基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測法的製作方法

2023-07-26 21:07:01 3

本發明屬於食品病害微生物檢測領域，具體涉及一種基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測法。
背景技術：
：副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，vp)是革蘭氏陰性嗜鹽細菌，隸屬弧菌科中的弧菌屬。它是近海的魚類、蝦類、蟹類、貝類等海產品中的重要的食源性致病菌之一，屬人畜共患病菌，在水產品中的汙染狀況非常嚴重，是沿海地區食物中毒和夏季腹瀉的重要病原菌。為確保食品安全，保護人民身體健康，歐盟、美國等發達國家對水產品中的副溶血性弧菌做出了明確的規定，如歐盟規定副溶血性弧菌不得檢出，而美國規定＜1×104/g。我國已將該菌列為主要的檢驗或監測對象。目前，該菌是多數進出口水產品必檢的致病菌之一。自2001年以來，副溶血性弧菌性食物中毒爆發已經成為中國最常見的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起數和人數一直處於第一位。使用傳統的檢測方法即非選擇性和選擇性增菌、生長法及血清學鑑定雖然比較準確，但檢測周期長、工作量大，繁瑣費時。不僅如此，低水平的病原菌汙染，食品加工後導致菌體的「致傷」及食品其它成分的幹擾等因素，使得傳統的檢測方法受到了一定的限制，因此，急需一些靈敏度更高、特異性更強、簡便、快捷的水產品安全檢測技術，以及時發現致病微生物，控制汙染及其可能對人體健康產生的危害。科技創新產生了一系列新型的檢測方法，如核酸分子擴增檢測技術、免疫檢測、生物傳感等技術，為微生物、病毒的檢測提供了新的手段，在食品安全檢測中發揮了重要作用。免疫螢光技術(fat)、酶聯免疫吸附(elisa)、分子檢測技術(pcr、rflp、aflp、rapd等)已經被用來檢測各種水產病原。儘管目前已有多種微生物的檢測方法，但大多需要較高的實驗室條件，且操作複雜、耗時，只有熟練掌握了其操作技巧的人員才能完成測試，不適合在基層推廣和使用，在發展中國家及我國臨床條件有限的地區應用受到限制。因此，有必要建立水產品中副溶血性弧菌經濟、快速、準確、特異、靈敏、簡便的檢測診斷方法，提高醫學衛生檢驗、疾病防控、水產品加工和進出口檢驗等部門的檢測質量和效率。核酸等溫擴增技術(isothermalnucleicacidamplificationtechnology)可在某一特定的溫度下擴大特定dna或rna片段的拷貝數。與常規pcr技術相比，在遺傳相關疾病和微生物檢測中，核酸等溫擴增技術可通過加熱模塊、水浴槽等簡單非專業設備完成，對儀器要求大大簡化，反應時間大幅縮短，因而更能滿足現代分子檢測技術「快速簡便」的需求，具有非常大的實際應用價值。目前利用納米金探針作為特異dna識別的研究層出不窮。納米金因其高的比表面積、穩定的表面物理化學性質，特別適合作為分子識別反應的界面。將大量的識別分子固定在納米金表面，可實現一系列的反應信號放大功能。此外，由於納米金具有獨特的等離子體共振光學性質，並隨粒子形貌、表面修飾物、粒子間距、溶劑介電常數變化，表現為溶液顏色的顯著改變，為實現基於納米金探針的簡便、靈敏、快速可視化分析提供了理論基礎，使得構建一系列的溶液內納米傳感過程成為可能。基於此，本發明將近年最新發展起來的新型的分子擴增反應(環介導等溫擴增法)與具有優異的表面特性與光學性能的納米材料(納米金)結合起來，開發可現場快速檢測副溶血性弧菌的檢測方法。已有的等溫分子擴增方法多依靠螢光比色檢測手段，擴增時間較長，且多為有毒化學探針，本發明的方法實現了直接的可視化檢測結果判定，並提高了對分子擴增反應的響應靈敏度，縮短了檢測時間，擺脫了對螢光比色試劑以及螢光檢測儀器的依賴性，可大幅降低檢測成本，提高檢測操作的安全性能。服務於水產品質量安全與疾病防控等領域，並為其他特定的病原微生物在食品質量安全與疾病防控檢測手段提供技術參考。技術實現要素：本發明的目的在於針對快速簡便檢測副溶血性弧菌的需求，提供了一種基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測法。具體來說，是提供一種基於納米金與等溫核酸擴增反應檢測副溶血性弧菌tlh基因的試劑及其製備方法，並提供基於該試劑在快速可視化檢測中的應用方法。建立了水產品中副溶血性弧菌經濟、快速、準確、特異、靈敏、簡便的檢測診斷方法，提高醫學衛生檢驗、疾病防控、水產品加工和進出口檢驗等部門的檢測質量和效率。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：第一方面，本發明涉及一種基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測方法，所述方法包括如下步驟：s1、製備鏈黴親和素標記的納米金；s2、對樣品進行採集、增菌後，提取dna；s3、以所述dna為擴增模板進行環介導等溫擴增；s4、取所述鏈黴親和素標記的納米金加入步驟s3擴增完成的反應溶液體系，反應後觀察反應體系溶液；如反應體系溶液產生明顯的由紅向藍的變化過程，則代表樣品中檢測出了副溶血性弧菌，如反應體系溶液未發生由紅向藍的變色過程，則代表樣品中無副溶血性弧菌。優選的，步驟s1中，鏈黴親和素標記的納米金的製備包括如下步驟：a1、調節納米金溶液在450nm處的吸光度值在1.5～2.0；a2、以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液將納米金溶液調節至ph＝7～8；a3、將鏈黴親和素稀釋成一系列5-40μg/ml溶液，每1ml的納米金溶液中分別加入0.1ml，混勻靜置後，加入0.1ml10％的nacl溶液，混勻靜置，隨著鏈黴親和素的用量的增加，納米金溶液由藍色變為紅色；選擇由藍色變為紅色的鏈黴親和素用量1.1倍作為最佳蛋白標記比例；a4、每10ml的經步驟a1和a2調節好的納米金溶液中，加入所述最佳蛋白標記比例的鏈黴親和素溶液，混勻後加入0.1ml10％peg20000溶液再次混勻；a5、離心分離後，將底層懸浮液用0.5mg/mlpeg20000溶液重新離心沉澱，恢復後加入0.1mg/ml疊氮化鈉後冷藏保存待用。優選的，步驟s2中，所述採集、增菌具體為：以無菌操作取樣品可食部分每25g，加入3％氯化鈉鹼性蛋白腖水225ml，均質處理，製備成1∶10的樣品勻液，於36℃±1℃培養，得增菌液。優選的，步驟s2中，所述提取包括：將過夜培養的增菌液混勻後靜置，吸取菌懸液每5ml，加入無菌離心管中，以8000～12000r/min離心，棄去上清液，加入0.5～2mltz裂解液懸浮菌體。優選的，所述tz裂解液的配製包括：2.0％tritonx-100，2.5mg/ml的疊氮化鈉，0.1mol/ltris-hc1緩衝液，ph8.0；沸水浴10min，置冰上10min，然後10000r/min離心5min，冷凍保存待用。優選的，所述環介導等溫擴增中採用的針對副溶血性弧菌的tlh基因的特異性標記引物的序列如seqidno.1～seqidno.4所示；採用的針對副溶血性弧菌的tlh基因的探針的序列如seqidno.5、seqidno.6所示.優選的，所述環介導等溫擴增體系總體積為40μl，除所述引物和探針序列外，還包括如下試劑：各2.0μmol/l的fip和bip、各0.3μmol/l的f3和b3、1μmol/llf和lb、1×恆溫緩衝液(tris-hcl，20mm，ph8.8)、1.2mol/l的甜菜鹼、7mmol/l的mgso4、2.0mmol/l的dntp、5u/μl的bst大片斷dna聚合酶和2μldna模板。優選的，所述環介導等溫擴增體系於62℃恆溫水浴中反應30min，最後在85℃下5min使擴增酶失活。優選的，步驟s3還包括，以副溶血性弧菌的tlh基因標準dna模板作為陽性模板對照，以無菌水作為陰性模板對照同時進行所述環介導等溫擴增。優選的，步驟s4中，每20～100μl步驟s3擴增完成的反應溶液體系中加入的所述鏈黴親和素標記的納米金為10～50μl。第二方面，本發明涉及一種用於所述的基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測方法中的試劑，所述試劑為鏈黴親和素標記的納米金；所述鏈黴親和素標記的納米金的製備包括如下步驟：a1、調節納米金溶液在450nm處的吸光度值在1.5～2.0；a2、以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液將納米金溶液調節至ph＝7～8：a3、將鏈黴親和素稀釋成一系列5-40μg/ml溶液，每1ml的納米金溶液中分別加入0.1ml，混勻靜置後，加入0.1ml10％的nacl溶液，混勻靜置，隨著鏈黴親和素的用量的增加，納米金溶液由藍色變為紅色；選擇由藍色變為紅色的鏈黴親和素用量1.1倍作為最佳蛋白標記比例；a4、每10ml的經步驟a1和a2調節好的納米金溶液中，加入所述最佳蛋白標記比例的鏈黴親和素溶液，混勻後加入0.1ml10％peg20000溶液再次混勻；a5、離心分離後，將底層懸浮液用0.5mg/mlpeg20000溶液重新離心沉澱，恢復後加入0.1mg/ml疊氮化鈉後冷藏保存待用。第三方面，本發明涉及一種用於所述的基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測方法中的針對副溶血性弧菌的tlh基因的特異性標記引物和探針，所述引物的序列如seqidno.1～seqidno.4所示；所述探針的序列如seqidno.5、seqidno.6所示。本發明以納米金表面構建生物素-鏈黴親和素識別過程，結合環介導等溫擴增反應技術構建副溶血性弧菌的tlh基因的檢測方法，進一步建立可視化納米傳感比色檢測方法。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：1)高靈敏度：對含tlh基因的副溶血性弧菌的檢測靈敏度達到10cfu/ul；2)檢測時間短：可在30min內實現分子擴增與檢測過程，大大提高了檢測效率；3)儀器設備簡單：僅需要恆溫水浴儀器。與傳統pcr方法相比，免除了對複雜的溫度循環與螢光檢測儀器的依賴；4)操作簡便，安全。模板製備可通過簡單的水煮法完成，不需純化，各反應試劑可在混合後，通過簡單的冷凍乾燥後穩定保存。整個檢測過程不需要較嚴格的技術培訓即可實現。且檢測過程不需要接觸eb等有毒核酸檢測試劑，保證了操作人員的安全。附圖說明圖1為納米金變色響應等溫核酸擴增基因檢測過程示意圖；圖2為實際檢測結果陰性(a)與陽性(b)。具體實施方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干調整和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。本發明通過設計生物素標記的tlh基因的引物，以環介導等溫擴增技術快速擴增tlh基因，擴增過程產生的大量的具有生物素標記重複序列，將鏈黴親和素修飾的納米金快速聚集，並產生強烈的顏色變化效應，達到對特定基因檢測的目的(檢測原理見附圖1)。實施例本實施例涉及一種基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測法；具體包括如下步驟：1.納米金的製備在燒瓶中將50ml的254μm(0.01％wt)的氯金酸溶液加熱至劇烈沸騰並攪拌，將500μl的388mm的檸檬酸三鈉溶液加入正在沸騰攪拌的溶液中，2min內溶液的顏色從黃色變為紅色，繼續沸騰攪拌15min後，停止加熱，繼續攪拌直至反應液回到室溫，將反應液通過0.8μm的gelman濾膜過濾，得到酒紅色的納米金，通過紫外可見光譜測量其吸收峰在527nm。將製備好納米金存儲在棕色瓶中，於冰箱中在4℃條件下保存，通常在一個月內用完。2.鏈黴親和素修飾的納米金(strepavidin-aunp)。2.1.調節納米金溶液在450nm處的吸光度值在1.5-2.0之間。2.2.調節納米金ph值。以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液將納米金溶液調節至ph＝7-8。優選7.4。2.3.確定鏈黴親和素與納米金的最佳使用量。將鏈黴親和素稀釋成一系列5-40μg/ml溶液，分別取0.1ml加到1ml的納米金溶液中，混勻靜置5min後，加入0.1ml10wt％的nacl溶液，混勻靜置2h，隨著鏈黴親和素的用量的增加，納米金溶液由藍色變為紅色。選擇由藍色變為紅色的鏈黴親和素用量1.1倍作為最佳蛋白標記比例。2.4.標記鏈黴親和素。於10ml的濃度與ph值調節好的納米金溶液中，加入最佳比例的鏈黴親和素溶液，混勻2-3min，加入0.1ml10wt％peg20000溶液混勻。2.5.分離。在10000×g離心力下離心30min，吸取上清液倒掉。將底層懸浮液中加入3ml含有0.5mg/mlpeg20000溶液中，重新離心沉澱，同一溶液恢復，加入0.1mg/ml疊氮化鈉後冷藏保存待用。3.樣品採集及增菌參考國標gb4789.7-2013取樣及增菌方法。以無菌操作取樣品可食部分25g，加入3％氯化鈉鹼性蛋白腖水225ml，用旋轉刀片式均質器以8000r/min均質1min，製備成1∶10的樣品勻液，於36℃±1℃培養16h。4.dna的提取製備將過夜培養的增菌液混勻後靜置5min，吸取菌懸液5ml，加入10ml無菌離心管中，以8000r/min離心2min，棄去上清液，加入1mltz裂解液懸浮菌體。tz裂解液配製：2.0％tritonx-100，2.5mg/ml的疊氮化鈉，0.1mol/ltris-hc1緩衝液，ph8.0。沸水浴10min，置冰上10min，然後10000r/min離心5min，上清即為擴增模板，冷凍保存待用。5.環介導等溫擴增針對副溶血性弧菌的tlh基因的特異性標記引物，其序列(5』-3』)如下：引物片段1(tlh-f3)：gcgcaaggttacaacatcacseqidno.1引物片段2(tlh-b3)：gcgtgacattccagaacacaseqidno.2artificialsequence引物片段3(tlh-fip)：cgcgttcacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcgaseqidno.3引物片段4(tlh-bip)：ttggacatcaaccgctcatcgtgacgctgcacactcagagseqidno.4探針：5』修飾引物片段5(tlh-lf)：tcgggcgcagaagttagc-5』biotintegseqidno.5artificialsequence5』修飾引物片段6(tlh-lb)：ctgtcgattacatgtacacccac-5』biotintegseqidno.6上述引物和探針為用於；過程對tlh基因的擴增的試劑。環介導等溫擴增體系總體積為40μl，除上述引物和探針序列外，還包括如下試劑：各2.0μmol/l的fip和bip、各0.3μmol/l的f3和b3、1μmol/llf和lb、1×恆溫緩衝液(tris-hcl，20mm，ph8.8)、1.2mol/l的甜菜鹼、7mmol/l的mgso4、2.0mmol/l的dntp、5u/μl的bst大片斷dna聚合酶和2μldna模板。進行等溫擴增時，樣品進行3份重複，以副溶血性弧菌的tlh基因標準dna模板以及無菌水作為陽性和陰性模板對照同時進行，以確定進行擴增方法的可靠性。上述反應體系置於62℃恆溫水浴中反應30min，最後在85℃下5min使擴增酶失活，結束反應。並通過以超純水和已知tlh基因的dna模板代替由實際樣品中提取出dna模板，反應進行過程中同時設置陽性和陰性對照反應，防止擴增反應時的可能的交叉汙染。6.擴增產物的檢測取20μl的鏈黴親和素標記的納米金探針加入擴增完成的反應溶液體系，震搖反應2min後，由於引物片段tlh-lf、tlh-lb在擴增過程中同時插入了dna聚集體，其5』端修飾的biotin-teg對鏈黴親和素標記的納米金探針具有強烈的親和性能，故反應體系中存在大量的dna擴增聚集體時，鏈黴親和素標記的納米金探針將結合在該dna擴增聚集體上，反應體系溶液產生明顯的由紅向藍的變化過程，指示了反應體系的擴增過程，證明了樣品中tlh基因的存在，檢測了含有tlh基因的副溶血性弧菌。如混合溶液未發生由紅向藍的變色過程，則證明樣品中無副溶血性弧菌(圖2)。進行結果判定的同時，需以檢測體系中陽性以及陰性對照管分別發生和不發生變色過程為前提，以保證整個檢測過程進行了良好的質控。7.檢測方法的特異性實驗分別以過夜培養的純的副溶血弧菌(atcc17802)、大腸桿菌(atcc25922)、金黃色葡萄球菌(atcc29213)、單增李斯特菌(atcc15313)、創傷弧菌(atcc27562)的菌懸液進行dna模板的提取。用所建立的副溶血弧菌擴增以及檢測方法進行特異性試驗。以無菌水代替細菌dna模板作為陰性對照。檢測結果如下表1：表1菌種名稱編碼tlh基因檢測結果副溶血弧菌atcc17802+大腸桿菌atcc25922-金黃色葡萄球菌atcc29213-單增李斯特菌atcc15313-創傷弧菌atcc27562-8.方法靈敏度將過夜培養的副溶血弧菌atcc17802菌懸液以無菌水進行10倍稀釋至10-1～10-8，取各稀釋度菌液100μl進行營養瓊脂平板計數，於30℃培養箱中培養48h後計數，每個稀釋度進行3份試驗。同時，取各稀釋度菌液1ml提取dna作為模板進行擴增和檢測。每個稀釋度進行3份試驗來驗證其穩定性和檢測靈敏度。以無菌水代替細菌dna模板作為陰性對照，通過平板計數的結果來確定等溫擴增方法最低檢測限，當3份平行樣品均呈陽性時的最大稀釋倍數的細菌濃度作為其最低檢測限。其檢測結果如下表2：表2以上結果證明本方法對副溶血性弧菌的檢測限在100-1000cfu/ml之間，相當於每2ul中2-20個dna模板，顯示了方法的優異的檢測靈敏度。9.水產品中副溶血性弧菌檢測應用驗證隨機採集水產品市場的文蛤樣品3份，經國標gb4789.7-2013和本發明建立方法檢測驗證均不含副溶血性弧菌作為空白樣品。將過夜接種培養的副溶血弧菌(atcc17802)的菌懸液100ul分別加入3份空白樣品的勻漿中，經國標gb4789.7-2013和本發明建立方法檢測驗證副溶血性弧菌均為陽性。從市場上採集扇貝、文蛤、牡蠣、對蝦樣品30個，採用本發明建立方法進行檢測，同時參考國標gb4789.7-2013方法對樣品進行定性鑑定。採用本發明方法檢出陽性樣品6個，與國標gb4789.7-2013方法檢測結果一致。而且，本發明方法檢測時間可由12小時以上大幅縮短1小時內，操作過程簡化，耗費試劑量很少，大大減少了人力物力的消耗。以上結果很好的驗證了本發明方法的應用可行性。綜上所述，本發明建立了新型比色檢測水產動物病原微生物的方法、提高環介導等溫擴增技術的檢測效率和準確性。為快速檢測與鑑定水產品中病原微生物、有效及時控制和預防疾病傳播、預防食用水產品中毒提供技術支持，適合在邊境口岸、食品廠、基層獸醫站和養殖場中進行快速檢測，對有效控制水產品中病原微生物的傳播和早期診斷，保證水產品質量安全意義重大，具有廣闊的應用前景。該發明可望應用於水產品生產、流通和消費領域的快速檢測微生物，並可望在食品質量安全檢測部門用於大量樣品中汙染樣品的快速篩選工作。sequencelisting中國水產科學研究院東海水產研究所基於納米金變色響應等溫核酸擴增的副溶血性弧菌檢測法20176patentinversion3.5120dnaartificialsequencetlh-f31gcgcaaggttacaacatcac20220dnaartificialsequencetlh-b32gcgtgacattccagaacaca20340dnaartificialsequencetlh-fip3cgcgttcacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcga40440dnaartificialsequencetlh-bip4ttggacatcaaccgctcatcgtgacgctgcacactcagag40518dnaartificialsequencetlh-lf5tcgggcgcagaagttagc18623dnaartificialsequencetlh-lb6ctgtcgattacatgtacacccac23當前第1頁12