一種優化的穀氨醯胺轉胺酶啟動子及其應用的製作方法

2023-07-18 17:54:31 1

專利名稱：一種優化的穀氨醯胺轉胺酶啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種穀氨醯胺轉胺酶啟動子及其應用，屬於遺傳工程領域。
背景技術：
微生物穀氨醯胺轉胺酶(蛋白質-穀氨酸-穀氨醯胺轉胺酶，MicrobialTransglutaminase, EC2. 3. 2. 13簡稱MTG)其生物學功能是直接改變蛋白質本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價值。因此，MTG在食品、紡織、生物製藥等領域有著廣泛的應用前景。儘管微生物MTG已實現了エ業化生產，但依靠菌種篩選和過程優化的傳統發酵技 術獲得的產量仍然較為有限，遠不能滿足市場對MTG日益增長的需求。隨著蛋白質表達技術的迅速發展，通過分子生物學的方法構建MTG高產重組菌成為國內外研究者關注的ー個熱點。為進一歩提高產量，日本味之素公司率先開展了 MTG重組菌構建的工作。隨後，德國Martin-Luther University、臺灣食品エ業發展研究所、臺灣國立中興大學、中科院微生物研究所、華南理工大學及諾和諾德(中國)製藥有限公司等相關研究機構或企業相繼報導了重組MTG的製備策略。至此，鏈黴菌MTG已在大腸桿菌、酵母、鏈黴菌及穀氨酸棒桿菌等宿主中成功表達。由於MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外需經活化蛋白酶活化成有活性MTG0大腸桿菌，酵母等表達宿主，不能夠合成活化蛋白酶，MTG表達後需外加活化蛋白酶。而鏈黴菌宿主自身就可以分泌改類活化蛋白酶，可以直接獲得有活性的MTG，因此鏈黴菌可以作為MTG表達的理想宿主。在表達系統中，啟動子強度對蛋白的表達量影響很大。在鏈黴菌表達系統中，與其他表達系統相比，啟動子比較少，而且通用性低，不適合MTG的表達。因此有必要開發新的啟動子。很多文獻表明，MTG自身啟動子可以用於MTG的異源表達，因此MTG自身啟動子可以作為一個高效表達啟動子用於蛋白表達。

發明內容
為解決上述問題，我們對MTG自身啟動子進行了研究，通過逐段缺失，確定了啟動子的核心區域和調控序列。在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產穀氨醯胺轉胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通過基因克隆方法,得到了MTG基因序列及其上下遊序列，含MTG自身的啟動子和終止子(Genebank:EU477523)。利用PCR技術，設計引物，上遊引物TCU-F :TTCGAGCTCGGTACCCACCCCGCTGAATGGGACTCTTCGT (Kpn I)，下遊引物 TCU-R:CGCGGATCCGGAATTCCATATGCGTCGCCGGTCATGACCTGGTG,獲得上遊序列(tgU)，通過對基因 tgU 上下遊的逐段缺失，確定了 MTG啟動子核心序列及調控序列，並將優化後的啟動子序列用於MTG的表達，產量得到顯著提高，因此，MTG啟動子可以被鏈黴菌工程菌識別並啟動，具有廣泛的應用價值。本發明所用到的培養基
YEME培養基葡萄糖10g/L、蛋白腖5g/L、麥芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖340g/L、MgCl2 6H20 5mmoL/L、甘氛酸 5g/L ；MS 培養基甘露醇 20g/L、黃豆粉 20g/L、瓊脂粉 20g/L，pH7. 2-7. 3 ；R5 培養基蔗糖 103g/L、K2SO4 0. 25g/L、MgCl2 6H20 10. 12g/L、葡萄糖 10g/L、Difco酪蛋白胺基酸0. Ig/L、0xoid酵母提取物5g/L、TES 5. 73g/L。稱取5. 5g Difco瓊脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115° C滅菌15min。使用時，將培養基融化，每瓶中加入=KH2PO4 (0. 5%) 2. 5mL、CaCl2 2H20(5mol/l) ImL,
L-脯氨酸(20%) 3. 75mL、NaOH (ImoI/L) 2. 5mL ；斜面培養基(g/L):葡萄糖4g/L、麥芽粉(Difco) 3g/L、酵母粉4g/L、瓊脂粉20g/L, pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 種子培養基(SM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白腖 20g/L、MgSO4 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L ；pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 發酵培養基(FM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白腖 20g/L、大豆粉 15g/L、K2HPO4 4g/L、MgSO4 7H20 2g/L、CaCO3 5g/L ；pH 7. 4 ；LB 培養基胰蛋白腖 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. 0 ；本發明中穀氨醯胺轉胺酶活力的測定比色法測定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-穀氨酸-、單羥胺酸做標準曲線。I個單位穀氨醯胺轉胺酶酶活定義為37° C時每分鐘催化形成Iymol L-穀氨酸-Y單羥胺酸的酶量(U/mL)。試劑A :IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解於 2mL 0. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入
0.2mol/L pH6. 0 的 Tris-HC 緩衝液 4mL，0. lmol/L 羥胺 2mL，0. Olmol/L 的還原型穀胱甘肽2mL,並調節pH至6. O。試劑B :3mol/L 的 HCL，12%TCA，5%FeCL3 按 I I I 混合。配製0-4 u mol/mL的L-穀氨酸-Y -單異羥肟酸標準溶液。取ImL試劑A與0. 4mL不同濃度的L-穀氨酸-Y-單異羥肟酸標準溶液混合，37° C水浴10分鐘。加0. 4mL試劑B終止反應，在525nm比色，繪製出標準曲線。以0. 4mL經適當稀釋的酶液代替標準溶液，在相同條件下保溫和比色，從標準曲線求出酶活。以100° C加熱10分鐘的離心後的上清液為空白。酶活力(u/mL) = (6.8548X0D525-0.0164) X稀釋倍數應用本發明提供的啟動子可使MTG產量達到4U/mL，提高了 I倍。


圖IS. hygroscopicus TGase啟動子上遊序列缺失分析圖2S. hygroscopicus TGase啟動子下遊序列缺失分析圖3啟動子優化前後發酵上清酶
具體實施例方式實施例I :MTG啟動子上遊缺失採用末端基因缺失的方法分析TGase天然啟動子的有效序列將5』端部分缺失的MTG基因克隆至pIJ86並轉化S. Iividans TK24進行TGase表達驗證。如圖I所示，tgl共包含TGase開放閱讀框上遊基因893bp，以完整tgl表達的TGase活力為對照(100%)，當tgl 5』端缺失300bp時，發酵所得TGase活力下降到57. 9% ；tgl 5』端缺失400bp時，其對應重組菌發酵液的已檢測不到TGase活性。上述結果表明，TGase啟動子的上遊位於_593bp和-493bp之間
實施例2 =MTG啟動子下遊缺失確定了 TGase啟動子上邊界之後，採用基因缺失的方法確定其下邊界。從ATG上遊_98bp (核糖體結合位點上遊)處向上遊每隔50bp缺失。以pIJ86/tgl為模板，通過PCR擴增分別得到3』端部分缺失的TGase啟動子片段、帶有核糖體結合位點的TGase前體基因及TGase轉錄終止子；將上述PCR產物依次克隆至pIJ86，得到表達載體編碼3』端部分缺失的TGase啟動子片段。如圖2所示，以完整tgl表達的TGase活力為對照(100%)，基因缺失至_148bp處時，TGase活力水平降低至82% ;基因進ー步缺失至_198bp時，TGase活力水平達到達對照條件下的119%;後續的基因缺失導致TGase活力水平持續下降，缺失至-498bp時,剩餘的上遊序列不再具有啟動子活性。結合TGase啟動子上下遊啟動子基因缺失的結果，可以發現，位於TGase開放閱讀框上遊_593bp與_148bp之間的序列為
S.hygroscopicus TGase啟動子區域；位於_148與-198之間的片段可能是該啟動子的調控區域實施例3 :用優化後的MTG啟動子表達MTG由實施例I和2得到的TGase優化後的啟動子序列如SEQ ID NO. I所示，利用優化後的啟動子表達TGase。將構建好的工程菌轉化鏈黴菌原生質體，具體步驟如下(I)在250mL三角瓶中加入50mL的YEME，接種100 u L的孢子懸液，於30°C搖床中培養36 40h。(2)將培養物倒入離心管中，3500r/min離心lOmin。(3)棄上清,將菌絲體懸浮於15mL的10. 3%的鹿糖溶液中，3500r/min離心IOmin,
棄上清。同此法洗兩次。(4)取ImL菌絲體，加入4mL的溶菌酶溶液(溶菌酶母液為50mg/mL P Buffer,終濃度為2mg/mL,用P Buffer稀釋),於30°C水浴30 60min(間_ 5min輕輕搖動)至上清呈乳狀。(5)加入5mL的P Buffer並用5mL的吸管吹吸幾次,繼續溫浴lOmin。(6)用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉入無菌乾淨的離心管中，3500r/min離心7min,原生質體沉澱呈黃色。(7)棄上清，輕柔打散原生質體，用P Buffer洗兩次(洗去溶菌酶)。每次仍使用3500r/min 離心 7min。(8)棄上清，用槍頭將原生質體打散，分裝，於_70°C保存。(9)將最多5 ii L的DNA (質粒或酶連產物)加於已經裝有50 ii L原生質體的離心管(I. 5mL)的管壁上(不與原生質體接觸)。 (10)吸取200 ii L的25%PEG4000，將DNA衝入原生質體中，小心抽吸幾次，混勻。(11)將混合物塗布於R5平板上(不含任何抗生素)。(12)30°C培養14 20h後，用含有適當抗生素的ImL無菌水溶液覆蓋。
(13)再培養f 2d後，即可看到小的轉化子菌落長出。將驗證正確的轉化子進行液體培養，種子培養接一鏟生長良好的斜面培養物(也可以直接接種孢子懸液)至裝有IOOmL種子培養基的500mL三角瓶中培養，搖瓶轉速為200r/min，溫度30°C，培養時間24h。搖瓶培養將培養好的種子按8%的接種量接入發酵瓶中，培養溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，500mL三角瓶裝液量為50mL，培養時間42_72h。各 培養基使用前添加阿泊拉黴素至終濃度為50y g/mL。如圖3所示，MTG產量達到4U/mL，提高了 I倍。
權利要求
1.一種優化的穀氨醯胺轉胺酶啟動子，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.包含權利要求I所述啟動子序列的表達載體。
3.包含權利要求I所述啟動子的細胞系或基因工程菌。
4.權利要求I所述的啟動子應用於生產穀氨醯胺轉胺酶。
全文摘要
本發明公開了一種優化的穀氨醯胺轉胺酶啟動子，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。應用本發明提供的啟動子可使MTG產量達到4U/mL，提高了1倍。通過本發明提供的啟動子及發酵方法，實現了MTG在S.lividan TK24中高效率分泌性表達，適合工業化生產。
文檔編號C12N15/63GK102643820SQ201210145188
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉松, 堵國成, 張東旭, 陳堅, 陳康康, 馬建龍 申請人:江南大學