一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒的製作方法

2023-07-19 00:31:36 1

專利名稱：一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗領域，特別涉及一種利用人心型脂肪酸結合蛋白相關的免疫反應及螢光檢測技術，以早期、敏感、特異的定量篩查和檢測急性心肌梗死。
背景技術：
急性冠脈症候群(ACQ是冠心病中重要的急性事件之一，主要分為急性心肌梗死 (AMI)、不穩定心絞痛(UA)以及心源性猝死(SCD)，其發病率和病死率均較高。但若能在發病後及早辨別高危患者並進行再灌注治療，則病死率及預後將會有明顯改善。其中，心臟標誌物在ACS的診斷及預後過程中，扮演著至關重要的角色。目前，常用的心臟標誌物包括肌鈣蛋白(cTn)、肌紅蛋白(MYO)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)等。因ACS具有發病急、危害大的特點，所以選出特異性高的早期心臟標誌物，進行提早診斷，及時治療，這對於ACS患者而言具有非常重要的意義。心型脂肪酸結合蛋白(hFABP)由132個胺基酸組成，分子量為15KDa，是心臟中富含的一種新型小胞質蛋白，它具有高度心臟特異性。在心肌缺血損傷出現後，hFABP可以早在胸痛發作後1 3小時出現於血液中，6 8小時達到峰值，而且血漿水平在M 30小時內恢復正常。在AMI患者症狀發作後的第一個對小時內連續測量hFABP可以①識別對再灌注療法靈敏的患者；②發現圍手術期AMI患者；③早在開始血栓溶解療法後30分鐘區別再灌注和未灌注梗塞相關動脈的患者；④若它在症狀發作後10小時內出現，可以發現再梗塞；⑤能準確估計心肌梗死面積以提供重要的預後信息。與其它幾種常用心臟標誌物於心肌損傷後出現在血液中的時間和濃度變化對比發現，在心肌損傷早期(6小時內)，較其它心臟標誌物而言，hFABP和MYO在診斷評估方面具有明顯的時間優勢。其中，MYO也是一種低分子量細胞質蛋白，存在於骨骼肌和心肌細胞中，因在炎症、局部缺血、SLE、休克及皮肌炎等情況下亦會引起MYO的血液濃度升高，因此作為心肌細胞損傷的診斷指標具有特異性較低的特點。而hFABP相對於MYO具有著高度的心肌特異性，所以作為心肌損傷的早期標誌物，選擇hFABP更為理想。目前，傳統的心肌標誌物檢測方法主要包括放射性免疫法、酶聯免疫法、化學發光免疫法及膠體金免疫層析法等。其中，放射性免疫法因涉及放射性物質，存在放射線輻射和汙染的缺點；酶聯免疫法操作複雜，檢測耗時長；化學發光法對技術要求高，測試成本高， 不易在臨床實驗室中進行常規開展；而膠體金免疫層析法雖然具有樣品用量少，簡便快速， 便宜的優勢，然而當遇到某些樣品中目標分析物含量較低時，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結果，容易出現誤判，靈敏度低。在免疫層析系統中，除膠體金、膠體硒、乳膠顆粒及碳顆粒以外，量子點亦可被用作可視或可被儀器檢測的指示物質。它具有發光強度高、激發光譜寬、發射光譜窄、螢光壽命長、表面修飾多功能化及穩定性好等眾多優點，在螢光檢測領域具有取代傳統有機螢光染料的潛力，已成為新一代生物螢光標記物。對膠體金免疫層析而言，定性/半定量分析是依據膠體金顆粒對光的吸收和散射進行檢測的。與檢測螢光強度相比，具有靈敏度低、定量不準確等缺點。因此，基於量子點及免疫層析的諸多優勢，需要研製一種利用量子點螢光定量檢測心肌損傷早期標誌物(hFABP)的方法，彌補現有技術中存在汙染、操作步驟繁瑣、成本高或靈敏度低、定量不準確的不足之處。

發明內容
本發明的目的在於將可用於急性心肌梗死早期檢測的生化標誌物心型脂肪酸結合蛋白(hFABP)與免疫層析技術及螢光檢測技術相結合，設計出一種快速定量檢測急性心肌梗死的免疫試紙條，以用於AMI的早期篩選和診斷評估，解決各級醫院，特別是基層醫院中缺少快速、簡便篩查早期AMI有效手段的現狀。實現上述目的的技術方案如下步驟1)用化學交聯或生物分子間特異性作用將人心型脂肪酸結合蛋白的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，所述抗體修飾的量子點的發射波長範圍為 550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點固定在標記墊上，且標記墊上同時固定有質控分子修飾的量子點，所述質控分子修飾的量子點的發射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點的發射波長不同，且波長範圍為550 1300·，在層析膜上分別設有定量帶和質控帶，其中質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子，定量帶固定有對應心型脂肪酸結合蛋白的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標記墊、層析膜、吸水墊和底板構建成螢光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱螢光層析膜，底板具低螢光特性；步驟4)試紙條免疫層析後，檢測定量帶和質控帶的螢光信號強度，並以質控帶螢光信號強度校正定量帶的螢光信號強度，進而實現人心型脂肪酸結合蛋白的定量檢測。本發明提供的一種定量檢測hFABP的螢光免疫層析的方法，是一種以量子點為螢光信號，採用雙色標記技術，在免疫層析試紙條上實現hFABP快速靈敏檢測的方法。本發明定量檢測hFABP的螢光免疫層析方法能夠解決現有螢光免疫層析技術中背景與信號難區分、靈敏度低、螢光定量方法不明確的不足和缺陷，可實現對微量樣品的檢測。由於量子點螢光受激發光幹擾很小，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統染料和有色標記物檢測方法的10 1000倍。本發明採用化學交聯或生物分子間特異性作用將hFABP的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，其中所述特異性抗體為抗hFABP的單克隆抗體或多克隆抗體。本發明中的化學交聯為當量子點表面存在活性基團時，可與特異性抗體直接反應，不需用化學交聯劑；反之，則需採用化學交聯劑將抗體與量子點相偶聯。其中，化學交聯劑包括1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及戊
二醛等。作為優選，在本發明的一個實施例中，採用EDC/NHS交聯法對量子點進行蛋白修飾。其一般步驟為將純化後的量子點溶液與EDC和NHS混合，然後加入一定量的蛋白質，以緩衝液作為反應介質，培育4小時，加入甘氨酸封閉，並以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到蛋白修飾的量子點螢光納米顆粒。生物分子間特異性作用包括生物素-親和素系統和抗原-抗體系統。作為優選， 在本發明的另一個實施例中，採用生物素-親和素系統的結合方式對標記物進行量子點修飾，該結合方式具有放大信號的作用。具體為將生物素連接到蛋白質分子表面，通過親和素-生物素間的相互作用，將蛋白質分子偶聯到鏈黴親和素修飾量子點的表面。為了提高信號與背景的區分度，本發明選用發射光波長為550 1300nm的量子點。因在紫外照射下，層析膜、底板和扣卡的螢光強度在550nm以下遠強於550nm以上，從而對低濃度hFABP檢測時產生一定的影響，故優選發射波長大於550nm的量子點。此外，層析膜、底板和扣卡在近紅外區域(750 1300nm)螢光強度極弱，結合量子點合成技術，優選近紅外波長的量子點(750 1300nm)進一步提高靈敏度。本發明所用量子點包含單一化合物形成的量子點或是幾種化合物組裝成的複合物量子點，且量子點具有較強的光穩定性。形成量子點的化合物是從aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 組成的組中選擇的，且可摻雜Cu、Mn和Hg。其中，質控分子修飾的量子點與hFABP抗體修飾的量子點可採用相同發射波長的量子點。但在本發明中，為了減弱質控分子修飾的量子點對定量帶及背景信號的影響，採用雙色標記技術，即選用兩種發射波長不同的量子點分別標記質控分子和抗體。作為優選，在本發明的一個實施例中，結合墊中與hFABP結合的抗體修飾的量子點的發射波長為650nm，質控分子修飾的量子點的發射波長為570nm。作為優選，在本發明的另一個實施例中，結合墊中與hFABP結合的抗體修飾的量子點的發射波長為900nm，質控分子修飾的量子點的發射波長為600nm。作為優選，在本發明的實施例中，使用有機相方法合成570nm、600nm和650nm的 CdSe/aiS，並把量子點由脂溶性轉為水溶性，此過程中量子點螢光無明顯變化；使用水相方法合成900nm的hAs。為了降低對量子點螢光信號的影響，本發明採用弱螢光的層析膜、低螢光的底板以及低螢光的扣卡，從而保證獲得高螢光信背比，能良好區分信號與背景，進而提高檢測靈敏度。作為優選，在本發明的實施例中，底板為黑色，表面附有不乾膠，且扣卡、層析膜、 底板及不乾膠均不含有螢光劑。本發明實施例中螢光免疫層析試紙條由樣品墊、標記墊、過濾膜、層析膜、吸水墊和底板組成，如圖1所示。在標記墊上固定有hFABP特異性抗體修飾的量子點，以及質控分子修飾的量子點。在試紙條層析膜上分別設有定量帶和兩條質控帶，其中定量帶固定有對應hFABP的與上述標記墊中特異性抗體不同抗原表位的特異性抗體，質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子。本發明定量帶是判定樣品中hFABP含量的主要指標，並且受質控帶螢光信號強度校正，以提高定量準確度。此外，通過增加定量帶的條數，可擴大試紙條的檢測範圍，避免出現HOOK效應。在本發明的一個實施例中，發明人所選用的樣品為血清，且樣品進一步包含全血和血漿。當樣品為全血時，螢光免疫層析試紙條還包括在樣品墊與層析膜之間設置的過濾膜，用於凝固、過濾細胞，該過濾膜可分別與標記墊和層析膜直接毛細作用接觸，如圖1所示，也可與樣品墊和標記墊直接毛細作用接觸，如圖3所示。其中，過濾膜還可以與樣品墊合併為同一結構，同時擁有樣品收集、釋放及過濾的作用。本發明實施例採用預潤免疫層析方法對待測樣品中的hFABP進行定量檢測。其中預潤免疫層析為滴加一定體積的緩衝液到層析膜上，潤溼一定時間後，將樣品加入樣品墊中，然後樣品沿層析膜向吸水墊方向層析運動。預潤的目的是預潤溼層析膜，封閉非特異性結合位點，以使量子點標記物均勻通過層析膜，減少在層析膜上的非特異性吸附，並減緩樣品的層析速度，從而提高特異性結合效率。其中滴加緩衝液體積一般為20 80μ 1，潤溼時間為30秒 2分鐘，而樣品層析時間通常為8 25分鐘。本發明的預潤免疫層析包括將緩衝液直接或間接滴加於層析膜。當將緩衝液間接滴加於層析膜時，螢光免疫層析試紙條還包括潤溼墊和連接墊，其中潤溼墊分別與層析膜和連接墊以毛細作用接觸，連接墊分別與潤溼墊和吸水墊以毛細作用接觸。緩衝液通過潤溼墊到達層析膜。本發明的緩衝液為ρΗ 7. 2 11的鹼性緩衝液，且該鹼性緩衝液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白及表面活性劑。其中，表面活性劑可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇及聚乙烯基吡咯烷酮等。作為優選，在本發明的實施例中使用包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液。本發明的檢測用螢光定量儀包含激發光源模塊、濾光模塊、光電轉換模塊、控制分析模塊以及軟體系統。其中激發光源模塊包含光源及聚光裝置，該光源為發光二極體或雷射二極體，且波長位於300 400nm之間或500 600nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應量子點的螢光信號。光電轉換模塊包括圖像傳感器或者光電倍增管。層析結束後，在光源激發下，試紙條產生的螢光信號經濾光模塊濾除雜散光及背景螢光，到達光電轉換模塊，獲得數位訊號。其中所獲質控帶與定量帶的螢光信號強度具有一定的相關性，主要影響因素包括溫度、溼度、基質等。本發明檢測結果的判定方法如果質控帶螢光信號強度超出螢光定量儀內部設定的可接受值，說明檢測結果無效；在檢測結果有效前提下，定量帶與質控帶螢光信號強度的比值越高，表示樣品中目標檢測物的濃度越高，反之越低。本發明採用螢光定量儀檢測一系列不同濃度的標準品，繪製標準曲線。其中標準曲線為標準品系列濃度(c)與所對應的校正螢光信號強度(F)的關係曲線，關係式為F = f (c)，校正螢光信號強度為F= α Fi^i/FIi^，其中α為校正係數，受溫度、溼度和基質等影響。然後檢測樣品，依據標準曲線可獲得樣品中hFABP的濃度。本發明提供了一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白的螢光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、螢光免疫層析試紙條及緩衝液，如圖4所示。該試劑盒採用直接預潤免疫層析方法。扣卡(1 為螢光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括上樣孔(11)、視窗(12)，且具低螢光特性或不含螢光劑。
本發明實施例中的直接預潤免疫層析試紙條，其結構包括樣品墊(1)、標記墊 O)、層析膜G)、吸水墊( 和底板(6)。層析膜(4)包含質控帶(8)和定量帶(7)。當進行全血樣品檢測時，試紙條還包括過濾膜(3)，具體結構如圖1所示，其中樣品墊(1)、標記墊O)、過濾膜(3)、層析膜(4)和吸水墊(5)搭載於底板(6)之上，樣品墊⑴位於上樣孔 (11)的下方，且連接於標記墊0)，標記墊( 連接於過濾膜(3)，過濾膜C3)連接於層析膜 G)，層析膜(4)上固定有兩條質控帶(8)和兩條定量帶(7)，且質控帶(8)位於定量帶(7) 的兩側，層析膜(4)位於視窗(12)的下方，層析膜(4)連接於吸水墊(5)。在對試紙條預潤時，可將緩衝液直接滴加於窗口(1 內的層析膜上，其中滴加位置為質控帶(8)的兩側，可靠近樣品墊一側，亦可靠近吸水墊一側。本發明還提供了一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白的螢光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、螢光免疫層析試紙條及緩衝液，如圖5所示。該試劑盒採用間接預潤免疫層析方法。扣卡(1 為螢光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括上樣孔(11)、視窗(1 和潤溼孔(14)，且具低螢光特性或不含螢光劑。本發明實施例中的螢光免疫層析試紙條結構如圖2所示，其包含樣品墊(1)、標記墊O)、層析膜、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊( 和底板(6)。層析膜(4)包含質控帶(8)和定量帶(7)。其中樣品墊(1)、標記墊(2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10) 和吸水墊(5)搭載於底板(6)之上，樣品墊(1)位於上樣孔(11)的下方，且連接於標記墊 O)，標記墊( 連接於層析膜，層析膜(4)上固定有兩條質控帶(8)和兩條定量帶(7)， 且質控帶(8)位於定量帶(7)的兩側，層析膜(4)位於視窗(1 的下方，層析膜(4)連接於潤溼墊(9)，且潤溼墊(9)位於潤溼孔(14)的下方，潤溼墊(9)連接於連接墊(10)，連接墊(10)連接於吸水墊(5)。進行全血樣品層析時，試紙條還包括過濾膜(3)，具體結構如圖3所示，其中試紙條包含樣品墊(1)、標記墊O)、過濾膜(3)、層析膜、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊 (5)和底板(6)。過濾膜(3)連接於樣品墊⑴與標記墊(2)之間。本發明構建的預潤免疫層析試紙條，其特徵是，增加了潤溼墊(9)和連接墊(10)， 其中潤溼墊分別與層析膜(4)和連接墊(10)毛細作用接觸，用於緩衝液的滴加，以潤溼層析膜G)，並減少非特異性吸附。連接墊(10)分別與潤溼墊(9)和吸水墊(5)毛細作用接觸，具有緩慢的吸水速度，以減少潤溼時的吸水量，促使緩衝液充分潤溼層析膜；當加樣品層析時，吸水墊(5) 可通過連接墊(10)吸水，促使樣品層析。試紙條的層析膜(4)具有弱螢光特性或不含螢光劑，其螢光噪聲在大於550nm時很弱，以減少對低濃度hFABP檢測的影響。本發明的主要優點如下1)本發明對AMI的診斷具有良好的時間優勢，具備高特異性、高靈敏度、高符合率的特點，對其早期檢測及預後評估具有重要參考價值。2)本發明採用量子點作為特異性抗體的螢光標記物，與有機螢光染料相比，具有發光強度高、激發光譜寬、發射光譜窄、螢光壽命長、表面修飾多功能化及穩定性好等優勢。 本發明優選了 550 1300nm的量子點，且質控分子和特異性抗體修飾的量子點選用兩種不同發射波長的量子點，以降低非特異性吸附，提高檢測靈敏度。
3)本發明試劑盒組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大於550nm時均具有低的螢光特性，以減少對量子點螢光信號獲取的影響，從而保證獲得高的螢光信背比，進而達到提高靈敏度的目的。4)本發明所述的定量檢測hFABP的螢光免疫層析方法可利用潤溼層析技術，減少非特異性吸附，增強特異性結合，進而提高檢測靈敏度，有利於樣品中hFABP含量極低時的
準確定量。5)本發明方法與常規膠體金免疫層析相比，具有標記穩定性好、非特異性低、靈敏度高、線性範圍寬以及定量準確等優勢。


圖1為直接預潤螢光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標記墊， 3為過濾膜，4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質控帶；圖2為間接預潤螢光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標記墊， 4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質控帶，9為潤溼墊，10為連接墊；圖3為間接預潤螢光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標記墊， 3為過濾膜，4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質控帶，9為潤溼墊，10為連接墊；圖4為直接預潤螢光免疫層析試劑盒示意圖，其中13為扣卡，11為上樣孔，12為視窗，8為質控帶，7為定量帶。圖5為間接預潤螢光免疫層析試劑盒示意圖，其中13為扣卡，11為上樣孔，12為視窗，8為質控帶，7為定量帶，14為潤溼孔。
具體實施例方式本發明公開了一種人心型脂肪酸結合蛋白螢光定量檢測方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明的技術方案為步驟1)用化學交聯或生物分子間特異性作用將人心型脂肪酸結合蛋白的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，所述抗體修飾的量子點的發射波長範圍為 550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點固定在標記墊上，且標記墊上同時固定有質控分子修飾的量子點，所述質控分子修飾的量子點的發射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點的發射波長不同，且波長範圍為550 1300·，在層析膜上分別設有定量帶和質控帶，其中質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子，定量帶固定有對應心型脂肪酸結合蛋白的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標記墊、層析膜、吸水墊和底板構建成螢光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱螢光層析膜，底板具低螢光特性；
步驟4)試紙條免疫層析後，檢測定量帶和質控帶的螢光信號強度，並以質控帶螢光信號強度校正定量帶的螢光信號強度，進而實現人心型脂肪酸結合蛋白的定量檢測。本發明螢光免疫層析的原理和檢測方法為採用螢光免疫層析技術及雙抗體夾心法原理定量檢測樣品(全血、血清或血漿)中的人心型脂肪酸結合蛋白(hFABP)的含量。檢測時，首先滴加緩衝液將層析膜潤溼，然後將樣品加入到上樣孔中，樣品流經標記墊時與量子點標記物相混合，並沿著層析膜向吸水墊方向毛細運動，分別流經層析膜上的定量帶及質控帶。若樣品中含有hFABP，則與量子點表面的hFABP抗體相結合，當層析至定量帶時，會被預先包被於該條帶的抗體所捕獲，從而構成雙抗體夾心複合物。光源激發下，採用螢光定量儀可獲取定量帶和質控帶的螢光信號強度，依據螢光定量儀獲取的標準曲線，進而可分析出樣品中含有hFABP的濃度。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1 以共價交聯方式將抗體修飾於量子點並採用直接預潤免疫層析對 hFABP的定量檢測(一 )量子點與抗體的修飾將發射波長為650nm的量子點與lmg/mL的hFABP單克隆抗體混合，並在新鮮配製的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS，lmg/mL)和碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，lmg/mL)作用下室溫反應 4 證，加入lmol/L甘氨酸封閉，並用色譜柱或層析柱分離純化，得到hFABP單克隆抗體修飾的量子點。同理得到兔IgG修飾的量子點。其中hFABP抗體修飾的量子點的螢光發射波長為650nm，兔IgG修飾的量子點的螢光發射波長為570nm。(二)試劑盒的構建以1 1的比例混合兩種量子點標記物，並加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗糖(1 15%)以及吐溫20、曲拉通X-100等表面活性劑，其中表面活性劑的含量在0.05 2%之間，隨後均勻噴塗在標記墊上，37°C乾燥後密封，4°C下保存。如圖1所示，組裝定量檢測hFABP的螢光免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、標記墊 (2)、過濾墊C3)、層析膜(4)、吸水墊( 組成，順次粘貼於黑色底板(6)上。其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為待檢樣品收集區；標記墊中含有hFABP抗體修飾的量子點以及兔IgG修飾的量子點；層析膜上包含定量帶(7)和質控帶(8)，定量帶和質控帶的間隔R為 3mm彡R彡8mm,且定量帶(7)固定有區別於標記墊中hFABP抗體的另一抗原表位hFABP抗體，質控帶(8)包被了羊抗兔抗體，位於定量帶的兩側；潤溼墊與層析膜毛細搭接1 2mm ； 連接墊分別與潤溼墊和吸水墊毛細作用接觸，起緩衝連接作用。組裝好後，按照要求切割為所需寬度，並置於扣卡(13)內，如圖3所示，加入乾燥劑封裝，與鹼性緩衝液共同構建為螢光免疫層析試劑盒。(三)樣品的檢測A)將hFABP抗原標準品用正常人全血作為稀釋液分別配製為Ong/mL和60ng/mL 濃度；B)將步驟A)中兩種濃度的hFABP標準品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和05的比例進行混合；C)在層析膜上滴加20μ L的緩衝液，該緩衝液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的PH 9. 0的磷酸緩衝液，層析反應30s ；D)分別將步驟B)中配製的全血溶液(120 μ L)滴加於上樣孔(11)中，正向層析反應 15min ；E)置於螢光定量儀中獲取螢光信號強度，並繪製相應的標準曲線；F)同步驟C)和步驟D)操作，對待測樣品進行檢測，層析結束後，置於螢光定量儀內獲取螢光信號強度，並依據步驟E)中的標準曲線分析該樣品中hFABP的含量；G)輸出檢測報告。(四)結果分析結果表明，其最低檢測限為0. 5ng/mL，最低定量限為1. 7ng/mL，且批內與批間重複性均較好，相關係數R2 > 0. 99，對心血管疾病的診斷具有參考價值。實施例2 以生物素-親和素系統將抗體修飾於量子點並採用間接預潤免疫層析對hFABP的定量檢測(一 )量子點與抗體的修飾首先採用pH 9. 0的碳酸氫鈉緩衝液對ImL的hFABP單克隆抗體(lmg/mL)進行充分透析，加入20 120 μ 1 二甲亞碸(DMSO)新鮮配製的N-羥基琥珀醯亞胺生物素酯(NHSB， lmg/mL)，室溫避光反應4h。加入lmol/L NH4Cl,室溫下振蕩反應lOmin，然後將溶液置於透析袋中，過夜透析純化，並採用超濾離心管濃縮，配製為所需濃度，所得即為生物素化hFABP 單克隆抗體。將鏈黴親和素修飾的發射波長為900nm的量子點和生物素化的hFABP單克隆抗體按照1 3 1 12的比例混合反應30 60min，所得即為hFABP單克隆抗體修飾的量子點。依據實施例1方式可製得兔IgG修飾的量子點。其中抗hFABP抗體修飾的量子點的螢光發射波長為900nm，兔IgG修飾的量子點的螢光發射波長為600nm。( 二)試劑盒的構建以1 1的比例混合兩種量子點標記物，並加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗糖(1 15%)以及吐溫20、曲拉通X-100等表面活性劑，其中表面活性劑的含量在0.05 2%之間，隨後均勻噴塗在標記墊上，37°C乾燥後密封，4°C下保存。如圖2所示，組裝定量檢測hFABP的螢光免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、標記墊 (2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(5)組成，順次粘貼於黑色底板(6)上。 其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為待檢樣品收集區；標記墊中含有hFABP抗體修飾的量子點以及兔IgG修飾的量子點；層析膜上包含定量帶(7)和質控帶(8)，定量帶和質控帶的間隔R為3mm彡R彡8mm，且定量帶(7)固定有區別於標記墊中hFABP抗體的另一抗原表位hFABP抗體，質控帶(8)包被了羊抗兔抗體，位於定量帶的兩側；潤溼墊與層析膜毛細搭接1 2mm ；連接墊分別與潤溼墊和吸水墊毛細作用接觸，起緩衝連接作用。組裝好後，按照要求切割為所需寬度，並置於扣卡(13)內，如圖4所示，加入乾燥劑封裝，與緩衝液共同構建為螢光免疫層析試劑盒( 二 )試劑盒的構建及樣品的檢測A)將hFABP抗原標準品用正常人血清作為稀釋液分別配製為Ong/mL和lOOng/mL 濃度；B)將步驟A)中兩種濃度的hFABP標準品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、14和05的比例進行混合；C)在層析膜上滴加40μ L的緩衝液，該緩衝液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的 PH 9. 0的磷酸緩衝液，層析反應Imin ；D)分別將步驟B)中配製的血清溶液(IOOyL)滴加於上樣孔(11)中，層析反應 13min ；E)置於螢光定量儀中獲取螢光信號強度，並繪製相應的標準曲線；F)同步驟C)和步驟D)操作，對樣品進行檢測，層析結束後，置於螢光定量儀內獲取螢光信號強度，並依據步驟E)中的標準曲線分析該樣品中hFABP的含量；G)輸出檢測報告。(四)結果分析結果表明，其最低檢測限為0. 3ng/mL，最低定量限為Ing/mL，批內與批間重複性、 穩定性良好，相關係數可達R2 > 0. 99，能夠為心血管疾病的診斷提供參考價值。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1. 一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白的螢光免疫層析方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟1)用化學交聯或生物分子間特異性作用將人心型脂肪酸結合蛋白的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，所述抗體修飾的量子點的發射波長範圍為 550 1300nm ；步驟幻將步驟1)得到的抗體修飾的量子點固定在標記墊上，且標記墊上同時固定有質控分子修飾的量子點，所述質控分子修飾的量子點的發射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點的發射波長不同，且波長範圍為550 1300·，在層析膜上分別設有定量帶和質控帶，其中質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子，定量帶固定有對應心型脂肪酸結合蛋白的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標記墊、層析膜、吸水墊和底板構建成螢光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱螢光層析膜，底板具低螢光特性；步驟4)試紙條免疫層析後，檢測定量帶和質控帶的螢光信號強度，並以質控帶螢光信號強度校正定量帶的螢光信號強度，進而實現人心型脂肪酸結合蛋白的定量檢測。1.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟1)所述抗體修飾的量子點的發射波長為900nm，步驟2、所述質控分子修飾的量子點的發射波長為600nm。
2.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟1)所述抗體修飾的量子點的發射波長為650nm，步驟2、所述質控分子修飾的量子點的發射波長為570nm。
3.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟1)所述量子點為單一化合物形成的量子點或幾種化合物組成的複合量子點。
4.根據權利要求4所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述化合物為選自aiS、 CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一種或幾種，且可摻雜Cu、Mn和Hg。
5.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟幻所述層析膜在大於 550nm時螢光很弱或不含螢光劑。
6.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟幻所述底板為黑色，表面附有不乾膠，且兩者均不含螢光劑。
7.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟幻所述螢光免疫層析試紙條還包括能使樣品中液體與細胞分離的過濾膜。
8.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟4)所述免疫層析為預潤免疫層析，其中預潤免疫層析為先以緩衝液預潤層析膜，再於樣品墊中加入樣品，當樣品流經定量帶和質控帶後，進行螢光定量檢測。
9.根據權利要求9所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述預潤層析膜是指將緩衝液直接滴加於層析膜。
10.根據權利要求9所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，當所述預潤層析膜為將緩衝液間接滴加於層析膜時，步驟幻所述的螢光免疫層析試紙條還包括潤溼墊和連接墊，其中潤溼墊分別與層析膜和連接墊以毛細作用接觸，連接墊分別與潤溼墊和吸水墊以毛細作用接觸。
11.根據權利要求9所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述鹼性緩衝液為PH.7. 2 11的鹼性緩衝液。
12.根據權利要求12所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述鹼性緩衝液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑的鹼性緩衝液。
13.根據權利要求12所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述鹼性緩衝液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液。
14.一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白的螢光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、螢光免疫層析試紙條及緩衝液，其特徵在於，所述扣卡(1 為螢光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括上樣孔(11)、視窗(1 和潤溼孔(14)；所述螢光免疫層析試紙條包括樣品墊 (1)、標記墊(2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(5)和底板(6)，其中樣品墊 (1)、標記墊(2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(5)搭載於底板(6)之上， 樣品墊(1)位於上樣孔(11)的下方，且連接於標記墊0)，標記墊(2)連接於層析膜0)， 層析膜(4)上固定有兩條質控帶(8)和定量帶(7)，且質控帶(8)位於定量帶(7)的兩側， 層析膜(4)位於視窗(12)的下方，層析膜(4)連接於潤溼墊(9)，且潤溼墊(9)位於潤溼孔 (14)的下方，潤溼墊(9)連接於連接墊(10)，連接墊(10)連接於吸水墊(5)。
15.根據權利要求15所述的螢光免疫層析試劑盒，其特徵在於，所述螢光免疫層析試紙條還包括過濾膜(3)，其中所述過濾膜C3)連接於樣品墊(1)和層析膜(4)之間，且通過毛細作用接觸。
16.根據權利要求15所述的螢光免疫層析試劑盒，其特徵在於，所述扣卡(1 具有低螢光特性或不含螢光劑。
全文摘要
本發明公開了一種定量檢測人心型脂肪酸結合蛋白(hFABP)的螢光免疫層析方法及其試劑盒。本發明的定量檢測hFABP螢光免疫層析方法是利用量子點的優良螢光特性，結合雙色標記技術及免疫層析技術，在優化試紙條各組成部件基礎上，實現的螢光定量檢測。與常規膠體金免疫層析方法相比，本發明具有標記穩定性好、非特異性低、靈敏度高、線性範圍寬以及定量準確的優勢。本發明試劑盒對hFABP進行的定量檢測，可同時檢測全血、血清及血漿樣品，從而為急性心肌梗塞的早期篩查和預後評估提供了一種簡便、準確、特異、價廉的檢測工具，適用於各級醫院，特別有助於在基層醫院及診所的廣泛推廣。
文檔編號G01N33/68GK102520194SQ201110453809
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者王秀利 申請人:深圳康美生物科技股份有限公司