一株高鹽異養硝化-好氧反硝化除磷的小短桿菌及其在廢水處理中的應用的製作方法

2023-07-18 12:24:11

專利名稱：一株高鹽異養硝化-好氧反硝化除磷的小短桿菌及其在廢水處理中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株小短桿菌(Brachybacterium)及其在高鹽廢水處理中的應用。該菌株具有異養硝化-好氧反硝化的功能，可以在高鹽條件下實現同步硝化反硝化脫氮的過程，同時完成汙水中含磷汙染物的去除。
背景技術：
高鹽廢水是指總含鹽量(以NaCl含量計)至少為1%的廢水，這些廢水除含有大量高濃度的有機物外，還含有大量的無機鹽，如Cr、Na+、Ca2+、S042_等。隨著海水直接利用以及高含鹽工業廢水的大量排放，對高鹽廢水處理提出了新的要求，高鹽廢水中的高濃度有機物或營養物，如C0D、N、P等，對水體環境造成巨大壓力，可能加劇江河湖泊富營養化的進程；高鹽廢水滲入土壤系統後也會造成土壤生物、植物因脫水而死亡，進而破壞土壤生態系統。傳統的生物脫氮是在微生物的作用下將汙水中的有機氮和氨態氮轉化為N2的過程，包括硝化和反硝化兩個反應過程。另一方面，生物除磷工藝則通過釋/吸磷過程，最終通過將被細菌過量攝取的磷隨剩餘汙泥排出系統而達到除磷目的。生物脫氮除磷機制的差異使得這兩個過程本身就難以統一，產生矛盾的根本原因是不同功能的微生物所需要的最佳生長條件不同。硝化需要長泥 齡的硝化細菌和好氧條件，反硝化需要短泥齡的反硝化菌和缺氧條件，釋磷需要短泥齡的聚磷菌和厭氧條件，而吸磷則需要好氧條件。此外，反硝化菌和聚磷菌之間還存在著因生活汙水中碳源不足而產生的競爭關係。生物脫氮除磷工藝的發展也主要是圍繞著在同一汙水處理系統中實現脫氮與除磷的矛盾展開的。但是，因高鹽度對常規生物處理系統中微生物的正常代謝會產生不利的影響，主要包括:滲透壓偏高，微生物細胞質壁分離，使生長受到阻礙甚至死亡；微生物代謝酶活性受阻；水體密度增加，影響汙泥沉降效果等。因此，在高鹽條件下除磷脫氮效率都會大大降低，生物脫氮與除磷過程中存在的問題也變得更加複雜，圍繞高鹽條件下脫氮除磷新工藝的探索也一直廣受重視。非高鹽條件下的生物脫氮除磷研究近年來已有較大進展，出現了 SHARON、CANON、OLAND和ΑΝΝΑΜ0Χ等新型脫氮工藝，但這些工藝仍未擺脫好氧厭氧結合的兩段式生物脫氮的限制；在生物除磷方面，發現了特殊的反硝化聚磷菌(DPB)，可在缺氧/厭氧交替的環境下實現硝酸鹽氮和磷的同步去除。隨著研究的深入，研究者也發現了特殊的異養硝化-好氧反硝化細菌，這類細菌能夠在好氧條件下實現氨氮和總氮的同步去除，解決了硝化和反硝化的矛盾。篩選並發現具有特殊脫氮除磷功能的微生物一直是生物脫氮除磷研究領域的熱點和趨勢。篩選耐鹽的聞效菌種也是解決聞鹽條件下廢水處理的有效途徑和研究者關注的焦點。近些年來，有研究者通過培養馴化出耐高鹽的菌種，以及從自然界高鹽環境中分離出耐鹽菌和嗜鹽菌，並將其應用於高鹽廢水處理取得了較好的效果，如Woolard等從大鹽湖的土壤中篩選的嗜鹽菌在SBR反應器中能夠有效處理高鹽含酚廢水。然而，國內外對高鹽廢水的報導大多數關注點在於有機物和氮素的去除，目前幾乎沒有對高鹽條件下具有除磷能力菌種的報導，在高鹽度條件下實現廢水的同步脫氮除磷更是一項具有挑戰性的課題。本發明分離出一株小短桿菌(Brachybacterium),發現其具有耐高鹽兼具異養硝化-好氧反硝化的能力；進一步發現這種細菌在單一好氧條件下兼有同步除磷的能力。利用這類具有特殊性質的細菌的生理特性和代謝機理，基於硝化過程可以是異養細菌的生理行為，而反硝化和除磷過程可以在好氧條件下進行，使得可以在高鹽條件的同一好氧環境下完成脫氮除磷，能夠較好的克服上述提到的傳統生物處理中存在的矛盾問題。

發明內容
本發明的目的在於提供了一種高鹽兼具異養硝化-好氧反硝化和好氧攝磷能力的菌株及其在廢水處理中的應用。本發明提供的小短桿菌(Brachybacterium)菌株已於2012年3月29日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.5947。本發明所提·供的菌株，具有以下表型特徵:在25_35°C下，營養瓊脂培養基上培養16-32h後，菌落表面光滑，淺黃色；通過革蘭氏染色後在顯微鏡下呈陽性，菌體呈短杆狀，大小為(0.6-1.2) μ mX (1.5-6.0) μ m,菌落較小,扁平。該菌株的16S rRNA基因序列特徵:其16S rRNA具有如序列表中序列I所示的核苷酸序列，序列長度為1409bp。根據其形態特徵和生理生化特徵及其16S rRNA基因序列在Genbank中的檢索結果，鑑定該菌株為小短桿菌(Brachybacterium)。根據該菌株耐鹽性能實驗結果,小短桿菌(Brachybacterium)耐鹽範圍(以 NaCl 計)為 1_13%。本發明所提供的小短桿菌(Brachybacterium)能夠在高鹽條件下，以有機物為電子受體，NH4+為電子供體，將NH4+氧化為NOf或NO3-;能夠在好氧的條件下，以有機物為電子供體，N02_或N03_為電子受體，將其還原為氮氣；還能夠在好氧條件下，將無機磷攝入體內轉化為自身組分進而實現去除汙水中磷元素的目的。本發明所提供的小短桿菌(Brachybacterium)可用於同步脫氮除磷,在實際應用中，可將菌株置於高鹽廢水中實現氮磷同步去除的目的。所述廢水的碳氮比可為3.7-12，優選為9-12。所述廢水的溫度可為20_40°C，優選為25_30°C。所述廢水的pH可為6.5-8.0，優選為6.5-7.5。本發明的小短桿菌(Brachybacterium)及其應用與現有技術相比較有如下有益效果:(I)本發明的小短桿菌(Brachybacterium)菌株對高鹽的耐受力強,能夠在高鹽、好氧條件下實現好氧條件下氮磷的同步去除，解決了高鹽對傳統生物處理過程的限制以及傳統廢水處理中生物脫氮除磷需要採取厭氧釋磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段處理的瓶頸問題；(2)硝化和反硝化偶聯進行，反硝化過程中產生的鹼度可以很好的彌補硝化過程中產生的酸度，整個過程無需加鹼調節pH ;相比自養硝化細菌，異養硝化細菌的生長速率快、細胞產率高，可以有效解決自養硝化細菌增值緩慢、系統水力停留時間長的問題；(3)脫氮和除磷同步進行，解決了反硝化菌和聚磷菌對碳源的競爭問題；(4)採用本發明，在傳統活性汙泥法的二級生化處理系統，可以完成碳氮磷的同步去除，無須構建新的反應器，最大限度的簡化了工藝流程，節省了設備和投資的成本，因此，具有較好的經濟效益和環保效益；(5)本發明適用於高含鹽廢水的脫氮除磷處理，應用前景廣闊，具有很好的社會效.、/■
Mo以下結合具體實施方式
對本發明進行詳細描述。實施例僅為舉例說明，本發明的範圍並不以具體實施方法為限，而是由權利要求的範圍加以限定。


附圖1小短桿菌(Brachybacterium)在鹽度為3%時對氮素和磷酸鹽的降解曲線附圖2小短桿菌(Brachybacterium)在不同鹽度下對氨氮的降解曲線附圖3小短桿菌(Brachybacterium)在不同鹽度下對磷酸鹽的降解曲線附圖4小短桿菌(Brachybacterium)在不同pH條件下的脫氮曲線附圖5小短桿菌(Brachybacterium)在不同pH條件下的除磷曲線附圖6小短桿菌(Brachybacterium)在不同溫度條件下的脫氮曲線附圖7小短桿菌(Brachybacterium)在不同溫度條件下的除磷曲線附圖8小短桿菌(Brachybacterium)在不同C/N條件下的脫氮曲線附圖9小短桿菌(Brachybacterium)在不同C/N條件下的除磷曲線
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。實施例中各種汙染物的監測分析方法參考《水和廢水監測分析方法》(第四版，中國環境科學出版社，2002)。溫度和溶解氧通過可攜式溶氧測定儀(YSI550A，USA)進行測定。汙泥濃度(MLSS)和揮發性懸浮固體濃度(MLVSS)根據重量法測定。實施例中使用的各種單位，統一採用國家標準。實施實例1:小短桿菌(Brachybacterium)在鹽度為3%時的同步脫氮除磷能力測
定將保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.5947的小短桿菌(Brachybacterium)菌株(下同)接種於IL的LB培養基中，防止雜菌的侵入並保持菌體的生長活力，進行富集培養。將培養得到的菌液離心，用無菌水洗滌三次，製成光密度(OD6tltl)為1-2的菌懸液。取IOmL上述菌 懸液加入兩個含有90mL的鹽度(以NaCl計)為3%的測試培養基(每升含 0.94g 葡萄糖，0.153g NH4Cl, 0.035g KH2PO4,0.1gMgSO4.7Η20，0.006g FeSO4.7Η20，pH7.(Γ7.5)的錐形瓶中，用9層紗布封口，30°C 150rpm的搖床中振蕩培養。未接種菌懸液的培養基進行同等條件下的實驗作為空白對照。於011、611、1211、1811和2411取少量反應液，其中一部分直接用於測定菌體光密度，其餘部分在8000rpm下離心5min,取上清液測定各種含氮化合物及磷酸鹽的濃度。實驗結果見附圖1。小短桿菌(Brachybacterium)菌株在高鹽條件下生長良好,且對氨氮和磷酸鹽有較強的降解能力。在24h內，菌株處於對數生長期，與此同時氨氮和磷酸鹽的降解同步進行，24h時去除率達到最大值87.02和84.30%。此外，在整個降解過程中，硝氮和亞硝氮的濃度無明顯積累，廢水中大部分的氨氮通過異養硝化-好氧反硝化作用直接轉化為氣體產物。此外，24h內磷酸鹽的濃度由最初的10mg/L下降至1.57mg/L，說明該菌株在高鹽條件下具有異樣硝化-好氧反硝化能力的同時兼有較強的除磷功能。實施實例2:菌株在不同鹽度條件下的脫氮除磷效果以葡萄糖為碳源，氨氮為氮源，實施例中所述小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同鹽度下對氨氮的去除能力測定。具體實施步驟如下:將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種於鹽度(以NaCl計)分別為1%、3%、5%、8%、10% 和 13% 的 IOOml 無機鹽培養基(0.94g 葡萄糖，0.153g NH4Cl, 0.035g KH2PO4,
0.1gMgSO4.7Η20，0.006g FeSO4.7H20，30g_150g NaCl，pH7.0 7.5)中，於 30°C 150rpm 的搖床中進行預培養。待菌株生長至對數生長期後期時，取IOml菌液接入新鮮的鹽度(以NaCl計)分別為1%、3%、5%、8%、10%和13%的90ml無機鹽培養基中，於30°C 150rpm的搖床中進行振蕩培養。未接種菌懸液的培養基進行同等條件下的實驗作為空白對照。於6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應液，其中一部分直接用於測定菌體光密度，其餘部分在8000rpm下離心lOmin，取上清液測定含氮化合物和磷酸鹽的濃度。如附圖2所示，初始氮源濃度為40mg/L，當鹽度分別為1%、3%、5%、8%、10%和13%時，48h 後氨氮的濃度分別為 18.09mg/L、4.90mg/L、4.53mg/L、8.71mg/L、7.39mg/L 和36.93mg/L ;在鹽度為1%時,小短桿菌(Brachybacterium)菌株對氨氮的去除效果不是很理想，48h去除率僅為5 3.45% ;當鹽度為5%時,小短桿菌(Brachybacterium)菌株對氨氮的去除效果最好，其36h的去除率達到94.75%和88.69% ;當鹽度升高至10%，其對氨氮的去除率仍然在80%以上；當鹽度達到13%時，菌株對氨氮的去除效果明顯下降，去除率僅為5.50%,推測原因可能是此鹽度下該菌株生長速率下降，對其降解能力產生較強的抑制作用。由此可知，小短桿菌(Brachybacterium)降解氨氮的最佳鹽度為5%,並且在鹽度為3%_10%的範圍內對氨氮均有較好的去除效果。結果如圖3所示，該菌株在鹽度(以NaCl計)分別為1%、3%、5%、8%、10%時，均可以有效去除磷酸鹽；其中在鹽度為1%時的除磷性能最好，去除速率也最快，24h內磷酸鹽的去除率達到95.5%。由此可見，該菌株為對高鹽有良好耐受能力的耐鹽菌，其能夠在高鹽條件下有效實現生物除磷。實施實例3:.菌株在不同pH條件下的脫氮除磷實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種於IOOml的鹽度(以NaCl計)為3%無機鹽培養基(同實施例2)中，於30°C 150rpm的搖床中進行預培養。待菌株生長至對數生長期後期時，取IOml菌液接入新鮮的90ml無機鹽培養基中，調節培養基pH分別為6.5-7.0、
7.0-7.5和7.5-8.0的範圍內，於30°C 150rpm的搖床中進行振蕩培養。未接種菌懸液的培養基進行同等條件下的實驗作為空白對照。於6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應液，其中一部分直接用於測定菌體光密度，其餘部分在8000rpm下離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物和磷酸鹽的濃度。由圖4、圖5可見，小短桿菌(Brachybacterium)菌株在pH為6.5-7.0,脫氮除磷性能最好，24h對氨氮和磷酸鹽的去除率分別達到87.02和84.30%。但隨著pH的升高，菌株脫氮除磷率降低。當PH為7.5-8.0範圍內，菌株對氨氮和磷酸鹽的去除效果都不是很理想。由此可知，該菌株脫氮除磷效果最適的pH範圍為6.5-7.0, pH值的升高會對其脫氮除磷效果產生抑制作用。實施實例4:菌株在不同溫度條件下的脫氮除磷實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種於IOOml的鹽度(以NaCl計)為3%無機鹽培養基(同實施例2)中，於30°C 150rpm的搖床中進行預培養。待菌株生長至對數生長期後期時，取IOml菌液接入新鮮的IOOml無機鹽培養基中，調節搖床培養溫度分別為20°C、30°C和40°C，150rpm振蕩培養。未接種菌懸液的培養基進行同等條件下的實驗作為空白對照。於6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應液，其中一部分直接用於測定菌體光密度，其餘部分在8000rpm下離心IOmin,取上清液測定各種含氮化合物和磷酸鹽的濃度。由圖6、圖7可見，當溫度分別為20°C、30°C和40°C時，48h後氨氮的濃度分別為
11.81mg/L、4.53mg/L和 10.08mg/L,磷酸鹽的濃度分別為 2.67mg/L、0.45mg/L和 2.49mg/L。溫度為30°C時，菌株對氨氮和磷 酸鹽的去除率最高；48h內無硝酸鹽氮的累積，只有微量的亞硝酸鹽氮出現，其值均不超過0.04mg/Lo說明小短桿菌(Brachybacterium)菌株對溫度具有較寬的適應範圍。實施實例5:菌株在不同C/N條件下的脫氮除磷實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種於IOOml的鹽度(以NaCl計)為3%無機鹽培養基(同實施例2)中，於30°C 150rpm的搖床中進行預培養。待菌株生長至對數生長期後期時，取IOml菌液接入新鮮的IOOml無機鹽培養基中，調節C/N分別為3.7,7.5和9.0，於30°C 150rpm的搖床中進行振蕩培養。未接種菌懸液的培養基進行同等條件下的實驗作為空白對照。於6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應液，其中一部分直接用於測定菌體光密度，其餘部分在8000rpm下離心IOmin,取上清液測定各種含氮化合物和磷酸鹽的濃度。由圖8、圖9可見，當C/N分別為3.7、7.5和9時，48h後氨氮的濃度分別為
12.97mg/L、13.04mg/L 和 4.53mg/L,磷酸鹽的濃度分別為 7.15mg/L、4.29mg/L 和1.32mg/L ;當C/N為9時,小短桿菌(Brachybacterium)對氨氮和磷酸鹽的去除率明顯高於其在C/N為3.7和9時的去除率。實施實例6:菌株最佳除磷條件的確定採用搖瓶實驗的模式，依據正交實驗原理，以pH值、搖床培養溫度、接種量和碳氮比四個因素為影響因子，建立了 4因素3水平共計9次正交試驗以確定菌株小短桿菌(Brachybacterium)的最佳除磷條件。實驗中選用的培養基除葡萄糖與氯化銨含量根據需要改變外，其餘組分和濃度一律與實施例1相同。正交實驗設計及結果見表I所示。表I正交實驗設計及結果
權利要求
1.一種高鹽兼具異養硝化-好氧反硝化和除磷功能的小短桿菌Brachybacteriumi菌株，其特徵是所述小短桿菌Brachybacteriumi可用於含鹽廢水處理,能夠在單一好氧條件下實現同步脫氮和除磷。
2.根據權利要求1所述的小短桿菌Brachybacterium,其特徵在於:該小短桿菌菌株的16SrRNA基因如序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，序列長度為1409bp，菌株保藏號為CGMCC N0.5947。
3.根據權利要求1所述的小短桿菌Brachybacterium,其特徵在於:在30_40°C下,營養瓊脂培養基上培養16_32h後，菌落表面光滑，淺黃色；通過革蘭氏染色後在顯微鏡下呈陽性，菌體呈短杆狀，大小為(0.6-1.2) μπιΧ (1.5-6.0) μ m，菌落較小，扁平。
4.權利要求1所述的小短桿菌Brachybacterium在廢水處理中的應用，其特徵在於:能夠以有機物為電子受體，NH4+為電子供體，將NH4+氧化為NO2-或NO3-;能夠在好氧的條件下，以有機物為電子供體，N02_或N03_為電子受體，將其還原為氮氣；還能夠在好氧條件下，將無機磷攝入體內轉化為自身組分進而實現去除汙水中磷元素的目的，單一好氧條件下實現同步脫氮和除磷的目標。
5.根據權利要求4所述的小短桿菌Brachybacterium的應用，其特徵在於:其所述的廢水的鹽度(以NaCl計)範圍為1-13%，優選為3-10%。
6.根據權利要求4所述的小短桿菌Brachybacterium的應用，其特徵在於:其所述的廢水的碳氮比範圍為3.7-12，優選為9-12。
7.根據權利要求4所述的小短桿菌Brachybacterium的應用，其特徵在於:其所述的廢水的pH範圍為6.5-8.0，優選為6.5-7.5。
8.根據權利要 求4所述的應用,其特徵是利用小短桿菌Brachybacterium和或以其為主要成份微生物製劑對廢水進行處理，可在高鹽好氧環境下完成硝化、反硝化和除磷過程，進而實現氨氮、總氮及磷的同時去除。
全文摘要
本發明涉及一株高鹽兼具異養硝化-好氧反硝化與除磷功能的小短桿菌(Brachybacterium)及其在廢水處理中的應用。該菌株對高鹽環境耐受能力強，在高鹽條件生長良好，並且可以利用有機碳為唯一碳源，氨氮為唯一氮源進行新陳代謝，通過異養硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接轉為氣體產物，實現脫氮；該菌株也能以硝酸鹽氮為唯一氮源，通過好氧反硝化作用將硝酸鹽氮轉化為氣體產物；還能在好氧條件下將無機磷攝入體內轉化為自身組分進而去除汙水中磷元素。將該菌株應用於高鹽廢水的處理，可實現單一好氧條件下氮磷的同步去除，有助於有效解決高鹽條件下生物除碳除磷脫氮的的難題，應用前景廣闊。
文檔編號C02F3/02GK103074285SQ20131003223
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者倪晉仁, 鄧若男 申請人:北京大學