蛋白酶抑制劑在保護胰腺細胞功能中應用的製作方法
2023-07-26 02:07:56 1
專利名稱：蛋白酶抑制劑在保護胰腺細胞功能中應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(KPI/AβPP)，特別是涉及KPI/AβPP的胰腺細胞保護功能，及其在生產用於預防和治療胰腺損傷性疾病特別是急性胰腺炎的藥物中的應用。
背景技術：
與牛胰蛋白酶抑制劑相似，來源於人澱粉樣β蛋白前體(amyloid β-proteinprecursor，AβPP)的Kunitz型蛋白酶抑制劑區域(Kunitz-type proteinase inhibitordomain，KPI)是一種能夠與絲氨酸蛋白酶結合併抑制絲氨酸蛋白酶活性的肽。
作為一種由61個胺基酸組成的多肽，Kunitz型蛋白酶抑制劑(以下簡稱KPI/AβPP或KPI)分子量相對較小且結構穩定。Kunitz型蛋白酶抑制劑區域(簡稱KPI或KPI/AβPP)對絲氨酸蛋白酶家族有廣泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、彈性蛋白酶和凝血因子VIIaIXa Xa XIa XIIa等(例如參見美國專利6,613,890)。作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑和活性藥物成分，KPI/AβPP的基本作用在於將病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，緩解與絲氨酸蛋白酶活性升高有關的臨床症狀，通常可用於預防和治療心肺轉流術(CPB)後的大出血，CPB誘導的炎性反應以及促進傷口癒合等。
然而，迄今為止尚未見有關KPI/AβPP對胰腺細胞的保護功能以及使用KPI/AβPP作為用於預防和治療胰腺炎症性疾病特別是急性胰腺炎的藥物的報導。
發明目的本發明的一個目的是提供KPI/AβPP在生產用於預防和治療胰腺細胞損傷性疾病的藥物中的應用。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的KPI/AβPP是以DNA重組技術製備的。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的KPI/AβPP是人源的。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的胰腺損傷性疾病選自急性和慢性胰腺炎。
本發明的另一個目的是提供一種由KPI/AβPP或其類似物以及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物，及其在生產用於保護胰腺細胞、預防和治療胰腺細胞損傷性疾病的藥物中的應用。
圖1顯示KPI/AβPP對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺病理組織學改變的影響(所有組織切片均使用放大10-20倍的普通光學顯微鏡觀察)。其中3a為空白組；3b為模型組；3c為小劑量KPI組；3d為中劑量KPI組；3e為大劑量KPI組；3f為陽性對照藥物組發明內容本發明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(簡稱KPI或KPI/AβPP)，特別是涉及KPI/AβPP的胰腺細胞保護功能，及其在生產用於預防和治療病理性胰腺損傷相關疾病的藥物中的應用。本發明進一步涉及由作為基本活性成分的KPI/AβPP及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
可以利用常規的DNA重組和分子克隆技術製備重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKPI/AβPP)。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的rhKPI/AβPP可以是由原核、真核或酵母表達系統產生的。然而，為了本發明目的，優選的表達系統是巴斯德畢赤酵母表達系統。
以下簡單地描述使用優化的發酵培養條件，在80L發酵罐中工業化大規模生產rhKPI/AβPP的方法。
(1)酵母表達載體的構建以人胎盤組織來源的基因組DNA為模板，使用合成的引物15′-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3′和引物25′-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3′，經聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到長度約200bp的產物。酶切後與用同種酶消化的pPICZα載體連接，得到重組質粒pPICZα/prekpi。然後，分別合成一段寡核苷酸單鏈5′-TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3′和5′-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3′(其中包括編碼KPI氨基端四個胺基酸和α因子信號肽切割位點Lys-Arg的密碼子)。用PstI和XhoI消化重組質粒pPICZα/prekpi並與退火後的寡核苷酸雙鏈連接，得到重組質粒pPICZα/kpi。酶切分析和測序鑑定表明，pPICZα/kpi，重組質粒攜帶了預期的α因子信號肽和rhKPI/AβPP基因序列。
(2)重組質粒的轉化、陽性克隆的篩選和表達採用電轉化法將pPICZα/kpi轉化到酵母菌株X-33中。在YPD zeocin陽性培養基中28℃培養36小時後，挑取單克隆菌落接種於BMGY培養基中，待細菌處於對數生長期(OD600＝2～6)時，重懸於BMMY培養基中繼續培養。每隔24小時補加100％甲醇至終濃度為0.5％，以誘導rhKPI/AβPP的表達。誘導後，每隔24小時取上清，用胰蛋白酶和底物鹽酸苯甲醯-精氨酸-4-硝基醯基苯胺進行活性測定，篩選相對高表達量的菌株。
(3)大規模發酵工藝將高密度的(OD600＝10)酵母工程菌接種於含甘油(5％，V/V)加痕量鹽(4.34ml PTM1/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培養基中，在溫度28℃、pH3.3、溶解氧濃度20％、攪拌速度600轉/分鐘，罐內壓力12psi條件下，在發酵罐罐內發酵培養30小時。當溼細胞重量＞180～220g/L時，以漸增的速度添加含1.2％PTM1的100％甲醇，誘導rhKPI/AβPP的表達，其甲醇補加速率為3.6ml/小時/L→7.3ml/小時/L→10.9ml/小時/L，直至發酵結束。
(4)表達產物的純化70L發酵液離心取上清，用NaOH(1mol/L)調pH4.0，添加NaAc-HAc緩衝液(終濃度為20mmol/L)和去離子水稀釋後，通過預先用緩衝液A(20mmol/L NaAc-HAc，pH4.0)平衡過的Sepharose SP陽離子交換柱。然後連續加樣，檢測穿透液的活性，待樹脂飽和後用3倍於柱體積的緩衝液A洗柱。用緩衝液B(20mmol/L NaAc-HAc加1mol/L NaCl，pH4.0)洗脫。洗脫液用3000(3K)中空纖維柱除鹽和濃縮。
(5)表達產物的活性測定以胰蛋白酶活性抑制方法測定表達產物的活性。將如上純化的rhKPI/AβPP稀釋成不同濃度並與同濃度的胰蛋白酶反應，加入底物(鹽酸苯甲醯-精氨酸-4-硝基醯基苯胺)後測定殘餘的胰蛋白酶量。結果可見，如上得到的rhKPI/AβPP對胰蛋白酶有明顯的可逆性抑制作用。
雖然急性胰腺炎發病機制目前尚未完全闡明，但近年來大量研究表明，急性重症胰腺炎的發病與胰酶自身消化、微循環障礙、胰管屏障的破壞、氧自由基、炎症遞質及多種細胞因子的作用均相關，而細胞因子網絡和免疫功能紊亂很可能是胰腺炎從局部病變迅速發展為全身炎症反應症候群(SIRS)和多器官衰竭(MOF)的直接原因(戴虹 唐劍興，大劑量烏司他汀對大鼠急性胰腺炎腫瘤壞死因子-α及其受體表達的影響，華北煤炭醫學院學報，2004，6(1)20-21)。
如前所述，KPI/AβPP是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，經研究證實其主要作用有對多種蛋白酶、糖和脂水解酶的活性有明顯的抑制作用(YoshidaK，Tokif F.Antienzyme preparations in the treatment of acute pancreatitis，Nippon Rinsho，1990，48(1)165)。穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放。ANP發生後，由於溶酶體膜、線粒體膜受到損傷，導致細胞呼吸功能受損，最後引起多臟器功能衰竭。因此，KPI用於ANP後，可穩定溶酶體膜，減少細胞損傷，具有保護器官作用。抑制炎性介質和細胞因子的釋放，從而減輕ANP後全身炎症反應並預防多器官功能損害(秦仁義，王春友，鄒聲泉，烏司他丁治療急性胰腺炎的實驗及臨床研究，中國普通外科雜誌，2001，10(4)2921)。ANP是一種全身炎症反應過程，首先是胰蛋白酶被激活，之後再激活其它酶，如胰脂肪酶、胰澱粉酶、糜蛋白酶、磷脂酶等。由於胰酶的大量釋放，導致胰腺及周圍組織壞死，壞死組織及大量有毒物質經吸收後會引起全身劇烈的炎性反應(吳雅莉，海燕，田炳章，烏司他丁對急性壞死性胰腺炎模型大鼠血清澱粉酶、腫瘤壞死因子的影響，中國藥房2004 15(9)535-536)。
為了深入研究KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)對動物(大鼠)胰腺細胞的保護作用，在本實驗中，我們觀察了KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)對活體動物(大鼠)急性胰腺炎動物模型的血清中澱粉酶含量及生化指標的影響，同時對各實驗組動物的胰腺組織進行了病理學觀察和統計學分析。在使用急性壞死性胰腺炎動物模型完成的實驗研究中發現，與對照組相比，接受KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)治療的實驗組動物血清澱粉酶水平較模型組明顯降低且隨著用藥劑量的加大減低水平愈加明顯(詳見實施例1)。這一結果表明，rhKPI/AβPP可有效地抑制胰酶的分泌和釋放，並因而使胰腺病理變化減輕。提示抑肽酶可以顯著地抑制急性胰腺炎是胰腺的高分泌狀態，使胰腺自身消化程度明顯減輕。
另外，我們的病理組織學檢查結果可見，實驗組動物胰腺細胞水腫和炎細胞浸潤程度較模型對照組明顯減輕(詳見實施例2)。
再者，本發明人還分別就KPI/AβPP對(1)腹腔滲液生成量的影響；(2)血清中腫瘤壞死因子和一氧化氮(NO)含量的影響；(3)血清和胰腺組織勻漿液中SOD及MDA含量的影響；(4)電鏡下胰腺細胞亞細胞結構(細胞核、溶酶體、線粒體、中性粒細胞)變化的影響；(5)胰腺細胞線粒體琥鉑酸脫氫酶(SDH)活性及溶酶體酸性磷酸酶(ACP)活性的影響等，這些研究結果同樣證明了KPI/AβPP對胰細胞的顯著地變化作用(數據未示出)。
本發明的這些研究結果表明，KPI/AβPP可有效地抑制澱粉酶和改善胰腺組織的病理變化，從而起到治療急性壞死性胰腺炎作用。進而可以初步認定，KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)有可能作為一種新的胰腺細胞保護劑，用於預防和治療急性胰腺細胞損傷性疾病，特別是急性壞死性胰腺炎。
因此，本發明的一個目的是提供KPI/AβPP在生產用於預防和治療急性胰腺壞死性胰腺疾病的藥物中的應用。
根據本發明的一個優選實施方案，本發明的另一個目的是提供一種具有胰腺細胞保護活性的基礎上由KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
用於本發明的可以是具有天然野生序列的生物學活性多肽，但也可以是為改善產物的生物學活性，或為提高產物的產率或藥物動力學性質目的而在基因水平上進行了必要的修飾的KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)類似物或突變體。這裡所說的修飾可以是內部或N末端個別或部分胺基酸的加入、缺失或取代。
本發明涉及的KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)可以單獨使用，也可以作為有各種不同劑型的藥物組合物的形式使用。可以使用製藥工業領域已知的方法(參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以適於口服或非口服給藥的單位計量形式製備本發明的藥物組合物。例如，可將作為活性成分的有效量的KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)與醫藥上可接受的載體或賦形劑均勻地混合，製成溶液或懸浮液形式的適於靜脈內、肌肉內、器官腔內、皮內和皮下等胃腸道外途徑給藥的藥物組合物；或者也可以製成片劑、膠囊劑、粉末劑、乳劑、顆粒劑等形式的適於經胃腸道途徑給藥的藥物組合物。
根據本發明的藥物組合物，其中所使用的醫藥上可接受的載體或賦形劑將依據所製備的本發明藥物組合物的劑型而有不同的選擇。
適於胃腸道外給藥的製劑可含有無菌水或鹽水、聚乙二醇、油和氫化萘等常用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，以控制活性成分的緩慢釋放。在其他適於胃腸道外給藥的製劑中，還包括含有水楊酸的直腸給藥製劑和含有甘膽酸鹽的含服給藥製劑。
具體地說，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑，澱粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結劑，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、甜味劑、香料、分散劑等輔助成分，以常規方法製備片劑。
可以使用乳糖和甘露醇等賦形劑，澱粉等崩解劑，明膠等黏結劑，以常規方法製備顆粒劑。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等賦形劑，以常規方法製備粉末劑。使用明膠、水、蔗糖、阿拉伯膠、山梨醇、甘油、結晶纖維素、硬脂酸鎂和滑石等，以常規方法製備膠囊劑。
可以使用水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶劑，苯甲酸鈉，水楊酸鈉和氨基甲酸乙酯等增溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲劑，青黴素和鏈黴素及其他抗真菌劑等抗生素，苯酚、甲酚、對位羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常規方法製備注射劑。
在任何情況下，所說的可注射製劑均應是無菌和可流動並適於通過注射器注射給藥的。另外，在生產、運輸和儲存條件下，所說的製劑還必須是穩定的，並且能夠對抗細菌和真菌等微生物的汙染。
另外，也可使用製藥工業中已知的方法和輔助成份，將本發明的藥物組合物製成微膠囊劑或脂質體包裹劑。
本發明的藥物組合物除含有作為基本活性成分KPI/AβPP(rhKPI/AβPP)或其類似物或突變體外，還可含有一種或多種合成的、天然的或重組來源的具有協同或輔助作用的其他活性成分。這些活性成分包括但不只限於具有免疫刺激或調節活性、病毒複製抑制活性、功能性胰腺細胞修復活性的其他成分，例如可以是幹擾素、白介素、胸腺素、(胰)細胞生長因子和成纖維細胞生長因子等。
本發明的藥物組合物對功能性胰腺細胞具有良好的保護作用。雖然有關作用機理目前尚不明確，但我們推測可能與KPI/AβPP或其類似物作用於胰腺細胞並抑制細胞膜表面上的絲氨酸蛋白酶類有關。
基於以上的描述，本領域技術人員完全可以理解到，KPI/AβPP除具有其固有的蛋白酶抑制活性並因此可用於治療絲氨酸活性升高相關疾病外，也可以用於預防和治療病理性胰腺細胞損傷及相關疾病。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的KPI/AβPP或其類似物通過抑制胰腺細胞膜表面的絲氨酸蛋白酶提高胰腺細胞的存活性。
一般說來，本發明藥物組合物的給藥劑量約為0.01-500mg/kg，較好為0.1-100mg/kg。可以以口服、皮下或肌肉注射、腹腔注射、靜脈內注射等多種途徑藥給。當然，本領域技術人員可以理解到，為有效地治療病人所需的確切的給藥劑量，應根據待治療的病症或病理狀態的性質、嚴重程度、病人的年齡、體重和一般健康狀態，所用藥物的劑型、病人對所用藥物的敏感性和耐受性，以及所使用給藥途徑等因素，按照個體化的原則由臨床醫生確定。
具體實施例方式
下列實施例旨在進一步舉例說明而不是限制本發明。本領域技術人員可以理解到，在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明的任何平行改變和改動都將落入本發明的待批權利要求範圍內。
急性壞死性胰腺炎(ANP)是普外科最常見的急腹症之一，是由胰腺廣泛出血、壞死而引起的一種嚴重疾病。目前，急性壞死性胰腺炎的發病率呈現逐年升高的趨勢，其確切的發病機制尚未完全闡明。而且，缺乏有效地治療手段。下列實施例舉例說明rhKPI/AβPP對急性壞死型胰腺炎動物(大鼠)模型的治療作用，其中包括對胰腺炎相關酶活性和病理組織學的影響。
實施例1KPI/AβPP對實驗性大鼠急性壞死性胰腺炎的治療作用3.5％牛磺膽酸鈉(0.1ml/100g體重)逆行注入大鼠胰膽管內，以造成ANP模型。將實驗動物分為假手術組、ANP模型組、KPI低中高劑量治療組和抑肽酶(作為對照藥物)組。觀察並比較各組動物於給藥後血清澱粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)水平變化。
實驗的具體方法學和實驗結果描述如下。
(1)急性胰腺炎動物模型的製作動物(Wister大鼠，平均體重250克，雌雄各半)禁食並自由飲水12小時後，3％戊巴比妥麻醉下，經上腹部正中切口進入腹腔，暴露膽胰管，在其近端和遠端均以動脈夾或一號絲線暫時結紮，將帶有四號針頭的1ml注射器沿十二指腸壁漿肌層穿刺距離膽胰管開口0.3～0.4處的膽管，注入3.5％的牛磺膽酸鈉(Sigma公司產品)(0.1ml/100g)。以0.2ml/分鐘速率注射完畢後4分鐘，去除結紮線並縫合手術傷口。對照組僅牽引胰腺和十二指腸並注射等體積生理鹽水後關腹。
(2)實驗分組與用藥60隻大鼠隨機分為6組，每組10隻假手術組(NS組)；模型組(ANP+NS組)；KPI低、中、高治療組(ANP+KPI組)。陽性對照藥抑肽酶組(ANP+BPTI組).KPI低、中、高治療組於模型建立後經股靜脈注射KPI分別為(4萬KIU/kg、8萬KIU/kg、16萬KIU/kg KPI/AβPP)，抑肽酶組注入(2萬KIU/kgBPTI)，假手術組和模型組注入等量生理鹽水。每8小時給藥一次。於術後48h腹主動採血，3500rpm，離心10分鐘取血清，使用全自動生化分析儀(德國凱斯公司)檢測血清澱粉酶、脂肪酶。
(3)實驗結果如下列表1-2以及圖1-2所示。其中數據以x±s表示，並對組之間組間差異進行t檢驗分析。
A、KPI對急性壞死性胰腺炎模型大鼠血清澱粉酶水平的影響由下列表1所示的結果可以看出模型組與假手術組比較，大鼠血清澱粉酶含量明顯增高(P＜0.001)，而且KPI中高劑量組均可明顯降低大鼠血清澱粉酶含量，(P＜0.05、P＜0.001)，與模型組比較差異顯著，其作用與陽性藥抑肽酶組作用相當。
表1 KPI/AβPP對急性壞死性胰腺炎大鼠血清澱粉酶的影響(n＝10，x±s)
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與模型組比較B、KPI/AβPP對急性壞死性胰腺炎模型大鼠血清脂肪酶水平的影響由下列表2所示的結果可以看出模型組與假手術組比較，大鼠血清脂肪酶含量明顯增高(P＜0.001)，KPI中高劑量組均可明顯降低大鼠血清澱粉酶含量，(P＜0.05、P＜0.001)，與模型組比較差異顯著，其作用與陽性藥抑肽酶組作用相當。
表2 KPI/AβPP對急性壞死性胰腺炎模型大鼠血清脂肪酶水平的影響(n＝10，x±s)
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與模型組比較實施例2KPI/AβPP對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺病理組織學改變的影響採血後，斷頸處死動物。在同一部位分離胰腺組織，並用10％甲醛溶液常規固定分離的胰組織，常規石蠟包埋後製作病理切片進行病理組織學檢查。
光學顯微鏡下可見，空白組胰腺組織結構清晰，小葉間隔為薄而疏鬆的結締組織。胰腺實質的外分泌部及內分泌部結構正常，外分泌的細胞染色較深，染色淺的為胰島，由許多內分泌細胞組成，胞漿淺粉色，核圓染色深(圖1a)。
模型組胰腺組織呈大片凝固性壞死，小葉結構破壞，界限模糊不清，間質小血管壁也有壞死，(這是造成胰腺出血的原因)。在壞死的胰腺組織內及周圍可見大片出血灶，中性及單核細胞浸潤。絕大部分胰腺細胞壞死，呈片狀，細胞輪廓消失，可見核固縮，核碎裂及溶解消失(圖1b)。
小劑量組胰腺組織結構破壞嚴重，界限不清。可見大片壞死灶及大量炎細胞浸潤，胰腺組織高度充血水腫。大量的腺泡壞死，僅見部分胰腺細胞殘存，殘存的胰腺細胞結構不清。細胞核固縮，胞漿深染，有的胰腺細胞核消失，胞漿疏鬆，形成溶解性壞死灶(圖1c)。
中劑量組胰腺結構清楚，無壞死。胰腺小葉界限尚存在，但可見瀰漫的葉間間隔擴張，小葉間質疏鬆、水腫較重，透亮增加，瀰漫的並有少量炎性細胞浸潤(圖1d)。
大劑量組胰腺組織結構清晰，小葉間隔為薄而疏鬆的結締組織，可見間質輕微水腫，血管變化常不明顯。胰腺實質結構正常，無壞死，外分泌的細胞染色較深。其中淺染色區為胰島，由許多內分泌細胞組成，胞漿淺粉色，核圓染色深(圖1e)。
陽性藥物組光鏡下見胰腺細胞結構清楚，小葉界限明確，無壞死區，但小葉間質輕微疏鬆水腫。胰腺實質正常，外分泌部及內分泌部結構清晰，無明顯水腫，僅見少數血管擴張充血(圖1f)。
權利要求
1.Kunitz型蛋白酶抑制劑在生產用於預防和治療胰腺細胞損傷性疾病的藥物中的應用。
2.根據權利要求1的應用，其中所說的胰腺細胞損傷性疾病選自急性壞死性胰腺炎。
3.根據權利要求1的應用，其中所說的KPI/AβPP是以DNA重組技術製備的。
3.根據權利要求1的應用，其中所說的KPI/AβPP是人源的。
4.一種由Kunitz型蛋白酶抑制劑以及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物.
全文摘要
本發明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(KPI/AβPP)，特別是涉及KPI/AβPP的胰腺細胞保護功能，及其在生產用於預防和治療胰腺損傷性疾病特別是急性胰腺炎的藥物中的應用。
文檔編號A61P1/18GK101041073SQ200610016698
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月23日 優先權日2006年3月23日
發明者顏煒群, 張馨木, 賀巾超, 楊莉莉, 顏波群 申請人:吉林聖元科技有限責任公司