一種檢測人心力衰竭新型標誌物st2的快速診斷試劑盒的製作方法

2023-07-15 02:50:36

專利名稱：一種檢測人心力衰竭新型標誌物st2的快速診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及ー種快速定性/定量檢測人全血、血清和/或血漿中心力衰竭標誌物人可溶性ST2濃度的快速診斷檢測試劑盒。
背景技術：
心力衰竭是一種複雜的臨床症狀群，是各種心臟病的嚴重階段，其發病率高，五年存活率與惡性腫瘤相仿。據我國五十家醫院住院病例調查，心力衰竭住院率佔同期心血管病的20%，死亡率卻佔40%，提示預後嚴重。就整個歐洲來說，估計有症狀的心カ衰竭病人佔總人口的0. 4% _2%，隨著年齡的增加，心力衰竭的患病率迅速増加。心力衰竭已經成為美國主要的公共衛生問題。美國患有心力衰竭的病人大約有500萬人，毎年新增50萬人。毎年因心力衰竭而就診者達到1200-1500萬，總住院天數達到650萬。 ST2是白介素-1 (IL-I)受體家族成員之一，有跨膜ST2 (ST2L)和可溶性ST2(sST2)兩種，白介素-33(IL-33)是ST2L的功能配體。心肌細胞和纖維原細胞受到機械牽張後，ST2和IL-33產生增加。近年研究發現ST2水平升高和BNP或NT-proBNP —祥，可以反映心臟的負荷。在急性心肌梗死患者，TMI 14和TMI 23研究中的810例患者進行了外周血ST2水平測定，結果發現30天內死亡和發生心衰的患者外周血ST2水平顯著升高。在急性呼吸困難患者，Januzzi等對593例急診患者的研究發現,心衰患者ST2的中位數高於非心衰患者,並且I年內死亡的患者ST2中位數也高於存活的患者，ST2水平的升高是I年死亡率的獨立和強力預測指標。還有研究在慢性心衰患者發現，ST2水平的升高和心衰嚴重程度相關並預測心臟猝死的發生，並且嚴重心衰患者升高ST2在2周時的變化也是死亡和需要心臟移植的獨立預測指標。SaskiaBoisot等對150名急性不穩定HF住院患者進行研究,通過應用與心臟相關的多參數(包括ST2，BNP, NT-proBNP及血尿素氮)進行分析後發現，患者住院期間的ST2水平變化可預測90天時死亡率，且該作用獨立於BNP和NT-proBNP。總之，人可溶性ST2作為生物標誌物已反覆被證實具有潛在的價值。測量急性呼吸困難或心肌梗死的急診患者血清ST2水平可能為分層護理提供ー些有用的預後信息。另夕卜，ST2的預測價值不受年齡、腎功能損害和體重指數的影響，而BNP、NT-proBNP的檢測通常受到這些因素的影響，因此，ST2的測定結合BNP或NT-pix)BNP的測定可以更好的提高心衰預後判斷的準確性。

發明內容
本發明涉及ー種快速定性/定量檢測人全血、血清和/或血漿，尤其是外周血中心力衰竭標誌物-人可溶性ST2的膠體金試紙條檢測試劑盒。本試紙條可對人心力衰竭標誌物-人可溶性ST2進行定性/定量檢測，具有較高的特異性和靈敏度，操作簡捷，也可以用配套儀器進行定量檢測。
本發明的另ー個目的是在於提供了ー種人心力衰竭標誌物-人可溶性ST2免疫快速診斷試紙條的製備方法，包括抗可溶性ST2特異性抗體和/或抗原特異片段的製備、ST2免疫檢測試紙條的製備及其檢測方法和/或使用。該試紙條操作簡捷、快速、高效、準確，全過程只需要10分鐘，不受環境條件幹擾，特異性好，且檢測靈敏度高，最低檢測級別可為ng/ml。本發明適用於醫院和急診單位等，可實現心力衰竭等心肌疾病的快速檢測和/或現場檢測。本發明的檢測人可溶性ST2免疫膠體金試紙條由樣品墊、塗覆膠體金標記的抗-人可溶性ST2抗體的金標墊、在檢測線和質控線包被有抗-人可溶性ST2抗體和IgG的硝酸纖維素膜、吸水墊依次構成(見圖I)。在該PVC底板的兩端，分別設有樣品墊和吸收墊；在該PVC底板中部設有硝酸纖維素膜檢測層，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊交界處，設有包被金標記抗-人可溶性ST2抗體的金標墊，在金標墊一端部分設置在樣品墊之下，另一端部分設置在檢測層之上；在與樣品墊延續的檢測層上設有檢測線和質控線，在該檢測線和質控線上分別包被有抗-人可溶性ST2抗體和羊抗IgG。所述的膠體金標記的結合墊按照以下方法製備得到將抗-人可溶性ST2抗體和 羊抗鼠IgG分別用金溶液標記後，包被於玻璃纖維上即得；其中所述的硝酸纖維素膜可以用尼龍膜等代替。所述的背襯可以是各種硬質的支持物，只要具有一定的硬度，具有附載或支持的功能都可用於本發明，例如可以是塑料板(PVC)、硬紙板等，優選為PVC。本發明試劑盒的使用方法及評判標準(I)檢測對象具有特徵性病症和/或胸痛或不舒服、呼吸困難、噁心、嘔吐、噯氣、出汗、心悸、頭暈、疲勞、暈厥等非特徵性症狀的患者和/或普通人群。(2)樣本患者和/或普通人群的全血、血清和/或血漿，尤其是外周血。
(3)檢測用吸滴管將標本(全血、血清和/或血漿，尤其是外周血)收集在加樣本中，將試紙刻度線(標記)一下浸入樣本中，等候5-10分鐘，樣本被完全吸附之後，便可判讀結果。(4)檢測原理本發明檢測試劑盒採用免疫層析法定性檢測人外周血中人可溶性ST2蛋白的濃度。在試劑盒的檢測區分別包被有抗-人可溶性ST2抗體結合片段，質控區包被有羊抗鼠IgG抗體。檢測時，人外周血中的人可溶性ST2蛋白與試劑盒上事先包被有膠體金標記抗-人可溶性ST2抗體和/抗原結合片段結合形成結合物，出現一條顔色條帶。無論樣本中是存在和/或較低濃度人可溶性ST2抗體，當液面遷移至固定有羊抗鼠IgG抗體的質控區時，質控區應該會出現一條顔色的條帶。如果檢測區出現一條顔色檢測帶，表示陽性(+)結果，即在質控區內和測試區內均出現一條顔色條帶。(注意由於待檢樣本中人可溶性ST2的濃度有所不同，因而測試區內的顔色條帶可能出現顏色深淺的現象。但是，在一定時間內，不論測試區內的顔色條帶顏色深淺，都可判定為陽性。)則表明患者已經患有心力衰竭等心肌疾病，和/或具有發展為心力衰竭等心肌疾病的風險。如果只有質控區出現一條顔色條帶，而檢測區無顔色條帶，則說明患者沒有患有心力衰竭等心肌疾病，和/或沒有具有發展為心力衰竭等心肌疾病的風險。如果質控區沒有出現顏色條帶，則需要重新判定樣本量是否足夠或需要分析層析過程是否正常等。
本發明與現有技術相比具有如下優點(1)檢測速度快，全過程只需10分鐘，可以實現單個樣品或大量樣本的檢測；(2)靈敏度高，最低檢測單位為ng/ml ; (3)特異性強，和其它心カ衰竭標誌物無交叉幹擾；(4)操作簡捷，操作人員無需經過專業培訓，按說明書即可完成操作，易於推廣使用；(5)不需要任何儀器，特別適合現場檢測；(6)將側樣本範圍廣，全血、血清和/或血漿均可用作試驗樣本，尤其是外周血，所需試劑和樣本量少，樣本量最低可至50-100ul。心力衰竭是一個複雜的臨床綜合症,單ー標記物不能反映心カ衰竭全部特徵。人可溶性ST2蛋白作為ー個新的心カ衰竭標記物，它和心肌肌鈣蛋白I、BNP具有同等重要的地位。因為BNP的濃度似乎不能解釋心カ衰竭的嚴重性，因此人可溶性ST2蛋白和心肌肌鈣蛋白I和/或BNP的聯合測定，將為心力衰竭病情分級、治療提供一個可靠的評斷標準。在心力衰竭治療過程中，除根據患者的臨床症狀外還可以根據患者人可溶性ST2蛋白水平和/或心肌肌鈣蛋白I水平和/或BNP的水平，制定和調整治療策略。因此人可溶性ST2蛋白水平和/或心肌肌鈣蛋白I水平和/或BNP的水平聯合，或者人可溶性ST2蛋白水平 獨立測定可以為心カ衰竭患者提供一個客觀的評估方法。本發明所述的方法在醫療領域具有廣泛的應用。例如，本方法可以用來普通人群篩查，包括被醫生篩查，包括醫院、門診院所和緊急醫療部門。


圖I膠體金試紙條結構示意圖順序依次為■:樣本墊■:金標墊□:背襯□:硝酸纖維素膜□:吸水紙圖2檢測結果判讀示意圖依次為陽性、陰性、無效、無效。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步說明，但這些實施例僅用於說明目的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解為，在不偏離本發明精神和範圍的前提下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例I本發明膠體金診斷試劑盒的製備製備抗-人可溶性ST2單克隆抗體分別用純化的人可溶性ST2抗體和/或抗原結合片段免疫純系小鼠，小鼠血清產生相應的抗體吋，即可將小鼠脾細胞和SP2/0細胞融合。利用HAT選擇雜交瘤細胞，並用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或者WB對McAb進行檢測。對於檢測抗體陽性的雜交瘤細胞應用有限稀釋液進行克隆，同時保存陽性細胞株，利用BALB/c純系小鼠製備大量的單克隆抗體，同時對抗體特異性的鑑定、識別抗原表位的鑑定、親和力的鑑定及配對試驗，篩選出效果最好的一對細胞株。將篩選到的細胞株重新植入小鼠腹腔中，過5-6天取出腹水，利用硫酸銨鹽析及親和層析純化得到的單克隆抗體。膠體金試紙條的製備膠體金的製備(I)用5暈升微量移液器取3暈升I %四氯金酸於500暈升的圓底燒瓶中，量取297毫升的超純水亦加入燒瓶中，配製成0.01%的四氯金酸反應液，充分攪拌混勻；(2)連接上蛇形冷凝管，開啟冷凝水，並置於磁力加熱攪拌器上，加熱煮沸；(3)放入攪拌子，劇烈攪拌，然後一次性快速準確地加入3毫升檸檬酸銨溶液；(4)金黃色的氯金酸水溶液首先變成灰色，約2分鐘後變成紫紅色，繼續煮沸5分 鍾；(5)關閉磁力加熱攪拌器,待膠體金冷卻後,分裝於500毫升的玻璃試劑瓶中,夕卜面覆上鋁箔，按規定貼上標籤；製備的膠體金應呈現透亮的紫紅色，沒有聚合物及肉眼可見的沉澱；取適量於530納米波長處測定，紫外吸收值在I. 1-1. 3之間。製備膠體金結合物(I)根據用擬標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記蛋白質的總量，エ本藝姆暈升膠體金標記12微克/抗體，標記的抗體量為3. 6暈克；(2)用0. IM的碳酸鉀或0. IM鹽酸調節膠體金的pH值為7. 8 ；(3)在電磁攪拌器下，將抗體蛋白質溶液加入膠體金溶液中，加入蛋白質時應逐滴加入，I暈克蛋白質大約5分鐘加完；(4)抗體和膠體金反應5分鐘後，在磁力攪拌器下加入5%的牛血清蛋白(BSA)，使其終濃度為1% ;(5) 10分鐘後，加入3%的PEG2000，至終濃度為0. 3% ;(6)繼續反應I小時或者過夜；(7)將標記好的膠體金溶液於2000r/min，4°C離心10分鐘，吸出上清，棄去沉澱，以去除大的聚合物；(8)調整好離心機的轉速為10000r/min，4°C離心30分鐘，棄上清，將沉澱以原體積的0. OlMPBS pH8. 2 (內含1% BSA)溶解，重複離心三次；(9)最後一次小心棄去上清，沉澱溶於原體積的1/50PBS(內含1% BSA)中，即得
免疫金。檢測線和對照線包被(將檢測抗體包被在硝酸纖維素膜上)(I)檢測線劃線分別將抗-人可溶性ST2單克隆抗體裝入噴膜機中(蛋白微量噴膜系統)，在硝酸纖維素膜上按lul/cm的量劃上；(2)質控劃線羊抗鼠IgG抗體包被液裝入噴膜機中(蛋白微量噴膜系統)，在硝酸纖維素膜上按lul/cm的量劃上；(3)包被37°C包被2小時；(4)封閉37°C封閉30分鐘；(5)乾燥將包被後的硝酸纖維素膜放入真空乾燥器內乾燥20小時，密閉保存待用。結合墊製備(I)開啟點膜儀，預熱30分鐘，用蒸餾水做10個循環；(2)調整免疫金的OD值為30，將免疫金加入機器左邊的塑料容器內，設置程序，調整2#噴頭噴量為2ul/cm，將免疫金噴塗在玻璃纖維結合墊上，噴線的位置在結合墊的中央;(3)噴完結合墊後，置於37°C烘箱中乾燥30 分鐘；(4)乾燥將標記後玻璃纖維放入真空乾燥器內乾燥20小時,取出密閉保存待用。檢測卡製備(I)在塑料底板的中央撕去覆於上面的膠帶，貼上包被好抗體的硝酸纖維素膜；(2)撕去塑料板中央下面的寬為5毫米的膠帶，貼上噴上膠體金的結合墊，結合墊前端的硝酸纖維素膜重疊2毫米；(3)撕去塑料板最下面寬為20毫米的膠帶，貼上經過預處理的樣品墊，樣品墊的前端與結合墊重疊約5毫米；(4)撕去塑料底板的最上端約為25毫米的膠帶，貼上吸水紙，吸水紙與硝酸纖維素膜重疊約2毫米；(5)組裝完成後，將每ー個配件都壓實，檢查粘貼結果，將組裝好的大卡用切條機切成3毫米寬的試紙條；(6)把切好的試紙條裝在測試卡中，即得。試劑盒的組裝將吸滴管、樣品加樣杯、一次性注射器、製備好的檢測卡和使用說明書組裝在ー個盒子裡，即得本發明的試劑盒。實施例2臨床試驗研究樣本採集於晨起7 10時對20例心カ衰竭患者進行空腹抽前臂血，立即加入EDTA和/或肝素等抗凝劑，離心後取血清置於-20°C備檢。檢測及結果將組裝完成的檢測試劑盒平放，用所配吸管吸取適量外周血，緩慢滴加4-5滴於檢測盒的加樣孔中(儘量滴加於加樣孔中部，以保證測試結果準確)。在吸水材料的作用下，待檢樣品緩慢移動到檢測區和質控區，膜反應體系啟動。無論待檢樣本中有無人可溶性ST2，質控區處都應顯現一條顔色條帶，這是重要的判斷標準，可以確定是否加入足夠量的外周血，層析過程是否正常等，同時也可以作為判斷檢測盒是否合格的ー個內在標準。結果判定通過觀察窗檢測待檢人可溶性ST2是否存在。(I)在層析過程中，若待測的外周血樣本中不含有人可溶性ST2或其濃度低於檢測靈敏度時，即樣本中沒有特異性抗原與膜上的檢測帶內的單抗發生免疫反應，因而檢測區內不會出現一條顔色檢測帶，表示陰性(_)結果，即僅在質控區內出現一條顔色帯。(2)若待檢樣本中人可溶性ST2的濃度高於檢測閾值時，即樣本中的人特異性ST2與固定在膜上的檢測帶內的單抗結合，因而檢測區內會出現一條顔色檢測帶，表示陽性(+)結果，即在質控區內和檢測區內內均出現一條顔色條帶。(注意由於待檢樣本中人可溶性ST2的濃度有所不同，因而測試區內的顔色條帶可能出現顏色深淺的現象。但是，在一定時間內，不論測試區內的顔色條帶顏色深淺，都可判定為陽性。)(3)若檢測區和質控區未出現顏色條帶，則檢測過程失敗。可能的原因為操作過程不正確、試劑盒已變質損壞或出現質量問題。14例心カ衰竭確診患者和6例健康實驗人員隨機採集外周血標本，盲檢結果如下
權利要求
1.ー種快速定性/定量檢測人心力衰竭標誌物ST2的膠體金試劑盒，其特徵在於試劑盒組分為可快速檢測人心力衰竭等心肌疾病的膠體金試紙條，所述條上包被有膠體金標記的抗可溶性ST2抗體結合片段；設有檢測線和質控線，檢測線上固定有抗可溶性ST2捕獲抗體或抗原結合片段；質控線上固定有羊抗鼠IgG。
2.根據權利要求I所述的新型心衰檢測試劑盒包括塑料襯墊、纖維素膜、金標墊、樣本墊、吸收墊。
3.所述的檢測心衰的快速診斷試劑盒，其特徵在於，所述顏色顆粒可以是ー種膠體金顆粒、或者其他銀、鉄、磁性、燃料、乳膠、螢光顆粒。
4.根據權利I所述的試劑盒，其特徵在於試紙條上包被的膠體金標記的抗ST2抗體或抗原結合片段，以及檢測線上固定的抗-人抗溶性ST2捕獲抗體或抗原結合片段，是經過免疫非人類哺乳動物，重組從人類細胞分離到的人類可溶性ST2產生的。
5.根據權利I所述的試劑盒，其特徵在於質控線上固定的IgG為能夠識別不同表位的單克隆抗體。
6.根據權利I所述的試劑盒，其特徵在於用於快速檢測人心力衰竭標誌物ST2的實驗樣本包括全血、血清或血漿，尤其是外周血。
7.根據權利要求4中，所述的抗體，可以是通過發酵法或免疫法製備的兔、鼠、羊、馬等的單克隆抗體或者或多克隆抗體。
8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於當待測的外周血樣本中不含有人可溶性ST2或其濃度低於檢測靈敏度時，檢測區內不會出現一條彩色檢測帶，而僅在質控區內出現一條彩色帶，表示陰性(_)結果。
9.根據權利7所述的試劑盒，其特徵在於當待檢樣本中人可溶性ST2的濃度高於檢測閾值時，檢測區內會出現一條彩色檢測帶，同時在質控區內出現一條彩帶，表示陽性(+)結果。
10.根據權利7所述的試劑盒，其特徵在幹由於待檢樣本中人可溶性ST2的濃度有所不同，因而檢測區內的彩色條帶可能出現顏色深淺的現象。但是，在一定時間內，不論檢測區內的彩色條帶顏色深淺，都可判定為陽性。
11.根據權利7所述的試劑盒，其特徵在於當質控區未出現彩色條帶，即使檢測區出現彩色條帶，也判檢測結果無效。
12.根據權利I所述的試劑盒，其特徵在於本發明膠體金試紙條可以用於臨床及科研中的檢測人心力衰竭等心肌損傷性疾病，用以輔助指導治療、預後判斷和/或微量殘留心肌壞死(MDR)的動態監測等。
全文摘要
本發明涉及一種快速檢測人全血、血清和/或血漿，尤其是外周血中心力衰竭標誌物人可溶性ST2的膠體金試紙條檢測試劑盒。試劑盒利用免疫學反應原理，其通過顏色顆粒標記的免疫層析法定性或半定量檢測樣本中的ST2。本發明的快速檢測試紙條是在底板上依次相互搭接，包括吸水紙、樣本墊、纖維素膜等組成的試紙條。其中顏色顆粒用於抗體的包被，試紙條包括質控線和檢測線。本發明試紙條對人心力衰竭標誌物人可溶性ST2進行定性/定量檢測，具有較高的特異性和靈敏度，操作簡捷。可以用於臨床及科研中的檢測人心力衰竭等心肌損傷性疾病，用以輔助診斷、指導治療、預後判斷和微量殘留心肌壞死(MDR)的動態監測等。
文檔編號G01N33/68GK102830234SQ20121028822
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者張開山, 蘇廣宇, 高陽 申請人:杭州華得森生物技術有限公司