食品中大腸桿菌o157:h7活菌的定量檢測方法

2023-07-18 16:16:51

食品中大腸桿菌o157:h7活菌的定量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌O157:H7的螢光定量PCR的檢測方法。針對大腸桿菌O157:H7的filc，設計一對擴增20bp片段的特異性引物。首先，採用磁珠富集的方法從實際樣本中分離出大腸桿菌O157:H7，然後通過脫氧膽酸鹽(SD)和疊氮溴化丙錠（PMA）處理排除食物樣品中死菌的幹擾，使PCR擴增活菌。本發明的檢測方法具有靈敏度高、準確定量、特異性強、檢測時間短，操作過程簡單，並且不會被食物樣品中殘留的DNA或死菌的幹擾。
【專利說明】食品中大腸桿菌0157:H7活菌的定量檢測方法
【技術領域】[0001]本發明屬於微生物檢測領域，尤其涉及一種快速檢測食品中大腸桿菌0157:H7的方法。
技術背景
[0002]大腸桿菌0157:H7是近30年來才被發現和識別的食源致病菌，按血清型分類屬腸出血性大腸桿菌(Entero Hemorrhagic Escherichia coli，EHEC)。它以食物傳播為主，主要的宿主是牛和雞等家畜家禽。人類攝入不到10個活菌就有可能引起出血性結腸炎(Hemorrhagic colitis HC)和溶血性尿毒症候群(Hemolytic uremie syndrom HUS),患者病死率極高，其對人類的健康構成了嚴重的威脅。巴氏滅菌和冷凍存儲是兩種常見方法降低大腸桿菌0157:H7對食品的汙染。然而由於食品基質以及大腸桿菌0157:H7自身免疫機制常常對細菌具保護功能，所以常常有大腸桿菌0157:H7汙染食品。被來自1982年美國首次爆發大腸桿菌0157:H7引起的感染性腹瀉以來，世界各國相繼爆發了多起大腸桿菌0157:H7的流行事件。1986年在中國江蘇徐州首次報導了大腸桿菌0157:H7的病例，隨後在中國十幾個省份也發生散發病例。其流行性已經不再是個別國家的問題，而是成為世界重要公共衛生問題之一。
[0003]目前檢測大腸桿菌0157:H7的常見培養法、免疫學方法以及分子生物方法。常規培養法耗時且工作量大；免疫磁珠捕獲法由於方法自身的局限性，檢測的靈敏度低且造成一定程度的漏檢。分子生物學方法，如PCR存在不能區分死菌或者活菌的缺陷，使檢測結果具有假陰性。據報導，PMA能夠通過細胞膜破損的死菌，與DNA結合，使死菌DNA在PCR時不再擴增，進而檢測活菌的信號。然而PMA-PCR結合的方法也具有一定的局限性。細胞膜未破損的死菌以及受傷的菌，PMA不能有效抑制其PCR擴增。因此，為了確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的大腸桿菌0157:H7。

【發明內容】

[0004]本發明是目的是針對現有技術的不足，提供一種定量、結果準確、檢測快速高效、靈敏度高的大腸桿菌0157:H7的快速檢測方法。
[0005]本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的:
[0006]包括如下步驟:
[0007](I)取食物樣本，加PBS磷酸緩衝液碾磨製成勻漿液，離心去除食物殘渣，取上清得菌懸液，整過程均為無菌操作；
[0008](2)取製備好的菌懸液加偶聯有大腸桿菌0157:H7抗體的磁珠，室溫下在旋轉混合儀上以IOrpm的轉速反應45min後，將離心管插入磁力架分離3min，用移液器吸出上清，加入到滅菌離心管中備用。最後，添加ImL洗滌液洗滌I遍，磁分離後吸出洗滌液，最後用等體積緩衝液重懸磁珠。
[0009](3)向上述重懸液加入0.l%(m(g)/v(mL))蛋白腖水溶解的脫氧膽酸鹽使其終濃度為 0.1% ~2.5%(m(g) /v (mL)),室溫孵育 20 ~120min。
[0010](4)加入疊氮溴化丙錠(PMA)溶液，使PMA的終質量濃度為5 μ g/mL,混勻後室溫避光培養，滷素燈曝光，光照交聯時樣品置於冰上，交聯後的懸浮液離心，用無菌水重懸，所得沉澱用沸水浴法提取DNA。
[0011](5)通過連續十倍稀釋過夜培養的大腸桿菌0157:H7得到不同梯度濃度的菌懸液，沸水浴法提取菌懸液中大腸桿菌0157:H7的DNA，然後進行螢光定量PCR。同時平板計數每個梯度菌懸液的濃度，以平板計數得到活菌數的對數值為橫坐標，以螢光定量PCR的Ct值為縱坐標繪製得到大腸桿菌0157:H7標準曲線。
[0012](6)取DNA為模板，進行螢光定量PCR。PCR的上下遊引物分別為flic上遊引物:5』 -TTCGCAGCATCACTGGATTC-3』
[0013]fl ic 下遊引物:5 』 -CATCGCAAAAGCAACTCCTG-3 』
[0014]螢光定量PCR 反應體系為 20 μ L:DNA 模板 2 μ L，SYBR Premix Ex Taq?10 μ L,R0X0.4 μ L, 10 μ M的上下遊引物各0.4 μ L，無菌水補足20 μ L。螢光定量PCR反應條件為:95°C預變性30s，緊接著95°C變性5s，62°C退火lmin40個循環。
[0015]螢光定量PCR數據用SDS2.3軟體分析數據，從而進行結果的分析，將將螢光定量PCR結果代入標準曲線中，即可定量得到待測食品樣本中大腸桿菌0157:H7。
[0016]有益效果
[0017]與現有技術相比，本發明有如下有益效果，本發明將MS (磁珠分離)與qPCR技術相結合，檢測大腸桿菌0157:H7時間更短，可在5個小時內得到結果且提高了檢測靈敏度。同時本發明克服了一般的分子生物學檢測方法無法區分死菌與活菌的缺陷。大腸桿菌0157:H7作為一種主要的食源性致病菌，在公共衛生、食品安全。獸牧獸醫和出入境檢驗檢疫中必須的檢測指標。隨著社會經濟的發展和國際貿易量的與日俱增。急需建立一種從田園到餐桌的一種快速、準確、靈敏度高的細菌檢測方法。將IMS-SD-PMA與qPCR檢測技術更具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1脫氧膽酸鹽濃度的優化；
[0019]圖2脫氧膽酸鹽與大腸桿菌0157:H7孵育時間的優化；
[0020]圖3大腸桿菌0157:H7標準曲線的建立；
[0021 ] 圖4、qPCR、PMA_qPCR、SD_PMA_qPCR與平板計數方法的比較，各種形狀代表qPCR,PMA-qPCR，SD-PMA-qPCR ( □)和平板計數；
[0022]圖5大腸桿菌0157:H7經過磁珠富集的檢測線。a未經過SD和PMA處理大腸桿菌0157:H7檢測線。b經過SD和PMA處理後大腸桿菌0157:H7檢測線。
具體實施方案
[0023]下面結合具體實施例，進一步闡釋本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件是實驗方法，通常按照常規條件中的條件，或按照製造廠商的建議條件，實施例中涉及的菌株均屬於現有技術，本領域的技術人員可很容易地從公開是商業渠道獲得。[0024]實施例1脫氧膽酸鹽濃度的優化以及處理時間
[0025]稱取一定量的脫氧膽酸鹽(SD)溶解於0.l%(m(g)/v(mL))的蛋白腖水，配成濃度為5%(m(g)/v(mL))的SD母液，置於4°C避光保存。
[0026]疊氮溴化丙錠(PMA)溶解於二甲亞碸(DMSO)中，配製成0.5mg/mL的PMA溶液，-20°C避光保存。
[0027]挑取大腸桿菌0157:H7(英國典型菌種保藏中心)的單菌落於5mLLB培養基中，37°C過夜培養後，取ImL菌液用PBS連續十倍稀釋兩個梯度，得到約為106CFU/mL。12000rpm離心IOmin,用等體積的0.1% (m(g)/v(mL))的蛋白腖水重懸。將重懸後的菌液置於_70°C中處理IOmin後，9°C水浴30min，得到受傷的細菌、活菌和死菌的混合物。取上述ImL含有受傷的細菌、活菌和死菌的混合物加入1.5mL的離心管中。分別向離心管中加入不同體積的SD，使 SD 的最終濃度達到 0、0.01,0.05,0.1,0.5、1、2.5 和 5%(m(g) /v (mL))。37°C 以 180rpm轉速孵育30min，採用傳統的平板技術的方法對各離心管活菌進行計數。結果見圖1，根據計數的結果，0.l%(m(g)/v(mL))SD能夠有效地降解受傷細菌的細胞膜，所以後續實驗選取
0.1%SD (不影響活菌生長) 處理受傷細菌。
[0028]取大腸桿菌0157:H7的單菌落於5mL LB培養基中，37°C過夜培養後，取ImL菌液用PBS連續十倍稀釋兩個梯度，得到約為106CFU/mL。12000rpm離心lOmin，用等體積的0.1%的蛋白腖水重懸。將重懸後的菌液置於-70 V中處理IOmin後，9°C水浴30min，得到受傷的細菌、活菌和死菌的混合物。取上述ImL含有受傷的細菌、活菌和死菌的混合物加入1.5mL的離心管中，向離心管中加入2(^1^%(111(8)八(11^))50，371:以180rpm轉速分別孵育O、10、20,30,60和90、120min，採用傳統的平板技術的方法對脫氧膽酸鹽處理不同時間的細菌進行計數。結果見圖2，由圖2可以看出，經過脫氧膽酸鹽處理受傷細菌20min處理後，受傷細菌不能在平板上生長，失去了生長能力。故後續實驗脫氧膽酸鹽的處理時間選擇20min。實施例2、標準曲線的建立
[0029]挑取大腸桿菌0157:H7 (英國典型菌種保藏中心)單菌落於5mL的LB培養基中，37°C培養過夜。取ImL菌液於1.5mL離心管中，用PBS連續十倍稀釋，通過平板計數得知菌液濃度分別為 4.78Χ108、4.78Χ107、4.78Χ106、4.78Χ105、4.78Χ104、4.78X IO3 和4.78Χ 102CFU/mL。分別取500 μ L不同濃度的菌液採用沸水浴法進行基因組DNA的提取。以平板計數得到活菌數的對數為橫坐標，以螢光定量PCR的Ct值為縱坐標繪製得到大腸桿菌 0157:Η7 標準曲線:y=-3.27x+41.803，見圖 3。
[0030]實施例3、食品中大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)活菌的定量檢測
[0031 ] I)食物樣本預處理
[0032]稱取Ig或者ImL的無目的菌的食物樣本，加入9mL的PBS磷酸鹽緩衝液，碾磨製成勻眾液，加入不同濃度的大腸桿菌0157:H7以保證濃度107-102CFU/mL, 800rpm離心5min,去除大的食物殘渣，取上清(該過程必須無菌操作)
[0033]2)磁珠富集
[0034]取980 μ L步驟I)菌懸液加入到滅菌離心管中，加入偶聯有E.coli 0157:H7抗體的免疫磁珠0.05mg,磁珠粒徑為180nm,室溫下在旋轉混合儀上以IOrpm轉速反應45min後，將離心管插入磁力架分離3min，用移液器吸出上清，加入到滅菌離心管中備用。最後，添加ImL洗滌液洗滌I遍，磁分離後吸出洗滌液，最後用等體積緩衝液重懸磁珠。洗滌液為添加有0.02% (v/v)吐溫的磷酸鹽緩衝液。
[0035]抗體的製備參照文獻:王燕琴.抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的製備與鑑定[D].甘肅農業大學，2007。
[0036]偶聯有E.coli 0157:H7抗體的免疫磁珠的製備方法如下:取IOmg磁珠(奧潤,無錫)用無菌添加有吐溫20的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MEST) (0.01mol/L，0.02%Tween_20,pH5.5)洗滌3遍，磁分離後移除上清。加入用無菌MES緩衝液現配的1-乙基_3_(3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHSS)溶液(10mg/mL)各0.5mL,室溫下在旋轉混合儀上活化lh(15rpm)。磁分離後移除上清，用ImL無菌MES緩衝液(pH5.5)重懸。磁分離後吸出上清，向離心管中添加0.5mL BS (0.005M硼酸鹽緩衝液，pH8.5)稀釋的單抗，抗體量為50 μ g/mg磁珠。室溫下在旋轉混合儀上反應3h以上(15rpm)。磁分離後加入ImL含1% (m/v)氨基葡萄糖的硼酸鹽緩衝液(pH8.5)封閉磁珠，室溫下在旋轉混合儀上反應Ih (15rpm)0磁分離後移除上清，用BST (0.005M硼酸鹽緩衝液，0.02%TWeen-20，pH8.5)洗滌3遍。最後用0.5mL BST (含0.02%疊氮鈉、0.5%BSA)重懸磁珠，置於4°C備用
[0037]3)脫氧膽酸鹽(SD)處理
[0038]向步驟2)中重懸的菌液中加入20 μ L5%SD,使脫氧膽酸鹽最終的濃度為0.1%，以轉數180rpm室溫孵育20min。
[0039]4)、疊氮溴化丙錠(PMA)處理
[0040]PMA溶解於二甲亞碸(DMSO)中，配製成0.5mg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。向步驟3)中離心管中加入I μ L5mg/mL的PMA溶液，使PMA的終質量濃度為5 μ g/mL ;混合均勻後，在室溫條件下避光培養5min,利用500W的滷素燈曝光5min,光照交聯時樣品置於冰上(避免過熱)，且在距光源20cm處，交聯後的懸浮液於1000Og離心5min，所得沉澱用於DNA的提取。
`[0041]5)基因組DNA的提取
[0042]經步驟4獲得的樣品在12000rpm，4°C條件下離心lOmin，棄上清，並小心吸走殘餘液體，加入30 μ L無菌的去離子水100°C煮沸IOmin,以12000rpm離心5min。取上清作為qPCR反應模板，製備的模板應立即用於檢測。PCR的上下遊引物分別為
[0043]flic 上遊引物:5』 -TTCGCAGCATCACTGGATTC-3』
[0044]fl ic 下遊引物:5 』 -CATCGCAAAAGCAACTCCTG-3 』
[0045]螢光定量PCR 反應體系為 20 μ L:DNA 模板 2 μ L，SYBR Premix Ex Taq?10 μ L,R0X0.4 μ L, 10 μ M的上下遊引物各0.4 μ L，無菌水補足20 μ L。螢光定量PCR反應條件為:95°C預變性30s，緊接著95°C變性5s，62°C退火lmin40個循環。螢光定量PCR數據用SDS2.3軟體分析數據，將螢光定量PCR結果代入實施例2的標準曲線中，即可定量得到待測食品樣本中大腸桿菌0157:H7。
[0046]實施例4弓丨物特異性驗證
[0047]為驗證引物的特異性，對表1提供的菌株進行基因組DNA的提取和螢光定量PCR，操作條件見實施例3的步驟5)。菌株的編號和來源及驗證結果見表1，從表1中可以看出本發明提供的引物對大腸桿菌Escherichia coli 0157:H7具有較高的特異性。
[0048]表1供試菌株及檢測結果
【權利要求】
1.食品中大腸桿菌0157:H7(fccAericAia coli 0157:H7)活菌的定量檢測方法，其特徵在於包括如下步驟: 1)取待測食品樣本，加緩衝液碾磨製成勻漿液，離心去除食物殘渣，取上清得菌懸液； 2)取步驟I)的菌懸液加偶聯有大腸桿菌0157:H7抗體的磁珠，室溫下以10rpm的轉速反應45 min後，磁力架分離3min，吸出上清，加入洗滌液洗滌I遍，磁分離後吸出洗滌液，最後用等體積緩衝液重懸磁珠，得重懸液； 3)向步驟2)的重懸液中加入脫氧膽酸鹽使其終濃度為0.1%~2.5%(m(g) /v (mL))，室溫孵育20~120 min ； 4)向步驟3)菌液加疊氮溴化丙錠溶液，使疊氮溴化丙錠的終質量濃度為5μ g/mL,混勻後室溫避光培養，滷素燈曝光，光照交聯時樣品置於冰上，交聯後的懸浮液離心，所得沉澱用沸水浴法提取DNA ； 5)標準曲線的建立； 6)取步驟4)中提取的DNA為模板，進行螢光定量PCR，上下遊引物分別為 flic 上遊引物:5』 -TTCGCAGCATCACTGGATTC-3』 flic 下遊引物:5』 -CATCGCAAAAGCAACTCCTG-3』 螢光定量PCR數據用SDS 2.3軟體分析數據，將螢光定量PCR結果代入步驟5)的標準曲線中，定量檢測食品樣本中大腸桿菌0157:H7。
2.如權利要求`1所述的方法，其特徵在於:步驟I)所述的緩衝液為PBS磷酸鹽緩衝液。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟2)所述的洗滌液為添加有0.02% (v/v)吐溫的磷酸鹽緩衝液。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟2)所述磁珠粒徑為180nm。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟2)所述磁珠的加入量為每ImL的菌液裡面加入0.05 mg ο
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟3)所述脫氧膽酸鹽終濃度優選為0.l%(m(g)/v(mL))，室溫孵育時間優選為20 min ； 所述脫氧膽酸鹽用0.l%(m(g)/v(mL))的蛋白腖水溶解。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟4)所述疊氮溴化丙錠溶液配製方法為疊氮溴化丙錠溶解於二甲亞碸中，配製成5 mg/mL的疊氮溴化丙錠溶液。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟5)所述標準曲線的建立通過連續十倍稀釋過夜培養的大腸桿菌0157:H7得到梯度濃度的菌懸液，沸水浴法提取菌懸液中大腸桿菌0157:H7的DNA，然後進行螢光定量PCR，同時平板計數每個梯度菌懸液的濃度，以平板計數得到活菌數的對數值為橫坐標，以螢光定量PCR的Ct值為縱坐標建立大腸桿菌0157:H7標準曲線。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟(6)所述螢光定量PCR反應體系為:DNA模板 2 μ?, SYBR Premix Ex Tagm 10 μ?, ROX 0.4μ?, 10 μΜ 的上下遊引物各 0.4μ?，無菌水補足20 PL，反應條件為:95 °C預變性30 S，緊接著95 °C變性5 S，62 °C退火I min 40個循環。
【文檔編號】C12Q1/06GK103509860SQ201310349335
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】李林, 楊曉慧, 許恆毅, 張勇攀 申請人:無錫中德伯爾生物技術有限公司