一種表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法及其專用基因的製作方法
2023-07-14 23:55:06
專利名稱：一種表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法及其專用基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法及其專用基因。
背景技術：
尿酸氧化酶(EC1.7.3.3，Uricase，Urate Oxidase，Uox)是生物體內嘌呤降解代謝途徑中的一種酶，催化尿酸氧化生成尿囊素，尿囊素為一種比較容易排洩的代謝物，其溶解度為尿酸的5～10倍。大多數哺乳動物體內均有內源性Uox，但在高等哺乳動物體內(猿和人類)缺乏這種酶而以尿酸作為終產物隨尿排出體外。
在正常人體血循環中99％以上的尿酸以尿酸鈉鹽(簡稱尿酸鹽)形式存在，血清尿酸鹽波動於較窄的範圍，據國內資料，男性平均為5.7mg/dl，女性4.3mg/dl。如果血清中尿酸的濃度高於正常值，就導致高尿酸血症。惡性腫瘤的增殖導致核酸分解代謝加強，嘌呤代謝產生大量尿酸，患者出現高尿酸血症。腫瘤化療過程中細胞大量裂解伴隨血清尿酸的急劇升高，病人出現一系列生理生化改變，包括電解質紊亂，腎衰，痙攣，心律不齊，腎結石，臨床上稱為腫瘤溶解症候群(tumor lysissyndrome，TLS)。
高尿酸血症會引起的痛風性急性關節炎反覆發作、痛風石沉積、痛風石性慢性關節炎和關節畸形，常累及腎臟引起慢性間質性腎炎和尿酸腎結石形成。本病可分原發性和繼發性兩大類，原發性者病因除少數由於酶缺陷引起外，大多未闡明，常伴高脂血症、肥胖、糖尿病、高血壓病、動脈硬化和冠心病等，屬遺傳性疾病。繼發性者可由腎臟病、血液病及藥物等多種原因引起。有資料顯示我國20歲以上的人群，高尿酸血症的發病率為2.4-5.7％，如果不注意飲食控制和治療，約有10％的會發展成為痛風，推測我國的痛風的發病率為0.5％。
抑制尿酸合成藥物至目前為止只有別嘌呤醇(allopurinol)，此藥能抑制黃嘌呤氧化酶，使次黃嘌呤及黃嘌呤不能轉化為尿酸，阻滯尿酸形成，但會增加腎臟排洩尿酸前體(次黃嘌呤和黃嘌呤)的負荷。與次黃嘌呤不同，黃嘌呤在尿中比尿酸難溶。有時別嘌醇治療的病人也可出現黃嘌呤腎病和結石。此外，對於病人體內存留的尿酸的排洩，使用別嘌呤醇治療無效。排尿酸藥目前常用的有以下三種丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴馬龍，副作用包括腸胃道反應、腎絞痛及激發急性關節炎發作等，由於尿酸生成和排出較多易加重腎臟負擔而不取。
以上的資料可以看出，如果血清中尿酸的濃度高於正常值，不可避免的會導致關節和腎功能的損傷。伴有腎功能的損傷的高尿酸血症患者，不管是使用抑制尿酸合成的藥物別嘌呤醇還是使用排尿酸藥丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴馬龍，它們產生的副作用應該予以考慮。重組黃麴黴Uox為治療伴有腎功能損傷的高尿酸血症提供了良好選擇。
法國Sanofi-Synthelabo公司生產的非重組Uox，由黃麴黴培養液純化而得，治療高尿酸血症療效較別嘌呤醇顯著。然而，從黃麴黴中提取的非重組產品發生急性過敏反應(如支氣管痙攣，低氧血症)者約為5％，包括以往無過敏史的病人或罹患高鐵血紅蛋白血症和6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏的溶血性貧血病人。法國Sanofi-Synthelabo公司開發，2001年6月在德國和英國首次上市的拉布立酶(rasburicase)是釀酒釀母表達的重組黃麴黴Uox，可用於治療和預防具有高危腫瘤溶解症候群的血液惡性腫瘤病人的急性高尿酸血症，尤其適用於化療引起的高尿酸血症病人。急性發作痛風發作病人給予Uox治療後，可阻斷急性發作並減小痛風石的體積。而以前的化療藥物，不管是抑制尿酸合成還是促進尿酸排洩的降尿酸藥物有引起急性痛風性關節炎的嫌疑，一般不用於痛風急性發作的治療。
國外用釀酒釀母表達的黃麴黴Uox周期長，價格較昂貴。國內有的研究者用原核表達系統表達融合了His標籤的重組黃麴黴Uox，儘管可通過蛋白酶去除His標籤但其N端為非天然的，殘餘4個胺基酸殘基，同時增加了純化的成本和工藝。
發明內容
本發明的目的是提供一種表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法及其專用基因。
本發明所提供的黃麴黴尿酸氧化酶基因，名稱為rUox，是優化的黃麴黴尿酸氧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交並洗膜。
含有上述基因的表達載體、工程菌和細胞系也屬於本發明的保護範圍。
本發明所提供的表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法，是將上述rUox插入原核細胞表達載體，轉化宿主菌，篩選得到表達黃麴黴尿酸氧化酶的工程菌，培養工程菌，表達得到黃麴黴尿酸氧化酶。
所述原核細胞表達載體可為pET-系列載體。
所述rUox插入到pET-系列載體的Nde I和Sac I的酶切位點間，或Nde I和HindIII的酶切位點間。
所述工程菌可為大腸桿菌，如大腸桿菌BL21(DE3)。
上述方法中，所述表達為誘導表達，所用的誘導劑為IPTG，誘導濃度0.4-1.5mmol/L，優選為1.0mmol/L。
所述工程菌的培養溫度為37℃，誘導表達的培養溫度為28-37℃，優選為37℃。
上述方法中還包括純化表達得到的黃麴黴尿酸氧化酶的步驟；所述純化包括離子交換、疏水層析和凝膠過濾層析。
本發明人工合成優化的全基因序列，採用大腸桿菌表達體系，表達水平高，黃麴黴尿酸氧化酶的含量達到可溶性全菌蛋白的40％，周期短，成本低。本發明表達重組尿酸氧化酶的方法採用非融合表達策略，使表達得到的尿酸氧化酶具有天然的N端序列，不含有GST、6×His和硫氧還蛋白(Trx)等用於增加溶解度、提高表達量或方便純化的序列，避免N端非天然胺基酸殘基可能對活性和免疫原性產生影響，並且簡化了純化工藝。本發明方法表達的重組尿酸氧化酶在常規的緩衝體系中為完全可溶形式，有利於純化，經過離子交換層系、疏水層析和凝膠過濾層析純化，可達到99％的純度，活性測定表明本發明表達的重組黃麴黴rUox的比活性達34IU/mg酶蛋白。
圖1為表達質粒pET-rUox的PCR和酶切鑑定圖譜圖2為表達蛋白-尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析圖3為Phenyl-Sepharose FF層析純化後的尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析圖4為Phenyl-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF和Phenyl-Sepharose FF層析純化後的尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析圖5為Phenyl-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose FF和HiloadTM 26/60 Superdex 75層析純化後的尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析圖6為尿酸氧化酶活性測定標準曲線圖具體實施方式
實施例中的方法如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、優化的黃麴黴UOX基因的合成及尿酸氧化酶的表達DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶和pMD-T載體購自TaKaRa公司。
E.coli質粒的提取，採用Omega試劑盒；質粒構建的操作方法參考分子克隆一書。
一、rUox基因的合成和表達載體的構建參考GenBank發表的黃麴黴UOX基因序列(序列號X61766)和文獻，分析存在的可能影響蛋白質在大腸桿菌中翻譯的複雜二級結構，對該基因進行優化，在保證胺基酸序列不變的前提下進行定點突變，去除複雜二級結構，突變後的基因序列由博亞生物公司合成，並克隆到pMD-T載體進行序列測定，DNA序列測定確證合成的基因正確，得到優化的黃麴黴Uox基因-rUox，該rUox基因具有序序列表中序列1的核苷酸序列，自5′端第7位-915位核苷酸序列為編碼序列(序列表中序列3)。
將DNA序列測定正確的rUox基因用Nde I和Sac I從pMD-T載體上雙酶切下，並凝膠回收純化，將純化的rUox基因與經過Nde I和Sac I酶切pET-32a(+)(Novagen)得到的5400bp的片段連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在含有氨苄青黴素(100μg/mL)的LB平板上培養，挑選陽性克隆用特異引物(上遊引物5-acccatatgtccgcagtaaaagcagcc-3和下遊引物5-ggggagctcttacaatttagacttcag3，劃線部分別是Nde I和Sac I的酶切位點)進行PCR鑑定，篩選得到陽性克隆(圖1中泳道1，1條約900bp的條帶)。對PCR陽性克隆提取質粒進一步用Nde I/Sac I進行雙酶切和鑑定，得到5400和900bp的條帶(圖1中泳道2)，說明構建的質粒結構正確，將該結構正確的質粒命名為pET-rUox；pET-rUox的PCR和酶切鑑定結果如圖1所示，圖1中泳道M為DNA分子量標準(DL-15 000)；泳道1為pET-rUox的PCR電泳結果；泳道2為用Nde I和Sac I酶切pET-rUox質粒得到的產物的電泳結果。
二、重組黃麴黴Uox的誘導表達將pET-rUox轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在LB培養基(羧苄青黴素100μg/ml)平板上培養，挑取單個菌落接種於含有抗生素的LB培養基中(羧苄青黴素100μg/ml)，37℃培養10小時；按1∶100的體積比擴大培養，37℃培養至菌密度為A600＝0.8時，分成兩份，一份加入IPTG至終濃度為1mmol/L，另一份不加IPTG，兩份都在37℃繼續培養5h，14000g離心收集菌體，按照每克菌體用10ml超聲緩衝液重懸菌體，在冰上超聲(功率200w，超聲時間5s，間歇5s，超聲總的時間為8min)，超聲後的懸液在14000rpm離心20min，沉澱用與離心後上清同樣體積的超聲緩衝液重懸，將超聲後的離心上清和重懸沉澱分別與等體積的2×SDS加樣緩衝液混合均勻，煮沸5min，10000rpm離心5min後，分別取20μl然後進行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析結果如圖2所示，結果表明，在分子質量大約34kD(箭頭示)的位置上有明顯的表達條帶，與理論預期相符；經TotalLab軟體分析目的蛋白的表達量佔可溶性全菌蛋白的40％，尿酸氧化酶的表達量為1090IU/g菌體(酶活性的測定方法同步驟三)。其中圖2中，M為蛋白低分子量標準，泳道1為BL21(DE3)/pET-rUox(轉pET-rUox的大腸桿菌BL21(DE3))，未誘導全菌；泳道2為BL21(DE3)/pET-uox，IPTG誘導全菌，超聲上清；泳道3為BL21(DE3)/pET-uox，IPTG誘導，超聲沉澱。
三、重組黃麴黴Uox的大量誘導表達及純化接種單菌落於10ml LB培養基(含羧苄青黴素100μg/ml)，37℃培養10h。按1∶100的體積比接種新鮮的LB培養基(含羧苄青黴素100μg/ml)，37℃、250rpm培養8h，按1∶50的體積比接種至30L的發酵罐中培養至菌液A600＝1.4-1.6，加入IPTG至終濃度1mmol/L，在37℃繼續培養5h，離心收集菌體，-20℃凍存。將凍存的細菌室溫融化，進行如下步驟處理1)高壓勻漿破碎菌體用20mM，pH 8.0的PB緩衝液重懸菌體(20ml/g溼菌體)，用高壓均質機在900bar壓力下破碎1次，然後在4℃，12000rpm(22000g)離心20min，取澄清的上清液備用。
2)澄清上清液的疏水層析用1M，pH8.0的(NH4)2SO4平衡層析柱；將澄清的上清液與3M，pH8.0的(NH4)2SO4，按照2∶1的體積比混合，上樣；1M，pH8.0的(NH4)2SO4洗滌非特異結合蛋白，最後20mM，pH 8.0的PB緩衝液梯度洗脫樣品。將該洗脫後的樣品進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示，圖3中箭頭所指為各泳道在34kD的位置上的明顯的表達條帶。
3)脫鹽處理步驟2)得到的樣品進行SDS-PAGE後，選取純度好的樣品液體，用截留分子量10kD，超濾體積15ml的超濾管進行脫鹽，然後在2000g離心10-15min(濃縮1倍)；添加20mM，pH 8.0的PB緩衝液到初始體積再超濾2次。
4)離子交換層析將步驟3)超濾脫鹽後得到的樣品溶液用去離子水按照1∶3的體積比稀釋，使電導小於2.5mS/cm、pH 8.0-8.4，上DEAE-Sepharose FF層析柱，流穿液備用，其中平衡緩衝液為10mM，pH 8.0-8.4的PB緩衝液。
5)流穿液的疏水層析將步驟4)得到的流穿液與3mol/L，pH8.0的(NH1)2SO4按照2∶1的體積比混合，過Phenyl-Sepharose FF層析柱；用1M，pH8.0的(NH4)2SO4，洗滌非特異結合物質；然後用20mM，pH 8.0的PB緩衝液梯度洗脫樣品得到純化後的樣品，將樣品過濾除菌。將該純化後的樣品進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示，圖4中箭頭所指為各泳道在34kD的位置上的明顯的表達條帶。
6)凝膠過濾層析所用層析柱為HiloadTM26/60 Superdex 75(Phamacia)，20mM，pH 7.2的PB緩衝液(含有0.15M的NaCl)平衡層析柱，0.5M的NaOH洗洗滌柱子，20mM，pH 7.2的PB緩衝液(含有0.15M的NaCl)平衡層析柱，上樣(每次上樣12ml)，收集目的蛋白峰，得到純度大於99％的尿酸氧化酶。純化後的樣品進行過濾除菌後保存。將該得到純化的尿酸氧化酶進行SDS-PAGE分析，結果如圖5所示，圖5中箭頭所指為各泳道在34kD的位置上的明顯的表達條帶。
三、尿酸氧化酶(rUox)的體外活性分析酶活性分析採用Legoux等報導的方法(J Biol Chem，1992，267(12)8565-8570)。每分鐘將1μmol尿酸氧化為尿囊素所需的酶量為酶活性的1個國際單位(IU)。酶的比活性(IU/mg)為每毫克蛋白所含的酶活性單位數。首先測定不同尿酸濃度在292nm下的吸光度值(A292)，製作標準曲線，具體方法如下按照表1中0-6的體積數值將0.2μmol/ml尿酸貯存液和三乙醇胺緩衝液(TEA buffer，7.5g/L三乙醇胺，0.38/LEDTA，pH 8.9)混合，30℃保溫5min，加入終止液，檢測波長為292nm，測定每個尿酸的光吸收值，每個濃度重複3次，取平均值。利用0-6的數值計算斜率k，公式y＝kx，標準曲線如圖6所示，結果表明K＝5.568/2.1＝2.651。
步驟三表達並提純的尿酸氧化酶進行活性的測定在5ml的反應體系裡，分別加入3ml三乙醇胺緩衝液(TEA buffer，7.5g/L三乙醇胺，0.38g/L EDTA，pH8.9)，1.5ml 0.2μmol/ml尿酸貯存液，1μg(10μl)純化的尿酸氧化酶，30℃保溫5min，然後加入0.5ml 20％的KOH終止液反應結束，測定尿酸濃度，檢測波長為292nm，結果如表1(樣品)所示，根據表中的數值和上述計算得到的K值進行酶活性計算，酶的活性＝[(0.3-OD292/k)/5]×1000；結果表明，酶的比活性＝[(0.3-0.339/2.651)/5]×1000＝34IU/mg酶蛋白。
表1.尿酸氧化酶酶活性測定結果
四、rUox的N端胺基酸序列測定取10μg樣品進行還原SDS-PAGE電泳，將電泳條帶用CAPS緩衝液轉移到PVDF膜上，送協和醫科大學基礎研究所進行N端胺基酸序列測定，序列測定結果為SAVKAARYG KDNVR，與天然的胺基酸序列(序列表中序列2)一致。
序列表16032101211924212DNA213人工序列220
223
4001acccatatgt ccgcagtaaa agcagcccgc tacggcaagg acaatgtccg cgtctacaag 60gttcacaagg acgagaagac cggtgtccag acggtgtacg agatgaccgt ctgtgtgctt120ctggagggtg agattgagac ctcttacacc aaggccgaca acagcgtcat tgtcgcaacc180gactccatta agaacaccat ttacatcacc gccaagcaga accccgttac tcctcccgag240ctgttcggct ccatcctggg cacacacttc attgagaagt acaaccacat ccatgccgct300cacgtcaaca ttgtctgcca ccgctggacc cggatggaca ttgacggcaa gccacaccct360cactccttca tccgcgacag cgaggagaag cggaatgtgc aggtggacgt ggtcgagggc420aagggcatcg atatcaagtc gtctctgtcc ggcctgaccg tgctgaagag caccaactcg480cagttctggg gcttcctgcg tgacgagtac accacactta aggagacctg ggaccgtatc540ctgagcaccg acgtcgatgc cacttggcag tggaagaatt tcagtggact ccaggaggtc600cgctcgcacg tgcctaagtt cgatgctacc tgggccactg ctcgcgaggt cactctgaag660acttttgctg aagataacag tgccagcgtg caggccacta tgtacaagat ggcagagcaa720atcctagcgc gccagcagct gatcgagact gtcgagtact cgttgcctaa caagcactat780ttcgaaatcg acctgagctg gcacaagggc ctccaaaaca ccggcaagaa cgccgaggtc840ttcgctcctc agtcggaccc caacggtctg atcaagtgta ccgtcggccg gtcctctctg900aagtctaaat tgtaagagct cccc 924
2102211301212PRT213黃麴黴(Aspergillus flavus)4002Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr1 5 10 15Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met20 25 30Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys35 40 45Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile50 55 60Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly65 70 75 80Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala85 90 95Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp100 105 110Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg115 120 125Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser130 135 140Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp145 150 155 160Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg165 170 175Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Ash Phe Ser180 185 190Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp
195 200 205Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser210 215 220Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala225 230 235 240Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His245 250 255Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly260 265 270Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile275 280 285Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu290 295 3002103211909212DNA213人工序列220
223
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權利要求
1.一種黃麴黴尿酸氧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述基因的表達載體、工程菌和細胞系。
3.一種表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法，是將權利要求1所述的黃麴黴尿酸氧化酶基因插入原核細胞表達載體，轉化宿主菌，篩選得到表達黃麴黴尿酸氧化酶的工程菌，培養工程菌，表達得到黃麴黴尿酸氧化酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述原核細胞表達載體為pET系列的表達載體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述黃麴黴尿酸氧化酶基因插入到pET系列的表達載體的Nde I和Sac I的酶切位點間，或Nde I和HindIII的酶切位點間；所述pET系列的表達載體優選為pET-32a(+)。
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述工程菌為大腸桿菌。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述方法中，所述表達為誘導表達，所用的誘導劑為IPTG，誘導濃度0.4-1.5mmol/L，優選為1.0m mol/L。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述工程菌的培養溫度為37℃，誘導表達的培養溫度為28-37℃，優選為37℃。
10.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述方法中還包括純化表達得到的黃麴黴尿酸氧化酶的步驟；所述純化包括離子交換、疏水層析和凝膠過濾層析。
全文摘要
本發明公開了一種表達黃麴黴尿酸氧化酶的方法及其專用表達基因。該表達基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明人工合成優化的全基因序列，採用大腸桿菌表達體系，表達水平高，達到可溶性全菌蛋白的40％，周期短，成本低。
文檔編號C12N15/70GK1831132SQ20061005983
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月15日 優先權日2006年3月15日
發明者陳薇, 李建民, 侯利華, 付玲, 於長明 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所