經由物理吸附將修飾的寡核苷酸固定至聚合物基體上的製作方法

2023-07-18 20:54:56 1

發明領域

用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，b)將步驟a)的混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。本發明還涉及通過該方法實現的微陣列。本發明還涉及與寡核苷酸附接的標記用於通過物理吸附將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的用途。此外，本發明涉及通過本文所述的方法實現的微陣列用於包含此類微陣列的測定和診斷試劑盒的用途。

發明背景

在現代分子生物學和醫學中，生物晶片或生物學微陣列，特別是dna微陣列，已經成為重要的工具。通常，晶片由排列的一系列大量寡核苷酸的微小點組成，每個微小點含有小量的特異性核酸序列。這可以是，例如，基因或其他dna元件的短區段，其被用作捕獲探針，以便在允許捕獲探針和相應靶標之間的結合的條件下與cdna或crna樣品(靶標)雜交。

塑料經常用於生產一次性基體，因為它們是低成本的並且可以用於大規模生產。對於核酸檢測的生物化學測定，需要將dna寡核苷酸探針固定在這些基體上。已經公開了幾種用於將dna寡核苷酸固定在塑料(即聚合物)基體諸如環烯烴共聚物(coc)上的方法。在大多數情況下，基於塑料的微陣列具有修飾/功能化的表面以使寡核苷酸能夠附接。其他固定方法描述了(接頭)修飾的寡核苷酸在未修飾的聚合物基體上的結合。短暫的uv暴露將含有聚(t)和/或聚(c)標籤的dna寡核苷酸固定至各種未修飾的聚合物基體上(y.sun等人,(2012);d.sabourin等人(2010);n.kimura,(2006))。

由於聚合物基體的必要修飾，這些方法是昂貴且耗時的。此外，它們可能對檢測方法具有負面影響。具體而言，用uv光照射核酸通常導致對核酸分子的損傷，這可能對分子與互補序列雜交的能力產生影響，因此可能損害其在微陣列系統中的可用性。因此，需要開發微陣列的成本和生產時間降低的改進方法，所述微陣列不會損害用這些微陣列實施的測定的質量。

發明概述

本發明解決了對於不太費時且成本較低地生產微陣列（其不損害用這些微陣列進行的測定的質量）的方法的需求。

上述目標通過用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法來實現，所述方法包括以下步驟：a)提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，和

b)將步驟a)的混合物施加在未修飾的基體上；其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

在一個具體實施方案中，所述聚合物基體選自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、環烯烴共聚物(coc)、氟化聚醯亞胺、聚苯乙烯(ps)、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚碸。

在一個優選實施方案中，所述聚合物基體是環烯烴共聚物(coc)。

在另一個優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸是dna、rna或lna。

在進一步優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸是dna或lna。

在一個額外優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸是ssdna或sslna。

在另一個優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸包含至少一個化學基團與其附接的寡核苷酸，其中所述化學基團適合於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

在另一個實施方案中，所述標記的寡核苷酸包含至少一個化學基團與其附接的寡核苷酸，其中所述化學基團優選具有0.1至1000kda、0.1至50kda、0.1至1.5kda、0.15至1kda、0.2至0.8kda的分子量。

在進一步的實施方案中，所述化學基團是這樣的化學基團，其優選地選自生物素或磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)。

在另一個實施方案中，所述標記的寡核苷酸的長度為約2至約2000個核苷酸、約2至500個、約2至約200個核苷酸、約2至約100個、約2至50個核苷酸。

在進一步的實施方案中，所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

在又另一個實施方案中，步驟b)之後是步驟孵育基體。

在一個額外實施方案中，上面提及的方法步驟之後是步驟基體乾燥。

在進一步的實施方案中，上面提及的方法步驟之後是步驟清洗基體，其任選地之後是步驟乾燥基體。

本發明的另一個方面涉及與寡核苷酸附接的標記用於通過物理吸附將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的用途。

本發明的一個額外方面是指通過如上所述的方法實現的微陣列。

本發明的進一步的方面涉及包含未修飾的聚合物基體和固定在所述基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的聚合物基體之間不存在共價鍵。

在一個實施方案中，所述標記的寡核苷酸還包含與標記的寡核苷酸附接的目標分子。

進一步的實施方案是指包含未修飾的聚合物基體、固定在所述基體上的標記的寡核苷酸和目標分子與其附接的寡核苷酸的微陣列；其中所述寡核苷酸與固定在所述聚合物基體上的標記的寡核苷酸雜交，且其中固定在所述基體上的標記的寡核苷酸和未修飾的聚合物基體之間不存在共價鍵。

在本發明的一個實施方案中，通過物理吸附將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的進一步的方面涉及診斷試劑盒，其包含根據如本文所述的方法固定的寡核苷酸的陣列和含有確定量的與所述固定的寡核苷酸中的至少一種互補的已知、標記的核酸的對照探針。

本發明的一個額外方面是指如上所限定的微陣列用於雜交測定、用於表面擴增、用於定量和/或多重檢測dna或rna分子、用於表達分析、用於比較基因組雜交、用於檢測單核苷酸多態性或用於基於基因組選擇的測序的用途。

本發明的另一個方面涉及用於將目標分子固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括如本文所述的固定標記的寡核苷酸的方法的步驟，其中步驟a)中提供的標記的寡核苷酸還包含與所述寡核苷酸附接的目標分子。

本發明的另一個方面涉及用於將目標分子固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括如本文所述的固定標記的寡核苷酸的方法的步驟，且此外至少包括步驟：

c)將目標分子與其附接的寡核苷酸雜交。

附圖簡述

圖1.展現用未修飾的寡核苷酸斑點印刷的coc基體的測定結果，其在與靶標雜交和用納米顆粒標記後沒有展現可見斑點。

圖2顯示用德克薩斯紅-修飾的寡核苷酸斑點印刷的coc基體的結果，其在雜交後具有清晰可見的斑點。

圖3顯示用生物素-修飾的寡核苷酸斑點印刷的coc基體的結果，其在雜交後具有清晰可見的斑點。

圖4顯示實施例2的雜交測定的示意圖。

實施方案的詳述

儘管本發明將關於具體實施方案進行描述，但不在限制性的意義上理解該描述。

在詳細描述本發明的示例性實施方案之前，給出對於理解本發明重要的定義。

如在此說明書和所附權利要求中所使用，單數形式「一個/種(a)」和「一個/種(an)」也包括各自的複數，除非上下文明確另外指示。

在本發明的上下文中，術語「約」和「大約」表示本領域技術人員將理解為仍然確保討論中的特徵的技術效果的精確區間。所述術語通常指示偏離所示數值±20%，優選±15%，更優選±10%，和甚至更優選±5%的偏差。

應當理解，術語「包含」不是限制性的。用於本發明的目的，認為術語「由...組成」是術語「包含(comprisingof)」的優選實施方案。如果在下文中將組定義為包含至少特定數目的實施方案，則這表示也包含優選地僅由這些實施方案組成的組。

此外，在說明書和權利要求中的術語「第一」、「第二」、「第三」或「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」等和類似術語被用於區分相似的要素且不一定用於描述相繼或時間順序。應當理解，如此使用的術語在適當的情況下是可互換的，且本文所述的本發明的實施方案能夠以除了本文描述或說明的順序以外的其他順序操作。

在術語「第一」、「第二」、「第三」或「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」等涉及方法或用途的步驟的情況下，在步驟之間沒有時間或時間間隔連貫性，即所述步驟可同時進行，或在此類步驟之間可存在數秒、數分鐘、數小時、數天、數周、數月或甚至數年的時間間隔，除非在如本文下述的申請中另外指出。

應當理解，本發明不受限於本文所述的具體方法、方案、試劑等，因為這些可以變化。還應當理解，本文使用的術語僅為了描述具體實施方案的目的，且無意限制僅通過所附權利要求限制的本發明的範圍。除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員一般理解的相同的含義。

本發明的一個方面是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

如本文所用的術語「未-修飾的」和「未修飾的」是指未例如通過具有官能化基團(如聚乙二醇、胺、環氧化物、異硫氰酸酯、聚-l-賴氨酸、抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白)的矽烷層修飾或官能化的聚合物基體。這尤其意味著聚合物基體不具有修飾或官能化的表面，諸如由烷基鏈形成的疏水性單層或由聚乙二醇或低聚乙二醇(oligoethylenglycol)鏈形成的親水層，含環氧基的聚合物層，氨基矽烷化表面，並且未用促進磷酸鍵鍵合(phosphatebonding)的物質(諸如胺、胍基、脒基、咪唑鎓基團、不帶電荷的h-鍵供體諸如醛、醇或甲醯胺或不帶電荷的無機h-鍵供體諸如sio2、tio2、alo2)塗覆。該術語進一步意味著聚合物基體例如未與有機薄膜接觸，其覆蓋聚合物基體的所有或一些表面。沒有反應性基團或官能團附接至聚合物基體。具體而言，術語「未-修飾的」和「未修飾的」意味著基體的結合特性未改變。更具體地，這意味著沒有分子，特別是沒有增強寡核苷酸的結合的分子被加入聚合物基體中，或者聚合物基體的結合基團未被活化。

術語「將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上」涉及經由阻礙寡核苷酸的分離(例如在洗滌、衝洗或化學雜交步驟中)的分子相互作用將標記的寡核苷酸與未修飾的聚合物基體的締合。在本發明的方法中，此類分子相互作用不是基於共價化學鍵，而是基於吸附，特別是底物和待固定的標記的寡核苷酸之間的物理吸附。使核苷酸與基體結合的吸附力可以選自氫鍵鍵合、靜電相互作用、範德華相互作用、疏水相互作用或其組合。

基體和寡核苷酸之間的吸附通過標記的寡核苷酸的標記來賦予。這從圖1至3變得清楚，其顯示沒有標記的寡核苷酸未固定在coc基體上(圖1)，而當用德克薩斯紅(圖2)或生物素(圖3)標記寡核苷酸時，可以檢測到包含幾個標記的寡核苷酸的清晰斑點，顯示標記的寡核苷酸被固定在基體上。這清楚地顯示，只有如本文所限定的具有標記的寡核苷酸被固定在聚合物基體諸如coc上。

因此，在本發明中，標記的寡核苷酸的固定通過將標記的寡核苷酸的標記吸附至未修飾的聚合物基體來介導。

如本文所用的「靶標」或「靶分子」可以是允許如本文上述的特異性相互作用的任何合適的分子。靶分子的實例為核酸，蛋白，肽，任何形式和格式的配體，抗體，抗原，小分子如有機結構、無機結構或有機和無機結構的混合物，例如碳水化合物或糖，聚合物，實體如細胞或細胞碎片或細胞亞部分，例如細菌細胞或其碎片，真核細胞或其碎片，病毒顆粒或病毒，或上述任何衍生物或組合。

如本文所用的術語「施加」是指液體沉積的任何方法，例如接觸印刷或非接觸印刷。在一個優選實施方案中，使用非接觸印刷來將步驟a)的混合物施加在未修飾的基體上。

如本文所用的術語「非接觸印刷」是指本領域中適合於在聚合物基體上印刷包含寡核苷酸的混合物的任何非接觸印刷方法，諸如噴墨印刷、點樣或分配。對於非接觸印刷，可以採用點樣器諸如sciflexarrayers11(scienion)。

本發明的一個具體實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物非接觸印刷在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

如本文所用的術語「基體」是指本領域技術人員已知的任何合適的基體。所述基體可以具有任何合適的形式或格式，例如其可以是平的，彎曲的，例如凸起或凹入地彎曲，其可以是捲曲的或包括波浪樣格式。陣列還可以包含含有捕獲分子的磁性顆粒。如本文所用的術語基體可以包括固體物體，諸如固體載片室或固體微流體裝置，以及塗覆層，例如載片的塗覆層，腔室的塗覆層或微流體裝置的塗覆層。在一個實施方案中，所述基體是指固體物體。在具體實施方案中，所述基體是指固體載片或固體室。

在本發明的一個實施方案中，所述聚合物基體選自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、環烯烴共聚物(coc)、氟化聚醯亞胺、聚苯乙烯(ps)、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚碸。

在一個優選實施方案中，所述聚合物基體選自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、環烯烴共聚物(coc)、氟化聚醯亞胺、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚碸。

在更優選實施方案中，所述聚合物基體選自聚降冰片烯、環烯烴共聚物(coc)、氟化聚醯亞胺、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)和聚碸。在本發明的一個甚至更優選實施方案中，所述聚合物基體是環烯烴共聚物(coc)。

在另一個優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸包含至少一個化學基團與其附接的寡核苷酸，其中所述化學基團適合於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

術語「附接的」是指共價和非共價結合。優選地，「附接的」意味著用於固定的標記與寡核苷酸共價結合。優選地，「附接的」意味著目標分子與寡核苷酸共價結合。

「適合於固定標記的寡核苷酸」應被理解為在至少一種化學基團與未修飾的基體之間建立吸附力，特別是物理吸附力，使得將標記的寡核苷酸固定至基體。這可以尤其遵循實施例1至3的方案使用用待測試的化學基團標記的寡核苷酸進行測試。例如如圖2和圖3中所示的斑點的形成表明化學基團適合於將標記的寡核苷酸固定至基體。相反，例如如圖1所示的斑點的不存在表明化學基團不適合於將標記的寡核苷酸固定至基體。因此，藉助將具有磁珠的探針與樣品雜交並通過受抑全內反射(f-tir)檢測珠粒，可以測試固定至基體的寡核苷酸的適合性。然而，用不同標記進行標記的其他探針也可以與適合於檢測探針的標記的檢測方法組合用於檢測。

在另一個實施方案中，所述標記的寡核苷酸包含至少一個化學基團與其附接的寡核苷酸，其中所述化學基團優選具有0.1至1000kda、0.1至50kda、0.1至1.5kda、0.15至1kda、0.2至0.8kda的分子量。

在進一步的實施方案中，至少一個化學基團是疏水性化學基團。在一個具體實施方案中，例如，所述疏水性化學基團可以是疏水性發色團、長疏水鏈、膽甾醇基、peg或生物素。

如本文所用的術語「疏水性」是指在水中不容易溶解(即，締合)的傾向。通過優先與其他疏水部分或分子鍵合或締合、從而排除水分子，部分(moiety)可以是疏水性的。

在一個優選實施方案中，化學基團是蛋白或非蛋白有機螢光團，諸如花青衍生物、萘衍生物、噁二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物或四吡咯衍生物，優選呫噸衍生物，諸如螢光素或其衍生物或羅丹明或其衍生物。

在一個優選實施方案中，所述化學基團是羅丹明或其衍生物，諸如羧基四甲基羅丹明(tamra)、四甲基羅丹明(tmr)及其異硫氰酸酯衍生物(tritc)和磺醯羅丹明101和磺醯羅丹明101氯化物(德克薩斯紅)。

在一個優選實施方案中，所述化學基團選自生物素或磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)。

所述化學基團可以附接在寡核苷酸的3'末端或5'末端。

在一個優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸是標記的rna、標記的lna或標記的dna。在一個甚至更優選實施方案中，所述寡核苷酸是標記的dna或標記的lna。

標記的寡核苷酸還可以包含核苷酸適體，諸如dna適體、rna適體或lna適體。

待根據本發明的一個優選實施方案固定的寡核苷酸可以是dna、rna、pna、cna、hna、lna或ana。dna可以是例如a-dna、b-dna或z-dna的形式。rna可以是例如p-rna，即吡喃基(pyranosysl)-rna的形式，或結構修飾形式如髮夾rna或莖-環rna。

術語「pna」涉及肽核酸，即人工合成的類似於dna或rna的聚合物，其被用於生物學研究和藥物治療，但已知其不天然存在。pna骨架一般由通過肽鍵連接的重複的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成。多種嘌呤和嘧啶鹼基通過亞甲基羰基鍵與骨架連接。pna一般被描述為類似肽，其中n-端在第一(左)位且c端在右邊。

術語「cna」涉及氨基環己基乙烷酸核酸。此外，該術語涉及環戊烷核酸，即包含例如2'-脫氧氨基甲酸鳥苷(2'-deoxycarbaguanosine)的核酸分子。

術語「hna」涉及己糖醇核酸，即由標準的核鹼基和磷酸化的1,5-失水己糖醇骨架構建的dna類似物。

術語「lna」涉及鎖核酸。通常，鎖核酸是修飾的且因此難以接近的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分可被連接2』和4』碳的額外的橋修飾。此橋以3』-內結構構象鎖定核糖。鎖定的核糖構象增強鹼基堆積和骨架預組織。這可顯著提高熱穩定性，即寡核苷酸的解鏈溫度。

術語「ana」涉及阿拉伯糖核酸或其衍生物。在本發明的上下文中優選的ana衍生物是2'-脫氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核苷(2'f-ana)。

在進一步優選實施方案中，寡核苷酸可以包含dna、rna、pna、cna、hna、lna和ana中的任一種的組合。特別優選具有dna或rna鹼基的lna核苷酸的混合物。

在另一個優選實施方案中，本文如上所定義的寡核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的或可以由單鏈和雙鏈區段的組合構成。術語「單鏈核酸」涉及包含單糖-磷酸酯骨架和/或不以螺旋形式組織的寡核苷酸。優選地，這些寡核苷酸不表現出二級結構或分子間締合。術語「雙鏈核酸」涉及包含兩個糖-磷酸酯骨架的核酸分子。在一個優選實施方案中，雙鏈核酸以雙螺旋形式組織。在進一步優選實施方案中，根據本發明的雙鏈核酸可以由不同類型的核酸分子構成，例如由dna和rna、dna和pna、dna和cna、dna和hna、dna和lna、dna和ana、或rna和cna、rna和pna、rna和cna、rna和hna、rna和lna、rna和ana、或pna和cna、pna和hna、pna和lna、pna和ana或cna和hna、cna和lna、cna和ana、或hna和lna、hna和ana、或lna和ana構成。它們或者也可以由上面提及的核苷酸變體的任一種的區段的組合構成。最優選的是單鏈dna(ssdna)或單鏈lna(sslna)。

所述寡核苷酸可以對靶分子具有結合親和力。

所述寡核苷酸可以包含對靶分子沒有結合親和力的間隔物。所述間隔物可以是寡核苷酸或不同的聚合物，例如碳水化合物鏈。所述間隔物可以是具有例如至少15個核苷酸、優選至少20個核苷酸或至少50個核苷酸的長度的寡核苷酸。所述間隔物可以是聚合物，諸如具有至少4nm、6nm或15nm的長度的碳水化合物鏈。所述間隔物可以在寡核苷酸的末端，其用適合於將標記的寡核苷酸固定在基體上的化學基團標記，因此所述間隔物可以在接近於所述基體的寡核苷酸的末端。

一個具體實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將所述寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上且其中標記的寡核苷酸是標記的ssdna。

一個具體實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將所述寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上且其中標記的寡核苷酸是標記的sslna。

所述寡核苷酸可以源自天然存在或人工製備的核酸分子。它們可以包括編碼和/或非編碼區域。根據本發明，寡核苷酸可以具有約2至約2000個核苷酸、更優選約2至約500個核苷酸、或約2至200個、特別優選約2至約100個核苷酸的長度。還優選的是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸的長度。

具體而言，本發明克服了附接寡核苷酸特別是100個核苷酸或更低吸附力的寡核苷酸不是非常有效的問題。增加核苷酸和基體之間的吸附力的基體和方法阻礙寡核苷酸形成雙鏈體或促進非特異性靶標與微陣列結合的能力。通過使用附接至少一個適用於通過吸附、特別是物理吸附將寡核苷酸與聚合物基體結合的化學基團的寡核苷酸，已經克服了該問題。

本發明的方法不包括光化學交聯諸如uv暴露的步驟。本發明的方法也不採用化學交聯步驟。所述方法不包括改變聚合物基體的電荷，使得聚合物基體的表面具有特定電荷。

在一個具體實施方案中，施加在未修飾的聚合物基體上的混合物包含液體和標記的寡核苷酸。所述液體可以是適合於溶解寡核苷酸用於施加和固定在基體上的任何液體，諸如水或緩衝溶液諸如pbs、碳酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液和檸檬酸鹽緩衝液。所述緩衝溶液可以包含例如蔗糖、三甲基甘氨酸(甜菜鹼)、海藻糖、甘油、吐溫、n-十二烷醯基肌氨酸(sarkosyl)、pva和/或peg。在一個優選實施方案中，所述緩衝液包含蔗糖和甜菜鹼。

在一個具體實施方案中，所述液體可以不包括陽離子去垢劑類化合物，諸如十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、辛基二甲基胺(oda)。在另一個具體實施方案中，所述液體可以不包括ctab、edc或oda。

蔗糖的濃度可以是1％至50％、5％至40％、10％至30％、優選20％。三甲基甘氨酸的濃度可以是1mm至50mm、5mm至30mm、10mm至20mm、優選15mm。

在一個具體實施方案中，緩衝液包含pbs、蔗糖和三甲基甘氨酸。

本發明的一個具體實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含緩衝液和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

本發明的一個具體實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含緩衝液和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物非接觸印刷在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將所述寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上，且其中所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含緩衝液和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物非接觸印刷在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將所述寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上，且其中所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上，其中所述未修飾的聚合物基體是coc，其中所述標記的寡核苷酸包含化學基團，其為生物素或有機非蛋白螢光團，諸如磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)，且其中所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含緩衝液和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物非接觸印刷在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上，其中所述未修飾的聚合物基體是coc，其中所述標記的寡核苷酸包含化學基團，其為生物素或有機非蛋白螢光團，諸如磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)，且其中所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上，其中標記的寡核苷酸是ssdna，其中所述未修飾的聚合物基體是coc，其中所述標記的寡核苷酸包含化學基團，其為生物素或有機非蛋白螢光團，諸如磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)，且其中所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含緩衝液和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物非接觸印刷在未修飾的聚合物基體上，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上，其中標記的寡核苷酸是ssdna，其中所述未修飾的聚合物基體是coc，其中所述標記的寡核苷酸包含化學基團，其為生物素或有機非蛋白螢光團，諸如磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)，且其中所述方法不包括uv暴露的步驟，且所述寡核苷酸不共價結合至基體。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上和孵育所述聚合物基體，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

聚合物基體的孵育可以在室溫、例如18℃至25℃、優選20℃至22℃下進行30秒至5小時、5分鐘至4小時、10分鐘至3小時、15分鐘至1小時、優選30分鐘。

所述孵育可以在10％至90％、20％至80％、30％至70％、40％至60％、優選50％的相對溼度下進行。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，和基體乾燥，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的聚合物基體上，孵育所述基體，和基體乾燥，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

如本文所用的術語「基體乾燥」是指將基體在約25℃至70℃、約30℃至45℃、優選約35℃至39℃、更優選約37℃的溫度下孵育。由此，混合物的液體蒸發。在該步驟期間，不發生標記的核酸和基體之間的交聯。

步驟基體乾燥可以持續本領域技術人員已知的任何合適時段、例如30分鐘至36小時、持續1小時至30小時、持續10至22小時進行。基體乾燥可以通過本領域技術人員已知的任何合適的方式、例如乾燥室或烘箱或培養箱進行。除了溫度之外，還可以將其他參數如溼度、通氣或通風調節至本領域技術人員已知的合適值。

未修飾的基體可以例如通過常規蒸汽滅菌(高壓滅菌)或伽瑪輻照來滅菌。優選地，將未修飾的基體進行伽馬處理。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的基體上，孵育所述基體，基體乾燥，和洗滌所述基體，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的基體上，基體乾燥，和洗滌所述基體，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的基體上，孵育所述基體，和洗滌所述基體，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的基體上，和洗滌所述基體，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

為了洗滌基體，可以使用含有pbs和tween20的洗滌緩衝液。所述緩衝液可以是例如0.5xpbs和0.01%tween20。

將所述基體置於洗滌緩衝液中1秒至1小時、10秒至30分鐘、30秒至10分鐘、45秒至5分鐘、優選1分鐘。

可以通過本領域技術人員已知的方法，諸如將基體置於乾燥櫃中，從基體去除洗滌緩衝液。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的基體上，孵育所述基體，基體乾燥，洗滌所述基體，和從基體去除洗滌緩衝液，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的另一個實施方案是指用於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上的方法，所述方法包括以下步驟：提供包含液體和標記的寡核苷酸的混合物，將所述混合物施加在未修飾的基體上，孵育所述基體，基體乾燥，洗滌所述基體，和從基體去除洗滌緩衝液，其中經由物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的另一個方面涉及與寡核苷酸附接的標記用於通過物理吸附將標記的寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上的用途。

基體和寡核苷酸之間的吸附通過標記的寡核苷酸的標記來賦予。這從圖1至3變得清楚，其顯示沒有標記的寡核苷酸未固定在coc基體上(圖1)，而當用德克薩斯紅(圖2)或生物素(圖3)標記寡核苷酸時，可以檢測到包含幾個標記的寡核苷酸的清晰斑點，顯示標記的寡核苷酸被固定在基體上。這清楚地顯示，只有如本文所限定的具有標記的寡核苷酸被固定在聚合物基體諸如coc上。

因此，在本發明中，標記的寡核苷酸的固定通過將標記的寡核苷酸的標記吸附至未修飾的聚合物基體來介導。

本發明的一個額外方面是指通過本文所述的方法實現的微陣列。

如本文所用的術語「微陣列」是指呈現陣列中的捕獲分子和周圍環境(例如介質、反應溶液、優選雜交溶液)中的潛在相互作用物之間的相互作用的有序或隨機陣列。微陣列可以包括可尋址區域的任何二維或三維排列，優選二維排列。典型的微陣列可以含有多個斑點、特徵、單個固定的區域或單個分子身份的區域。例如，陣列可以含有多於2、5、10、50、100、500、750、1000、1500、3000、5000、10,000、20,000、40,000、50,000、70,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、750,000、800,000、1,000,000、1,200,000、1,500,000、1,750,000、2,000,000或2,100,000個斑點、特徵、捕獲分子或單個固定的區域或單個分子身份的區域。這些區域可以包含在小於約20cm2、小於約10cm2、小於約5cm2、小於約1cm2、小於約1mm2、小於約100µm2的區域中。在進一步實施方案中，微陣列內的斑點大小可以在約1至300μm的範圍內，例如具有10、50、100、150、200或250μm的大小，或者具有在所述值之間的任何合適的值。在進一步實施方案中，探針(寡核苷酸)密度可以根據需要變化。探針密度的實例是1000至5,000,000個探針/μm2的密度，例如，2000、10,000、50,000、75,000或1,000,000個探針/μm2的探針密度。

在具體實施方案中，此類斑點、特徵或單個固定的區域可以包含任何合適的覆蓋度，例如，一個或多個特定序列、或基因組或基因組部分中的1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的覆蓋度。因此，微陣列可以例如包含相同捕獲分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷貝。可選地或另外，其可以包含捕獲分子的變型，例如，錯配變體，具有單個或多個核苷酸多態性的變型，單個或多個核苷酸多態性的不同版本，具有不同起始或終止序列(例如，標籤、引物結合位點、內切核酸酶識別位點)、但具有相同的核心部分的捕獲分子等。

本文提及的微陣列可以包含與寡核苷酸分子附接的「一種或多種」寡核苷酸分子或「一種或多種」目標分子，即微陣列中可以存在一種或多種不同類型的分子。或者，術語「一種或多種」也涉及相同類別或具有相同形式或格式(例如，dna)、但它們在其分子身份(例如，序列)上不相同或相似的寡核苷酸。因此，根據本發明的反應區或捕獲區可以包含不同的寡核苷酸。如果根據本發明的反應區或捕獲區中存在不同分子身份的寡核苷酸，特別是核酸，則這些寡核苷酸可以是部分相同或部分相似的，即特別是在核酸的情況下，在序列方面具有重疊或可能沒有重疊。根據本發明的寡核苷酸可以例如包含、覆蓋或代表基因組的任何合適區域或百分比的序列，例如，基因組的約0.00001%至約30%，諸如生物體的基因組、優選地哺乳動物基因組、更優選人類基因組的至少約0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20或30％，和/或與此類區域互補。此區域或百分比可以包含例如約2至5,000個基因，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、150、200、350、500、750、1000、1200、1500、2000、2500、3000、4000、5000或超過5000個基因的組。此類基因可位於鄰近的基因組區或區域中，或者可以可選地分散在整個基因組中。也設想基因的亞組、組合、模式，例如源自表達數據的模式等。

本發明的進一步的方面涉及包含未修飾的聚合物基體和固定在所述基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的聚合物基體之間不存在共價鍵。

在本發明的一個實施方案中，所述聚合物基體選自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、環烯烴共聚物(coc)、氟化聚醯亞胺、聚苯乙烯(ps)、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚碸。

在本發明的一個優選實施方案中，所述聚合物基體是環烯烴共聚物(coc)。

在另一個優選實施方案中，所述標記的寡核苷酸包含至少一個化學基團與其附接的寡核苷酸，其中所述化學基團適合於將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

在一個具體實施方案中，所述標記的寡核苷酸包含至少一個化學基團與其附接的寡核苷酸，其中所述化學基團優選具有0.1至1000kda、0.1至50kda、0.1至1.5kda、0.15至1kda、0.2至0.8kda的分子量。

在進一步的實施方案中，所述化學基團是這樣的化學基團，其優選地選自生物素或磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)。

在另一個實施方案中，所述標記的寡核苷酸的長度為約2至約2000個、約2至500個、約2至約200個核苷酸、約2至約100個核苷酸、約2至約50個核苷酸。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的聚合物基體和固定在所述未修飾的聚合物基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的聚合物基體之間不存在共價鍵，且其中通過吸附、具體地物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的聚合物基體上。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的聚合物基體和固定在所述未修飾的聚合物基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的聚合物基體之間不存在共價鍵，且其中通過吸附、具體地物理吸附將標記的寡核苷酸經由其標記固定在未修飾的聚合物基體上。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，且其中標記的寡核苷酸是標記的ssdna。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，且其中通過吸附、具體地物理吸附將寡核苷酸固定在未修飾的coc基體上。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，且其中通過吸附、具體地物理吸附將標記的寡核苷酸經由其標記固定在未修飾的coc基體上。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，且其中用至少一個適合於將標記的寡核苷酸固定至coc未修飾的基體的化學基團標記所述寡核苷酸。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，且其中所述寡核苷酸用至少一個選自發色團或生物素的化學基團標記。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，且其中所述寡核苷酸用至少一個選自磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)或生物素的化學基團標記。

本發明的一個具體方面涉及包含未修飾的coc基體和固定在所述未修飾的coc基體上的標記的寡核苷酸的微陣列；其中在所述寡核苷酸和未修飾的coc基體之間不存在共價鍵，其中所述寡核苷酸用至少一個選自磺醯羅丹明101醯基氯(cas號82354-19-6；德克薩斯紅)或生物素的化學基團標記，且其中標記的寡核苷酸是標記的ssdna。

在本發明的一個實施方案中，通過物理吸附將標記的寡核苷酸固定在未修飾的基體上。

本發明的進一步的方面涉及診斷試劑盒，其包含根據如本文所述的方法固定的寡核苷酸的陣列和含有確定量的與所述固定的寡核苷酸中的至少一種互補的已知、標記的核酸的對照探針。

本發明的進一步的方面涉及診斷試劑盒，其包含含有根據如本文所述的方法固定的寡核苷酸的微陣列和含有確定量的與所述固定的寡核苷酸中的至少一種互補的已知、標記的核酸的對照探針。

術語「含有確定量的與…互補的已知、標記的核酸的對照探針」涉及充分定義的寡核苷酸，其被提供有標記，優選螢光標記，且用於校準和/或測試或質量檢查以陣列的形式存在的固定的寡核苷酸中的至少一種。

一個額外的實施方案是指如上所限定的微陣列用於雜交測定、用於表面擴增、用於定量和/或多重檢測dna或rna分子、用於表達分析、用於比較基因組雜交、用於檢測單核苷酸多態性或用於基於基因組選擇的測序的用途。

本發明的微陣列特別適合於核酸檢測，諸如微陣列，雜交測定諸如夾心雜交測定，表面擴增。本發明的基體可以與磁珠組合使用。

為了說明性目的，提供以下實施例和附圖。因此，應當理解，實施例和附圖不應被視為限制性的。本領域技術人員將清楚地能夠設想本文展示的原理的進一步修改。

本發明的另一個方面涉及用於將目標分子固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括如本文所述的固定標記的寡核苷酸的方法的步驟，其中步驟a)中提供的標記的寡核苷酸還包含與所述寡核苷酸附接的目標分子。

目標分子可以附接至用於固定的標記與其附接的寡核苷酸的相對側。這意味著，如果在寡核苷酸的3'末端附接用於固定的標記，則目標分子可以附接至寡核苷酸的5'末端。反之亦然，如果在寡核苷酸的5'末端附接用於固定的標記，則目標分子可以附接至寡核苷酸的3'末端。

在一個具體實施方案中，如果目標分子附接至用於固定的標記與其附接的寡核苷酸，則寡核苷酸可以對目標分子沒有結合親和力。在該情況下，寡核苷酸充當接頭以將目標分子固定至聚合物基體，並且不參與目標分子和靶分子的結合。

本發明的另一個方面涉及用於將目標分子固定在未修飾的聚合物基體上的方法，所述方法包括如本文所述的固定標記的寡核苷酸的方法的步驟，且此外至少包括步驟：c)將目標分子與其附接的寡核苷酸雜交。

如本文所用的術語「目標分子」是指例如蛋白、肽或抗體、小分子、分子印跡聚合物、蛋白適體或肽適體。「目標分子」可以對靶分子具有結合親和力。

實施例

實施例1–將ssdna固定在coc基體上

用scienionsciflexarrayers11噴墨印表機在封閉環境中在室溫(21℃)和約50％的相對溼度下將含有德克薩斯紅標記或生物素標記的ssdna寡核苷酸(40個核苷酸)或生物素標記的、具有20％蔗糖和15mm甜菜鹼的1xpbs的印刷緩衝液印刷在伽瑪處理的coc基體上。印刷後，將基體保持在該環境中半小時，然後將其轉移至溫度為37℃的恆溫箱中用於乾燥過夜。第二天，通過將這些基體倒置在含有洗滌緩衝液的洗滌浴中1分鐘(具有0.01%tween20的0.5xpbs)來將它們輕輕洗滌。通過在紙巾上輕輕敲擊基體來除去過量液體，並將基體置於乾燥櫃中1小時(室溫，相對溼度~10%)。所述基體現在容易用於進一步組裝，並保存在4℃下的密封袋中，並加入二氧化矽珠粒以保持低於10％的溼度以使冷凝最小化。

實施例2–夾心雜交測定

為了測試斑點質量，在具有固定的標記寡核苷酸的基體上進行夾心雜交測定。與用探針標記的磁性顆粒和靶寡核苷酸(溶解在緩衝溶液中)一起進行雜交。通過在特定溫度(40℃至60℃)下在緩衝溶液中用磁性脈衝驅動磁性顆粒來促進夾心雜交。用磁石洗掉未結合的磁性顆粒。圖4顯示具有固定的德克薩斯紅標記的寡核苷酸的基體的示意性橫截面，磁性顆粒經由探針與德克薩斯紅標記的寡核苷酸雜交。在該具體實施方案中，所述寡核苷酸包含在3'末端的20nt長度的間隔物區和在其5'末端的對於探針具有結合活性的20nt長度的區域。因此，所述探針與固定的寡核苷酸和磁性顆粒雜交。

實施例3–磁性顆粒的檢測

通過使用ccd照相機的受抑全內反射(f-tir)將結合的磁性顆粒進行成像。來自發光二極體的準直光束(λ=625nm)在全內反射的條件下照射傳感器表面。在基體/流體界面處生成所謂的漸逝光場，其以指數方式衰減並僅通過亞波長距離穿透至流體中。在磁性顆粒不存在的情況下，從漸逝光場沒有提取光(圖1)。當磁性納米顆粒存在於傳感器表面時，所述顆粒吸收並散射部分光，因此使全內反射受抑，從而降低反射光的強度(圖2、圖3)。將基體表面成像至ccd相機上。

參考文獻符號的列表：

y.sun等人,anal.bioanal.chem.(2012)402:741-748.

d.sabourin等人,biomed.microdevices.(2010)12:673-681.

n.kimura,bbrc347(2006)477-484。