人增殖抑制基因－腺病毒表達載體的應用的製作方法
2023-07-26 02:17:01 2
專利名稱：人增殖抑制基因－腺病毒表達載體的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人的增殖抑制基因(human hyperplasia suppress gene，hHSG)腺病毒表達載體，尤其涉及該人HSG腺病毒表達載體在誘導多種腫瘤細胞的生長抑制和誘導凋亡活性上的用途，並且本發明還涉及該HSG腺病毒表達載體對放、化療藥物及熱療的協同作用。
背景技術：
惡性腫瘤已經成為人類死亡的第一、二位殺手，惡性腫瘤的發病率明顯上升。攻克腫瘤是全人類亟待解決的重大課題之一。近年來腫瘤的生物治療(包括免疫治療和基因治療)、特別是基因治療的應用研究已成為生命科學研究的熱點。基因治療由於能針對腫瘤組織內特有的基因變異情況進行修復或促進腫瘤細胞死亡，具有廣闊的應用前景；特別是隨著一些高效而具有組織/細胞選擇性的給藥載體的成功構建和一些新的更具有殺傷力的目的基因的發現，使基因治療將有可能在21世紀成為常規而有效的治療手段。
一、針對抑癌基因的基因治療抑癌基因(tumor suppressor gene)，又稱抗癌基因(antioncogene)，根據其功能，該基因又可分為控制細胞增生的看門基因(gatekeeper gene)和維持基因完整的看管基因(caretaker gene)。
研究表明，幾乎一半的人類腫瘤均存在抑癌基因的失活，可見抑癌基因的失活與腫瘤的生長有著密切的關係。因此，將正常的抑癌基因導入腫瘤細胞中，以補償和代替突變或缺失的抑癌基因，達到抑制腫瘤的生長或逆轉其表型的抑癌基因作為治療惡性腫瘤的策略，必將成為腫瘤基因治療中的一種重要的治療模式。
p53基因是1979年Lane和Grawford在SV40大T抗原基因轉染的細胞中發現的(Nature 1979，278(5701)261-263)，是目前研究最廣泛和深入抑癌基因。其正常功能的喪失，最主要的方式是基因突變。迄今已發現的10000種人類腫瘤的2500種基因突變中，p53蛋白的393個胺基酸就有280個以上發生了突變。由於這種點突變，直接的後果是導致胺基酸的改變，最終產生沒有活性的p53蛋白，失去抑癌作用。
鑑於人類惡性腫瘤p53基因突變率較高，以正常p53基因治療腫瘤就自然成了研究的熱點。大量的體內外試驗已證實，引入p53基因確實可以抑制腫瘤細胞的生長，誘導其出現凋亡。如2002年Kunihisa等(Cancer Ther2002，1247-252)利用電穿孔的方法，把野生型p53基因導入人類前列腺癌細胞PC-3中，發現腫瘤細胞形態改變，細胞生長速度降低，裸鼠致瘤性消失，進一步研究發現腫瘤抑制是因為其凋亡增加所致。此後，研究者又相繼將p53基因導入肝癌、口腔癌、肺癌、頭頸部腫瘤以及乳腺癌等腫瘤細胞，同樣發現類似的結果。但不同的細胞類型，p53基因的抑制作用各不相同。Ramesh等(Mol Ther2001，3(3)337-350)用脂質體作載體將p53導入肺的原位癌和轉移癌中，Hagivara等(Nippon Rinsho；2001，59(1)81-84)將載有野生型p53的腺病毒載體直接進行瘤體內注射均可使動物的生存期明顯延長。
除了直接的抑瘤作用外，正常p53基因的導入還可以誘導癌細胞對化療藥物及放療的敏感性，加快腫瘤細胞的凋亡。如Spitz等(Clin Cancer Res.1996，21665-1671)研究了腺病毒介導的p53基因與放射線對小鼠皮下異體移植SW260結直腸癌的作用，發現應用這兩種治療措施小鼠腫瘤生長均有明顯抑制。一般來講，小鼠再生的腫瘤僅需2天就可長至1000mm3，若受到5Gy的放射治療需要15天，如果再施以p53基因治療，則需要37天。說明p53基因確可提高小鼠對放射線的敏感性。Roth等在H1299(p53缺陷)肺癌，Nielsen等在頭頸部腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均得出了同樣的結論(Clin Cancer res；1998，4835-846)，在聯合治療中，腫瘤的體積比單獨使用其中任一方法均可減少60％-90％。目前，P53已經作為有效的腫瘤基因治療藥物被批准應用於臨床。
二、關於HSGHSG是我們課題組在前期工作中利用mRNA差異顯示技術從正常血壓和高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中發現的新基因(中華醫學雜誌；1997，77823-828)。根據大鼠cDNA序列，利用PCR和RACE反應，我們又克隆了人的HSG，其長度為4550bp，編碼757個胺基酸，定位於人的1號染色體短臂36.3位置上，此區域為許多腫瘤的突變高發區，GenBank登錄號為U 43734。已證明該基因與高血壓發病的相關，該基因能明顯抑制血管內膜增厚，防止管腔狹窄的發生。
三、表達載體目前基因治療中常用的表達載體主要分為真核表達質粒和病毒表達載體，雖然二者都能有效地使外源基因在細胞中表達，但由於真核表達質粒在體內難以定嚮導入靶細胞，故在基因治療應用上受到限制。而病毒表達載體是利用宿主細胞表面天然存在的受體將外源基因定嚮導入靶細胞，能轉導不分裂的細胞，甚至能穩定整合到宿主染色體上，如反轉錄病毒和腺相關病毒(AVV)可以整合到宿主基因組，其轉導率幾乎可達100％，並可獲得持續的表達。但是反轉錄病毒與其他病毒相比又是不穩定的，純化和濃縮後的反轉錄病毒會明顯喪失感染能力，這都限制了反轉錄病毒在活體內應用的進一步開展。另外，逆轉錄病毒僅能感染複製細胞，純化的DNA轉染的對象必須是複製細胞，而非複製細胞則不被感染。腺相關病毒(AVV)的整合效率不及反轉錄病毒，但最近的研究表明，它可直接注射於患者體內，是攜帶基因產生表達產物治療疾病。有人把攜帶有因子IX基因的腺相關病毒注射到一個患有B型血友病的病人肌肉中，產生了較好的效果。而對它的進一步研究也正在進行中。另外，單純皰疹病毒在中樞神經系統疾病中特別有用，但其複雜的複製特性和很難獲得重組病毒的原液，均限制了它的應用前途。
腺病毒(AdV)載體系統由於其基因組較易操作，具有可大量製備、表達量高及不整合等優點因而在目前的基因治療中倍受青眯。腺病毒系統已被廣泛應用於表達人體和非人體蛋白，腺病毒能感染很大範圍的哺乳動物細胞，除了一些淋巴細胞外，腺病毒可以感染其他所有類型的細胞，並在非複製細胞中研究基因表達，腺病毒系統為最佳。腺病毒系統已用於多項臨床實驗，取得了預期臨床效果。
發明內容
本發明的目的在於提供人增殖抑制基因(hHSG)-腺病毒表達載體在製備抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡藥物中的應用。hHSG腺病毒表達載體在對多種組織來源的腫瘤治療，包括上皮來源的及間葉組織來源的惡性腫瘤都有明顯的抑制作用。
本發明的hHSG腺病毒表達載體可以抑制實體瘤，如肺癌，肝癌，乳腺癌，大腸癌及宮頸癌等，另外也可以抑制非實體瘤的生長，如造血系統來源的腫瘤。
本發明的進一步提供了人增殖抑制基因-腺病毒載體在製備與放射治療物聯合給藥來抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。其中所述的放射治療物是各種用於腫瘤治療的放射物，優選銫源放射物。
本發明還進一步提供了人增殖抑制基因-腺病毒載體在製備與化療物聯合給藥來抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。該化療物可以是任何一種化療藥物，優選VP-6或放線酮。
本發明還提供了人增殖抑制基因-腺病毒載體在製備與熱療聯合應用來抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
我們通過大量的體內或/和體外實驗發現hHSG對多種腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用。另外免疫組化和原位雜交結果顯示，多種腫瘤組織與其相應的正常組織比較，HSG的表達水平明顯降低。
我們又發現在hHSG腺病毒表達載體與放療共同作用後，腫瘤細胞凋亡及生長抑制的比例也明顯高於二者單獨的作用。甚至強於P53與放療藥物的協同作用。並且hHSG腺病毒表達載體與化療藥物，如VP-16、放線菌酮共同作用後，腫瘤細胞凋亡及生長抑制的比例明顯高於二者單獨的作用。甚至強於P53與化療藥物的協同作用。
我們又發現在hHSG腺病毒表達載體與熱療共同作用後，腫瘤細胞凋亡及生長抑制的比例也明顯高於二者單獨的作用。
因此，hHSG腺病毒表達載體有望成為腫瘤治療上的新藥物。
圖1為MTT方法檢測HSG重組腺病毒對腫瘤細胞(MCF-7)增殖能力的抑制作用其中Adv-hHSG(100)代表Adv-hHSG為100個有感染能力的病毒顆粒，Adv-hHSG(200)代表Adv-hHSG為200個有感染能力的病毒顆粒。
圖2為HSG對腫瘤細胞HT-29的體外誘導凋亡作用未感染組加入生理鹽水；對照組加入空載體adv；HSG組加入人HSG重組腺病毒。
左上象限為晚期凋亡細胞或非凋亡方式死亡細胞百分比；左下象限為存活細胞百分比；右上象限為中期凋亡細胞百分比；右下象限為早期凋亡細胞百分比。每個象限所標的數字為該象限中出現的細胞百分比。
圖3人HSG重組腺病毒對HT-29細胞(左欄)及A549細胞(右欄)在裸鼠體內成瘤及生長速度的影響。
圖4為人HSG重組腺病毒與P53對腫瘤細胞周期的影響其中箭頭所指的右峰代表處於G2/M期細胞的比例。
圖5為HSG與P53比較其對放療藥物的協同作用具體實施方式
實施例1.人HSG腺病毒重組載體的構建細胞總RNA的提取利用GIBCO-BRL公司的TRIZOLTM試劑。取K562(紅白血病細胞系，來自ATCC)5×106，離心後收集，加入1ml TrizolTM試劑，反覆吹打破碎細胞，室溫靜置5分鐘後，加入0.2ml氯仿，充分混勻，4℃12000rpm 15分鐘，收集上清用異丙醇沉澱，70％乙醇洗一次，室溫乾燥後，總RNA重懸於DEPC處理的H2O中，分光光度計(Beckman 640)定量後用於cDNA第一鏈的合成。cDNA第一鏈的合成按照Gibico公司SUPERSCRIPTTM說明書進行。合成後cDNA第一鏈於-80℃冷凍保存或直接用於PCR反應。
HSG PCR以一定量的cDNA為模板，加10×buffer(含Mg2+)2.5ul，4ul10mM dNTP，HSG特異的上下遊引物各0.5ul，0.25ul Taq，最後加無菌水至25ul。引物上遊5『ggaattccatgtccctgctcttctctcga 3』(下劃線部分為EcoR I酶切位點)；下遊5』atttaagcttctatctgctgggctgcaggta 3』(下劃線部分為HindIII酶切位點)。
循環條件先94℃變性4min，然後進入35輪變性→退火→延伸(94℃，1min→60℃，1min→72℃，2min)循環，最後在72℃反應7min。GAPDH的PCR循環條件為94℃，15sec→58℃，15sec→72℃，40sec進行25輪循環，最後在72℃反應7min。在1％的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑑定並照相，利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit回收HSG PCR產物連接到腫瘤所T-Vector(promega公司)，進行亞克隆，以備測序。T-Vector-HSG PCR產物測序由上海基康公司完成。
人HSG重組腺病毒載體(Adv-hHSG)分別用EcoR I和HindIII處理pAC16質粒(本元正陽公司)和含有序列正確的HSG T-Vector，純化和回收相應的片斷後，用T4連接酶將HSG基因連接到pAC16質粒上，篩選陽性克隆，並通過測序確認後，將其再與Ad5(腺病毒骨架)(本元正陽公司)進行重組，在293A細胞中包裝、擴增，得到HSG重組腺病毒用於下面的實驗。
實施例2.人HSG重組腺病毒對腫瘤細胞增殖指標的測定採用MTT法進行分析。收集常規培養的腫瘤細胞，如K562、Hec-1A(子宮內膜癌)，HeLa(宮頸癌)，A549(肺腺癌)，MCF-7(乳腺癌)及HT-29(大腸癌)等(上述細胞系均購自ATCC)，按照700cells/孔接種96孔板，培養在含10％胎牛或小牛血清的DMEM培養基中，培養24h以後，棄去上清，每孔再分別加入含腺病毒(Adv或Adv-HSG)，試驗組和對照組均做6重複孔，2×105pfu的DMEM 0.1ml，繼續培養至24hr開始每天進行檢測每孔加入濃度為500μg/ml的MTT，培養4-6h以後，1900rpm 15min離心棄上清，分別加入PBS pH 7.2的緩衝液及細胞裂解液各0.1ml，37℃孵育過夜後，在BioTek Elisa Reader上讀取OD570nm的吸收值。
本實驗選用了上述6種人的腫瘤細胞系，經MTT法檢測表明，無論是造血系統來源的腫瘤細胞(K562)還是上述各種上皮來源的腫瘤細胞，HSG重組腺病毒均可明顯抑制它們的生長，即從感染HSG重組病毒36小時開始，其細胞生長抑制率即可達到20％-30％，到了96小時其抑制率可達到70％-80％，與對照組(加入空載體Adv)及非感染組(不加入任何病毒顆粒)相比，P＜0.05-P＜0.001。(見表1及圖1)。
表1.人HSG-重組腺病毒對下列腫瘤細胞增殖抑制率的影響
說明(1)每種細胞在不同時間的抑制率是以該時間點的非感染組做比較的，故在圖中沒有顯示。
(2)36h、72h和96h下面所對應的百分比數為該時間點的抑制率。
實施例3.人HSG重組腺病毒對腫瘤細胞周期及細胞凋亡分析按2×105cells/孔將上述細胞接種於6孔板，培養24小時後感染腺病毒(Adv或Adv-HSG)2×107pfu，分別在24小時、48小時和72小時收集腫瘤細胞，用PBS pH7.4洗滌後，用Annexin V PI染色檢測轉染後細胞凋亡情況。按AnnexinVPI雙染凋亡檢測試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測。用於細胞周期檢測的細胞，先於70％乙醇、4℃固定24小時以上，經0.01M PBS洗滌後重懸於0.5ml的PBS中，RNaseA消化30min後進行PI染色，用FACScan檢測細胞的DNA含量，ModFitLT V2.0計算機軟體進行細胞周期和凋亡的分析，每個樣品分析104個細胞。
凋亡檢測結果顯示，腫瘤細胞系(HT-29、Hec-1A、HeLa和A549)在感染腺病毒24hr、48hr和72hr後，人HSG重組腺病毒(圖2中的HSG組)均可明顯地誘導這些腫瘤細胞的凋亡。即從感染HSG重組病毒48小時開始，其細胞生長凋亡率可達到30％，到了72小時其凋亡率達到高峰(可達到60％-80％，與腺病毒空載體(對照組)及非感染組相比，P＜0.05-P＜0.001)(見表2及圖2)表2 人HSG重組腺病毒誘導腫瘤細胞凋亡百分比分析
說明24h，48h，72h下列所對應的百分比數為該時間點的抑制率。
通過流式細胞儀對人腫瘤細胞系(HT-29、Hec-1A、HeLa和A549)的不同時間(24hr、48hr和72hr)細胞周期的檢測分析發現，HSG重組腺病毒對所檢測的腫瘤細胞的細胞周期均有影響，表現為G2-M期細胞百分比明顯增高。實驗組G2-M期細胞百分比與對照組相比，可增加30％-50％，p＜0.05-P＜0.001(見表3).
表3 HSG重組腺病毒對腫瘤細胞細胞周期的影響(G2-M期細胞百分比)
說明24h，48h，72h下面所對應的百分比數為該時間點的G2-M期細胞百分比。
實施例4.荷瘤動物實驗培養的HT-29和A549細胞計數後，繼續培養24hr，按每個細胞加入100pfu的濃度，將HSG重組腺病毒加入培養基中再培養12hr，胰酶消化，生理鹽水洗2-3次。取0.1ml(含5×106cells)接種於4周齡雌性Balb/C裸鼠小鼠腋下，以空載體作為對照，觀察小鼠成瘤情況，並每兩天測量腫瘤的大小，並觀察腫瘤變化及小鼠狀態。
結果顯示，與空載體及非感染組相比，感染HSG重組腺病毒組的成瘤率明顯減少，多數不成瘤，即使成瘤，其腫瘤生長速度明顯減慢.(見圖3)實施例5.人HSG重組腺病毒與P53重組腺病毒載體的活性比較分析按2×105cells/孔將上述細胞接種於6孔板，培養24小時後感染腺病毒(Adv、Adv-HSG或Adv-P53，即今又生(Adv-P53的商品名，深圳賽百諾公司研製開發)，為市售產品)2×107pfu/孔，分別在24小時、48小時和72小時收集腫瘤細胞，用PBS pH7.4洗滌後，用Annexin VPI染色檢測轉染後細胞凋亡情況。按AnnenixV PI雙染凋亡檢測試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測。用於細胞周期檢測的細胞，先於70％乙醇、4℃固定24小時以上，經0.01M PBS洗滌後重懸於0.5ml的PBS中，Rnase A消化30min後進行PI染色，用FACScan檢測細胞的DNA含量，ModFitLT V2.0計算機軟體進行細胞周期的分析，每個樣品分析2×104個細胞。
凋亡檢測結果顯示，腫瘤細胞系(HT-29和A549)在感染HSG重組腺病毒24hr、48hr和72hr後，HSG重組腺病毒均可明顯地誘導這些腫瘤細胞的凋亡，其抑制效應較P53強20-30％(見表4)。
表4.人HSG重組腺病毒與P53重組腺病毒載體誘導細胞凋亡活性比較分析
說明24h，48h，72h下面所對應的百分比數為該時間點的凋亡率。
通過流式細胞儀對人腫瘤細胞系(HT-29和A549)的不同時間(24hr、48hr和72hr)細胞周期的檢測分析發現，人HSG重組腺病毒對所檢測的腫瘤細胞的細胞周期均有影響，表現為G2-M期細胞百分比明顯增高，此效應基本等同於P53。(見圖4)
實施例6.HSG的放療協同效應腫瘤細胞系(HT-29和A549)在感染HSG重組腺病毒24hr後，用不同的放射劑量(銫源，分別為0，2，4，8Gy)照射細胞，在48小時收集腫瘤細胞。
結果顯示，隨著放射劑量的增加，HSG顯示出明顯的協同作用，較單純用放射線組比較，凋亡率可提高50-80％，較單純用HSG組比較，凋亡率可提高30％，這種協同作用同樣強於P53(增強20-30％)。(見表5及圖5)表5 HSG的放療協同效應(48小時凋亡率)
實施例7.HSG的化療協同效應腫瘤細胞系(HT-29和A549)在感染HSG重組腺病毒24hr後，用一定劑量的VP-16(足葉乙甙，0.5μg/ml，SIGMAG公司產品)或放線菌酮(0.5μg/ml，SIGMAG公司產品)作用於腫瘤細胞，分別在48小時收集腫瘤細胞。
結果顯示，隨著作用時間的延長，HSG顯示出明顯的協同作用。VP-16與HSG重組腺病毒合用後，較單純用VP-16組比較，凋亡率可提高40-50％，較單純用HSG組比較，凋亡率可提高20-30％。放線菌酮與HSG重組腺病毒合用後，較單純放線菌酮組比較，凋亡率可提高20-30％，較單純用HSG組比較，凋亡率可提高20％。這種協同作用同樣強於P53(見表6)。
表6 HSG的化療協同效應(48小時凋亡率)
實施例8.HSG的熱療協同效應腫瘤細胞系(HT-29和A549)在感染HSG重組腺病毒8hr後，用42℃水浴1小時後分別在48小時收集腫瘤細胞，與空載體及未感染組相比，通過細胞凋亡和細胞周期分析，探討HSG及P53的熱療協同作用。
結果顯示，在48小時，HSG顯示出明顯的協同作用，較不加熱組比較，凋亡率可提高20-50％，較單純用HSG組比較，凋亡率可提高20％，而P53組在24小時看不到協同作用，48小時出現協同作用，其效應等同或略強於HSG，但到72小時時幾乎見不到協同作用。(見表7)表7 HSG的熱療協同效應(48小時凋亡率)
權利要求
1.人增殖抑制基因-腺病毒表達載體在製備抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的腫瘤細胞為實體瘤細胞。
3.根據權利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的腫瘤細胞為非實體瘤細胞。
4.根據權利要求2所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的實體瘤細胞為肺癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞及宮頸癌細胞等。
5.根據權利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的人增殖抑制基因-腺病毒載體在製備與放射治療物聯合給藥來抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的放射治療物為銫源的放射物。
7.根據權利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的人增殖抑制基因-腺病毒載體在製備與化療物聯合給藥來抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的化療物為VP-6或放線酮。
9.根據權利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表達載體的應用，其中所述的人增殖抑制基因-腺病毒載體在製備與熱療聯合應用來抑制腫瘤細胞的生長和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人的增殖抑制基因(humanhyperplasia suppress gene，hHSG)腺病毒表達載體，它能夠有效誘導多種腫瘤細胞的生長抑制和誘導凋亡活性，並且該HSG腺病毒表達載體對放、化療藥物有很好的協同作用，在多種腫瘤基因治療中具有重要的應用價值。
文檔編號A61P35/00GK1834242SQ20051005521
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者邱曉彥, 陳光慧, 李志新, 馬大龍, 湯健, 毋麗娜 申請人:北京大學