一種保存磁小體的溶液及其應用的製作方法

2023-07-18 09:11:41

專利名稱：一種保存磁小體的溶液及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物材料應用領域，具體地，涉及一種保存磁小體的溶液及其應用。
背景技術：
磁小體(BMPs, Bacterial Magnetic Particles)是趨磁性細菌合成、分泌的一種新穎的超順磁性納米顆粒，主要由Fe3O4構成，且外部具有類細胞膜的脂膜包被。作為一種真正意義的生物礦化合成材料，自被發現以來，BMPs由於在基因治療方面表現出的巨大潛力，正受到越來越多研究人員的青睞。BMPs的成分純、形態獨特且細小均勻，通過多聚物連接核酸以後構成的基因傳遞複合物既可以在體外水平進行細胞轉染以提高轉染效率並降低轉染毒性，又可以在體內運送藥物或核酸進行癌症治療或者基因治療，目前已有研究證 明，BMPs可以直接固定治療腫瘤的藥物阿黴素在體內發揮作用。更重要的是，BMPs直接或間接(通過其他媒介)與核酸、藥物、蛋白質、酶或抗體連接後，在外界磁場的作用下，連接而成的複合物可向器官或組織定向、高效傳遞藥物，提高治療水平。目前，BMPs的研究和應用領域主要涉及磁轉染、基因治療、癌症治療(如惡性癌症的熱療)、靶向藥物投送、核磁共振成像、組織修復、免疫螢光分析等領域。如今，關於BMPs的研究主要涉及BMPs的高效生產、分離和純化，膜蛋白，形成機制，抗體(藥物)連接，磁性細胞分離，免疫螢光分析和mRNA回收等，關於如何更好地保存BMPs的研究目前未見有文獻報導。由於BMPs外有脂膜包被，脂膜一旦遭到破壞，磁小體容易被氧化，功能受到極大影響，甚至失去應用價值。由於實際生產、分離和純化BMPs採用的大多為大規模培養，而BMPs大規模的推廣應用目前還受到一些因素的影響，因此，如何更好的保存得來不易的BMPs並使其結構和功能保持穩定就顯得尤為重要。目前，合成、分泌BMPs的趨磁性細菌分離、培養困難，國內只有個別實驗室能夠成功做到。因此，找到珍貴且具有廣闊應用前景的磁小體的適宜保存條件迫切而重要。

發明內容
本發明的目的在於提供一種保存磁小體的溶液及其應用；本發明的另一個目的在於提供保存磁小體的方法。本發明提供的一種保存磁小體的溶液，其磷酸鹽緩衝溶液(PBS溶液)。優選地，本發明提供的保存磁小體的溶液為0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液。上述0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液，其IL的配方為稱7. 9g NaCl,0. 2gKCl，0. 24g KH2PO4 (或 I. 44g Na2HPO4)和 I. 8g K2HPO4,溶於 800ml 蒸餾水中，用 HCl 調節溶液的pH值至7. 26,最後加蒸懼水雙蒸水定容至1L。本發明提供了上述0. OlM的pH值為7. 26磷酸鹽緩衝溶液在保存磁小體中的應用。本發明提供了上述0.0IM的pH值為7. 26磷酸鹽緩衝溶液在細胞轉染中的應用。
本發明還提供了一種保存磁小體的方法，是將磁小體保存於磷酸鹽緩衝溶液中優選地，本發明提供的保存磁小體的方法是將磁小體保存於0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液中。其中，磁小體在磷酸鹽緩衝液中的保存濃度為I U g/iil-10ii g/iil。優選地，將磁小體加入磷酸鹽緩衝液以後形成的BMPs保存溶液的濃度是I U g/Ul時，保存效果最佳。其中，保存溫度為4°C。其中，保存時間為l-180d。本發明發現0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液在保存磁小體過程中對磁小體的結構和功能的影響和幹擾最小，將保存的磁小體連接得到的BMPs-PEI/DNA複合物可達到更高的PEI、核酸固定和連接效率，用其轉染Hela、Ifep-G2、COS-7和C2C12細胞效率分別是55. 45%、15. 01%、19. 01%和15. 92%，分別高於常規方法保存的磁小體的轉染細胞效率。同時，本發明發現0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液轉染細胞效率分別高於相同濃度下不同PH值的PBS保存磁小體的轉染細胞效率，因此本發明提供的0. 0IM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液是目前最高效保存磁小體的溶液。本發明的PBS保存液容易配製，方便獲得，在實驗室中極易推廣。另外，採用本發明溶液保存的磁小體用於細胞基因傳遞時能夠獲得更高的基因投送效率，能夠很好地應用於體外基因轉染或體內靶向基因投送，適合推廣使用。總之，本發明所提供BMPs保存溶液對於更高效、更長期地保存BMPs，並使其更大範 圍地發揮應用價值具有非常實際的意義。


圖I為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA複合物對Hela細胞的轉染效率圖。圖2為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA複合物對H印-G2細胞的轉染效率圖。圖3為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA複合物對Cos_7細胞的轉染效率圖。圖4為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA複合物對C2C12細胞的轉染效率圖。圖5為為雷射共聚焦顯微鏡掃描的Hela細胞不同轉染效率對應的綠色螢光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達增強型綠色螢光蛋白的Hela細胞，白色部分佔據圖片的部分越多，代表成功表達增強型綠色螢光蛋白的Hela細胞越多，即轉染效率越高。圖6為為雷射共聚焦顯微鏡掃描的Hep_G2細胞不同轉染效率對應的綠色螢光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達增強型綠色螢光蛋白的Hep-G2細胞，白色部分佔據圖片的部分越多，代表成功表達增強型綠色螢光蛋白的Hep-G2細胞越多，即轉染效率越高。圖7為雷射共聚焦顯微鏡掃描的Cos-7細胞不同轉染效率對應的綠色螢光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達增強型綠色螢光蛋白的Cos-7細胞，白色部分佔據圖片的部分越多，代表成功表達增強型綠色螢光蛋白的Cos-7細胞越多，即轉染效率越高。圖8為雷射共聚焦顯微鏡掃描的C2C12細胞不同轉染效率對應的綠色螢光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉染複合獲得的轉染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達增強型綠色螢光蛋白的C2C12細胞，白色部分佔據圖片的部分越多，代表成功表達增強型綠色螢光蛋白的C2C12細胞越多，即轉染效率越高。
·
圖9為分別用pH值為5、6、8、9的PBS保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA複合物對Hela細胞的轉染效率圖。圖10為分別用pH值為5、6、8、9的PBS保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA複合物對Cos-7細胞的轉染效率圖。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，實施例中所用的生物試劑、化學試劑均為市售。實施例I保存磁小體的兩種溶液的配製和保存方法配製了 150mM的pH值為I. 00的NaCl溶液和0. OlM的pH值為I. 26的磷酸鹽緩衝液(PBS)溶液。150mM的pH值為I. 00的NaCl溶液的配製方法稱取0. 8775g的NaCl，溶於80ml的雙蒸水中，調PH值到7. 00，最後加雙蒸水定容至100ml。0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝液的配製方法稱7. 9g NaCl,0. 2g KC1,0. 24gKH2PO4 (或I. 44g Na2HPO4)和I. 8g K2HPO4,溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7. 26,最後加蒸懼水雙蒸水定容至1L。將上述配製的溶液高壓滅菌，Iml分裝，4°C保存待用。秤取純化的500 U g磁小體(BMPs) (BMPs是參照中國專利CN101434921B (申請號200710177452. 7)公開的內容製備得到)分別保存於500 的上述配製好的PBS和NaCl溶液中，即每500 u I的兩種溶液均各自保存500 U g磁小體，保存溫度4°C，時間為180d，並要求保存環境周圍均無外加的或者雜亂的磁場存在。實施例2連接、孵育BMPs-PEI/DNA三元基因傳遞複合物(I)將 BMPs (磁小體)、PEI (聚乙烯亞胺)、pDNA (pEGFP-Nl,購自美國 addgene 公司)的濃度分別調至PEI 2u g/u l,BMPs lug/u l,pDNAlug/u l,0D260/0D230 ^1.80o(2)將0.81^的pDNA和I. 6 ii g的PEI分別稀釋於實施例I製得的48. 7 U I 0. OlM的PBS (pH值為7. 26)中，輕輕渦旋混勻。接著將PEI的稀釋液逐滴緩慢加入DNA稀釋液中(加入的先後順序不可調換)，輕柔混勻後室溫靜置孵育lOmin，使PEI與DNA自組裝，形成PEI/DNA 二元納米複合物。(3)分別取實施例I中的150mM NaCl和0. OlM PBS溶液保存的濃度為I U g/ Ul的BMPs溶液I yl，，超聲波混勻後加入到步驟(2)中已經連接組裝完畢99 u I PEI/DNA複合物溶液中，再次使用超聲波水浴的方式混勻，室溫靜置孵育20min，讓BMPs與PEI/DNA複合物充分連接，最終得到100 u lBMPs-PEI/DNA三元納米基因傳遞複合物溶液，分別標記為A組和B組，A組表示連接BMPs-PEI/DNA複合物 時加入的BMPs是用150mM的NaCl溶液保存的，B組表示連接BMPs-PEI/DNA複合物時加入的BMPs使用0. OlM的pH值7. 26的PBS保存的。實施例3兩種溶液保存的磁小體在轉染細胞中的應用效果比較提前12h接種Hela、H印-G2、Cos_7和C2C12(以上細胞均購自北京協和細胞資源中心)細胞於24孔板中，37°C，5%C02，100%溼度的細胞培養箱內培養。細胞接種密度為Hela 3X IO5/ 孔，H印-G2 4X105/ 孔；Cos-7 4X105/ 孔和 C2C12 2X105/ 孔。待實施例2中的A和B兩組的BMPs-PEI/DNA三元基因傳遞複合物連接完畢後，將培養了 12h的融合度達到近80%的細胞的舊培養基完全吸去，用0. OlM的PBS (pH值為
7.26)清洗細胞3次，每孔中加入300 ill的無血清DMEM培養基(購自美國GIBCO公司，貨號C11995)。將實施例2中連接好的100 u lBMPs-PEI/DNA三元基因傳遞複合物逐滴滴加至24孔細胞培養板中的一孔，輕搖混勻，使轉染複合物可以均勻的散布在細胞的表面。在細胞培養板下放置一塊「釹-鐵-硼」磁鐵(該磁鐵由中國農業大學生命科學技術中心李穎教授實驗室提供，購自德國Chemicell公司)作用lOmin。該「釹-鐵-硼」磁鐵由釹(Nd)、鐵(Fe)、硼(B)三種稀土元素燒鑄而成，永磁性，磁場強度約300mT。IOmin後將培養板置入培養箱內繼續孵育lOmin，然後將培養液完全吸去，換入新的含10%胎牛血清(FBS，購於美國GIBCO公司)的完全培養基(不加抗生素)。培養轉染細胞48h，中間24h換液一次。48h後，首先使用雷射共聚焦顯微鏡掃描轉染的Hela、Ifep-G2、COS-7和C2C12細胞，觀察記錄轉染細胞的綠色螢光蛋白表達情況。掃描後收集轉染細胞，收集方法將舊的培養液吸去，用IXPBS清洗細胞2-3次，然後加入濃度為0. 05%的胰酶消化細胞2min，加入含10%胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司生產)的完全培養基終止胰酶消化。用Iml的移液器輕柔吹打貼壁細胞，收集至無菌離心管中，IOOOrpm離心5min收集細胞。棄上清，加入800 的IXPBS重懸細胞，待流式檢測。檢測細胞數目為3 X IO4,檢測時流式細胞儀的激發光波長為488nm，發射光波長為543nm，以檢測細胞中成功表達綠色螢光蛋白的細胞數目佔所有檢測細胞數目的比例作為轉染效率。結果顯示用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA複合物(即實施例2中的A組)轉染Hela、Hep-G2, Cos-7和C2C12細胞的效率分別是55. 45%、15. 01%、19. 01%和 15. 92% ;用 150mM 的 pH值為 7. 00 的 NaCl 溶液(即實施例 2 中的B組)保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA複合物轉染Hela、H印-G2、Cos-7和C2C12細胞的效率分別是49. 46%、11. 38%、15. 30%和12. 73%。具體請參考圖I至圖8。通過比較分析以上不同細胞的轉染結果可知，相比於150mM的pH值為7.00的NaCl溶液，0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液更加符合保存BMPs所需的外部緩衝環境或者離子環境，使BMPs在保存過程中結構和功能受到的影響和幹擾最小。因此，使用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存的BMPs連接基因傳遞複合物時，可以達到更高的PEI、核酸固定和連接效率，並進一步提高對細胞的轉染效率。綜上所述，0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液是目前發現的最高效保存磁小體的溶液。轉染不同細胞對應的BMPs-PEI/DNA複合物中的BMPs、PEI和DNA的質量配比不同，具體情況見下表I :表I細胞轉染BMPs、PEI與DNA的試劑配比
權利要求
1.一種保存磁小體的溶液，其為磷酸鹽緩衝溶液PBS。
2.如權利要求I所述的溶液，其特徵在於，所述的磷酸鹽緩衝溶液PBS的濃度為·0.01M, pH 值為 7. 26。
3.如權利要求2所述的溶液，其IL的配方為稱7.9gNaCl, 0. 2gKCl,0. 24g KH2PO4或1.44g Na2HPO4,1. 8g K2HPO4,溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7. 26，最後加蒸餾水雙蒸水定容至1L。
4.權利要求1-3任一所述的溶液在保存磁小體中的應用。
5.權利要求1-3任一所述的溶液在細胞轉染中的應用。
6.一種保存磁小體的方法，其特徵在於，將磁小體保存於磷酸鹽緩衝溶液中。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，將磁小體保存於0.OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩衝溶液中。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，磁小體在磷酸鹽緩衝液液中的保存濃度為 I u g/ u 1-10 u g/ u I o
9.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，保存溫度為4°C。
10.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，保存時間為l-180d。
全文摘要
本發明提供了一種保存磁小體的溶液及其應用，屬於生物材料應用領域。本發明提供的保存磁小體的溶液為磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，本發明溶液在保存磁小體過程中對其結構和功能的影響和幹擾最小，將保存的磁小體連接得到的BMPs-PEI/DNA複合物可達到更高的PEI、核酸固定和連接效率，用其轉染Hela、Hep-G2、Cos-7和C2C12細胞效率分別高於常規方法保存的磁小體的轉染細胞效率。本發明提供的BMPs保存溶液對於更高效、更長期地保存BMPs，並使其更大範圍地發揮應用價值具有非常實際的意義。
文檔編號C01G49/08GK102730768SQ20121020925
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者康曉龍, 方美英, 楊萬傑 申請人:中國農業大學