過夜，收集菌體並提取質粒，經EcoRI和HindIII雙酶切後，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到2.1kbp和5.6kbp的條帶，表明得到帶有GL-7-ACA醯化酶基因的重組質粒pMALC-Acy(其物理圖譜如圖2所示)。
實施例3、GL-7-ACA醯化酶的表達將重組pMALC-Acy轉化宿主細胞E.coli TB1(M15 Tn10(terr)HsdS gal(入cIts857 indl Sam7 nin5 lacUV5-T7Genel)，購自NEB公司)，得到基因工程菌E.coli TB1/pMALC-Acy。將基因工程菌接種於LB液體培養基中(LB培養基組成為酵母粉0.5％、胰蛋白腖1％、NaCl 1％，pH7.0)，37℃搖床培養過夜；再以5％的接種量轉接到裝有50mL LB培養基的300mL搖瓶中，繼續28℃培養24hr後，離心收集菌體。測定基因工程菌中GL-7-ACA醯化酶的表達量及其活性，結果表明獲得的菌體乾重約為1g/L，總蛋白含量約為200mg/L，酶佔總蛋白的40～50％，表達的GL-7-ACA醯化酶的量與誘導表達沒有顯著差別，酶活為220U/L。
將收集的菌體進行全菌SDS-PAGE電泳，結果如圖3所示，表明基因工程菌表達出了融合蛋白，圖中泳道M為標準蛋白質分子量(分別為97、66、45、30、20.1、14.4kD)。在66kD和58kD左右表達出了兩條明顯的蛋白條帶，其中66kD蛋白條帶對應GL-7-ACA醯化酶的α亞基與MBP的融合蛋白，58kD左右的蛋白條帶對應GL-7-ACA醯化酶的β亞基，表明GL-7-ACA醯化酶的α亞基和β亞基正確加工，酶己成功表達。
序列表1603210121125212DNA213人工序列220
223
4001tagggcccgc gcaacgcaat taatg25210221126212DNA213人工序列220
223
4002tagggcccat tcaccaccct gaattg 2621032112163212DNA213假單胞菌(Pseudomonas sp.)4003
atgctgagag ttctgcaccg ggcgacgtcc gccctggtta tggcgactgt gatcggcctt 60gcgcccggcg tcgcctttgc gctggccgag ccgacctcga cgccgcaggc gccgattgcg 120gcctataaac cgagaagcaa tgagatcctg tgggacggct acggcgtccc gcacatctac 180ggggtcgacg cgccccccgc cttctacggc tacggctggg cccaggcgcg aagccacggc 240gacaatatcc tgcgcctgta tggagaagcg cggggcaagg gggccgaata ctggggcccg 300gattacgaac agacgaccgt ctggctgctg accaacggcg tgccggagcg cgcccagcag 360tggtatgcgc agcagtcgct ggatttccgc gccaacctcg acgccttcgc ggcgggcatc 420aacgcctatg ccgaacagaa cccagacgac atctcgcccg aggtgcggca ggtgctgccg 480gtttccggcg ccgacgtggt ggcgcacgcc catcgcctga tgaacttcct ctatgtcgcg 540tcgcccggcc gcaccctggg cgagggcgat ccgccggacc tggccgatca ggggtccaac 600tcctgggccg tggcgccggg caagacggcg aacgggaacg ccctgctgct gcggaacccg 660cacctgtcct ggacgacgga ctacttcacc tactacgagg cgcatctcgt cacgccggac 720ttcgaagtct atggcgcgac ccagatcggc ctgccggtca tccgcttcgc cttcaatcag 780cggatgggca tcaccaatac cgtcaacggc atggtggggg ccaccaacta tcggctgacg 840cttcaggacg gcggctatct gtacgacggt caggtgcggc cgttcgagcg gcgtcaggcc 900tcgtatcgcc tgcgtcaggc ggacgggtcg acggtcgaca agccgttgga gattcgctcc 960agcgtccatg gcccggtctt cgagcgcgcg gacggcacgg ccgtcgccgt tcgggtcgcc1020ggtttggatc ggccgggcat gctcgagcag tatttcgaca tgatcacggc cgacagcttc1080gacgactacg aagccgccat ggcgcggatg caggtgccga ccttcaacat cgtctgcgcc1140gaccgcgaag ggaccatcaa ctacagcttc aacggcgtgg cgccccaacg ggccgagggc1200gacatcgcct tctggcaggg gctcgtgcct ggcgattcct cgcgttacct gtggaccgag1260acccacccgc tggacgatct gccgcgcgtc accaatccgc cgggcggctt cgtgcaggac1320tccaatgatc cgccgtggac gccgacctgg cccgtcacct acacgcccaa ggacttcccc1380tcctatctgg cgccccagac gccgcattcc ctgcgcgcgc aacaaagcgt gcgtctgatg1440tccgagaacg acgacctgac gctggagcgc ttcatggcgc tgcagttgag ccaccgcgcc1500gtcatggccg accgcacgtt gccggatctg attccggccg ccctgatcga ccccgatccc1560gaggtccagg cggcggcgcg cctgctggcg gcgtgggatc gcgagttcgc cagcgacagc1620cgggccgccc tgctgttcga ggaatgggcg cgtctgttcg ccggtcagaa tttcgccggc1680caggcgggtt tcgccacgcc ctggtcgctg gataagccgg tcagcacgcc ctacggcgtc1740tgcgacacca aggccgccgt cgatcaactg cggaccgcca tcgccaacac caagcgcaag1800tacggcgcga tcgaccggcc gttcggcgac gcctcgcgca tgatcctgaa cgatgtgaat1860gttccgggcg ccgccggcta cggcaacctg ggttccttcc gggtcttcac ctggtccgat1920cctgacgaaa acggggttcg cacgcccgtc cacggcgaga cgtgggtggc gatgatcgag1980ttctccaccc cggtgcgggc ctatggcctg atgagctacg gcaattctcg ccagccgggc2040acgacgcact acagcgatca gatcgaacgc gtgtcgcgcg ccgacttccg cgagctgttg2100ttgcggcgag agcaggtcga ggccgccgtc caggaacgca cgcccttcaa cttcaagcca2160tga 216權利要求
1.一種組成型表達載體，是調節基因被敲除或缺失的誘導型質粒達載體。
2.根據權利要求1所述的組成型表達載體，其特徵在於用於構建所述組成型表達載體的出發載體為含有tac啟動子的質粒表達載體；所述出發載體優選為pMAL-p2x、pGEX、pMBP或pKK223，尤其優選為pMAL-p2x。
3.根據權利要求1或2所述的組成型表達載體，其特徵在於所述組成型表達載體為pMALC。
4.一種構建權利要求2所述組成型表達載體的方法，包括以下步驟1)以含有tac啟動子的質粒表達載體為模板，用由下述正向引物和反向引物組成的引物對進行PCR擴增所述正向引物為序列表中的序列1，所述反向引物為序列表中的序列2；或所述正向引物和反向引物的5′末端均含有一個同種限制性核酸內切酶或同組同尾酶識別序列，且所述正向引物是3′末端為序列1的自5′端第9-25位鹼基的25-40nt的寡核苷酸序列，所述反向引物是3′末端為序列2的自5′端第9-26位鹼基的25-40nt的寡核苷酸序列；2)將得到的PCR擴增產物用可識別所述引物對具有的識別序列的限制性核酸內切酶進行酶切，然後用T1DNA連接酶進行連接得到組成型表達載體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述含有tac啟動子的質粒表達載體為pMAL-p2x、pGEX、pMBP或pKK223，優選為pMAL-p2x；所述組成型表達載體優選為pMALC。
6.一種利用權利要求1所述的組成型表達載體表達GL-7-ACA醯化酶的方法，是將GL-7-ACA醯化酶基因插入所述組成型表達載體得到GL-7-ACA醯化酶基因表達載體，導入宿主細胞，表達得到GL-7-ACA醯化酶。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述組成型表達載體為pMALC。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述GL-7-ACA醯化酶基因表達載體為pMALC-Acy。
9.根據權利要求6或7或8所述的方法，其特徵在於所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、枯草桿菌。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述宿主為大腸桿菌；優選為E.coliTB1。
全文摘要
本發明公開了一種組成型表達載體及其構建方法與應用，其目的是提供一種組成型表達載體及其構建方法與該表達載體在表達GL－7－ACA醯化酶中的應用。本發明所提供的組成型表達載體，是調節基因被敲除或缺失的誘導型質粒達載體。本發明以pMAL－p2x、pGEX、pMBP、pKK223等含tac啟動子的質粒表達載體為模板，在基因lacI
文檔編號C12N9/00GK1763204SQ200410083849
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月20日 優先權日2004年10月20日
發明者周航, 于慧敏, 羅暉, 沈忠耀 申請人:清華大學