一種鑑別毛白楊2n配子植株的方法
2023-07-15 00:13:06
專利名稱：一種鑑別毛白楊2n配子植株的方法
技術領域：
本發明涉及一種鑑別2n配子植株的方法，尤其涉及一種利用分子標記來鑑別毛白楊2n雌雄配子植株的方法，屬於植物遺傳育種領域。
背景技術：
在林木多倍體育種中，三倍體具有很高的利用價值，尤其是在紙漿用材等纖維材新品種選育中，多倍體細胞的巨大性不僅帶來三倍體的生長提速，同時由於三倍體纖維細胞增長變大，單位材積的纖維細胞數以及細胞表面積相應減小，導致細胞壁木質素等含量降低，而纖維素含量則相對提高，可保證整個產業鏈的綜合效益最大化，具有重要的開發利用潛力(康向陽.毛白楊細胞遺傳與三倍體選育，北京中國環境科學出版社，2002；康向陽.林木多倍體育種研究進展.北京林業大學學報，2003，25(4)70-74)。
三倍體誘導途徑包括利用四倍體與二倍體雜交、利用天然或人工未減數二倍性(2n)花粉雜交、胚乳培養、體配細胞融合等(康向陽.毛白楊細胞遺傳與三倍體選育，北京中國環境科學出版社，2002；康向陽.林木多倍體育種研究進展.北京林業大學學報，2003，25(4)70-74)，其中利用天然2n配子是獲得三倍體的一條最為經濟、快捷的途徑(康向陽.毛白楊2n花粉發生機制的研究.北京林業大學學報，2002，24(5/6)67-70；康向陽，朱之悌，林惠斌.1999.楊樹花粉染色體加倍有效處理時期的研究.林業科學，35(4)21～24；康向陽，朱之悌.白楊2n花粉生命力測定方法及萌發特徵的研究，雲南植物研究，1997，(4)395-401；康向陽，朱之悌，林惠斌.白楊不同倍性花粉的輻射敏感性及其應用.遺傳學報，2000，27(1)78-82)。
在被子植物中，未減數2n配子(Unreduced gametes)發生極為普遍，但大多是通過2n花粉與正常花粉的形態差異觀察而發現的。由於2n雌配子難以象2n大花粉那樣能夠通過形態觀察檢出，因此有關植物中發生未減數2n雌配子的報導，往往是根據對後代倍性分析得出的推論(Mok W S，Peloquin S J.Three mechanismsof 2n pollen formation in diploid potatoes.Can.J.Genet Cytol.，1975，17217-225；Ramanna M S.A reexamination of the mechanisms of 2n gametes formation in potatoand its implications for breeding.Euphytica，1979，28537-561；Veilleux R E.2ngametes in diploid Solanum tuberosum frequency and types of spindle abnormalities.Can J Genet Cytol，1982，24301-314)。
有關研究表明，環境因素對2n配子的出現頻率有一定影響，而起決定作用的是遺傳因素。Satina等(1935)最早研究指出，曼佗羅(Datura)的2n配子發生是受一個隱性基因控制的(Jacobsen E.Increase of diplandroid formation and seedset in 4x×2x crosses in potatoes by genetical manipulation of dihaploids and sometheoretical consequences.Z.Pflanzenzucht，1980，85110-121)。此後眾多的植物遺傳學研究形成普遍性認識，即2n配子的產生主要由單個隱性基因控制的，產生2n配子的性狀可以高度遺傳。但也有研究表明2n配子發生受控於一個主基因和數個微效基因(王倩，王斌.DNA分子標記在果樹遺傳學研究上的應用.遺傳，2000，22(5)339-344；張博，黃敏仁，諸葛強，等.美洲黑楊抗黑斑病基因的RAPD標記篩選和連鎖分.遺傳，2002，24(5)543-547；李仕貴，馬玉清，王文明，等.一個新的水稻遲熟性基因的遺傳分析和分子標記定位.遺傳學報，2000，27(2)133-138)。
由於2n雌配子不存在單倍性配子競爭問題，受精後這些2n雌配子可100％形成三倍體，因此，即使其發生的比率較低，仍具有非常高的研究與利用價值，然而難處在於如何採取一定的技術方法檢出這些天然2n雌配子植株。
在遺傳學研究中，通常將可識別的等位基因稱為遺傳標記。分子標記是以DNA分子多態性為基礎的遺傳標記，實質就是特定的DNA序列(王明庥主編.林木遺傳育種學.北京中國林業出版社，2001)，分子標記的方法主要有RFLP(Restriction Fragment Length Polymorpnism)、RAPD(Random AmplifiedPolymorpnism DNA)、AFLP(Amplified Fragments Length Polymorpnism)等。分子標記具有信息量大、掃描遺傳位點多、不受生物組內基因互作、外部環境、人為操作以及基因表達與否等因素影響等特點，正成為植物遺傳學研究和育種的有效工具。
擴增片段多態性(Amplification fragment length polymorphism，AFLP)是由Vos於1995年所提出，其作用原理為首先將基因組DNA以兩種限制性內切酶切開，之後再以帶有前述所使用的限制性內切酶專一序列的兩個雙股轉接子(adaptor)分別黏於被切出之DNA片段的兩端，以產生模板DNA再進行後續的PCR擴增。擴增程序分兩段進行，第一個擴增程序稱為前擴增，系以帶有一個選擇性核甘酸延伸序列的引物行擴增反應；第二個擴增程序稱為選擇性擴增，系以帶有較長選擇性核甘酸延伸序列的引物行擴增反應。最後利用聚丙烯醯胺膠體電泳進行PCR產物分離，再用銀染方式分析結果。AFLP分子標記方法具有重現性好、安全快捷、簡便經濟等優點，可廣泛應用於基因鑑定、基因作圖，表達等方面。
天然毛白楊2n配子植株與非2n配子植株間存在DNA多態性差異，採用AFLP分子標記方法，可以快速、準確的將二者區分開來，但其前提是需要篩選得到特異的可用作標記的引物序列。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種鑑別毛白楊2n雌雄配子植株的方法。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種鑑別毛白楊2n雌或雄配子植株的方法，包括以下步驟以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列(簡稱為E50-M38)作為分子標記的引物組合，採用常規的擴增片段多態性(Amplification fragment lengthpolymorphism，AFLP)分子標記方法對需鑑定的毛白楊無性系植株進行分子標記，如果從待鑑別的毛白楊植株中沒有擴增出1條大小為246bp的多態性條帶，則該毛白楊植株是2n雌或雄配子植株；或以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列(簡稱為E31-M50)作為分子標記的引物組合，採用常規的AFLP標記方法對需鑑別毛白楊植株進行分子標記，如果從待鑑別的毛白楊植株中擴增出1條大小為204bp的多態性條帶，則該待鑑別毛白楊植株是2n雌或雄配子植株。
本發明以毛白楊雄株為參照系，根據未減數2n花粉比正常減數花粉形態巨大的特性，採用花粉粒鏡檢技術對毛白楊2n花粉發生情況進行觀察，選擇典型雄性無性系，分成2n花粉植株與不產生2n花粉正常植株兩個集群，分別等量混合提取DNA，構建一對2n花粉型與正常型近等基因池；利用AFLP等DNA分子標記技術，對構建好的毛白楊2n花粉型與正常型近等基因池進行分析，篩選、確定得到與2n花粉發生相關的分子標記的引物序列組合(SEQ ID NO1和SEQID NO2；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。本發明用上述所篩選的特定引物組合，採用常規擴增片段多態性分子標記方法對需要鑑別的植株進行分子標記，根據標記結果中特定多態性條帶的有或無，可以準確、快速地鑑別出毛白楊2n雌雄配子植株以及實現子代2n配子植株早期鑑定，對於毛白楊三倍體的育種具有重要的意義。同時，本發明方法對其它相似植物2n雌配子植株的選擇也有借鑑價值。
圖1為引物組合E50-M38在毛白楊無性系中的多態性。
圖2為引物組合E31-M50在毛白楊無性系中的多態性。
圖1，圖2中左邊第1泳道為DNA Marker；第2、3泳道分別為產生2n花粉與不產生2n花粉的混合，第4至第22泳道為產生2n花粉的20個毛白楊無性系，第23至第29泳道為不產生2n花粉的6個毛白楊無性系，箭頭所指為擴增出的多態性條帶。
具體實施例方式
以下通過實施例來進一步描述本發明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的範圍。
說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆試驗手冊》(Sambrook等編著，科學出版社，1992年版)一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
一、試驗材料1)毛白楊2n雄配子植株158株；2)毛白楊單倍性雄配子植株140株。產地包括北京、河北、河南、山西、陝西和甘肅。
二、試驗方法1、分別提取毛白楊2n雄配子植株和單倍性雄配子植株的基因組DNA，提取方法如下1液氮研磨約2g葉片，轉移到2ml的離心管中，加入1000ul經65℃預熱的SDS提取緩衝液和終濃度為2％的β-巰基乙醇，65℃水浴30分鐘。
2加入等體積的酚，輕搖15分鐘，靜置5分鐘，1200rpm離心10分鐘。
3抽取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，搖勻靜置5分鐘後1200rpm離心10分鐘。
4抽取上清，加入2倍體積的異丙醇，輕搖至沉澱產生，靜置片刻後1000rpm離心5分鐘。
5棄去異丙醇，加入600ul含有50ng/mlRNA酶的TE緩衝液，輕搖止沉澱溶解，37℃水浴30分鐘。
6加入等體積的酚，充分混勻，靜置片刻後1200rpm離心10分鐘。
7抽取上清，加入等體積氯仿，充分混勻，靜置片刻後1200rpm離心10分鐘。
8抽取上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20℃沉澱30分鐘，-4℃，1200rpm離心10分鐘。
9棄去上清，70％酒精洗滌3次，風乾後用適量TE緩衝液溶解，取適量在0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2、分別對所提取的毛白楊2n雄配子植株和單倍性雄配子植株基因組DNA進行酶切，分別將酶切片段與接頭連接，具體方法如下1反應體系DDH2O 13.05ulT4ligase緩衝液(10×) 2.0ulEcoR I adaper(50pmol/ul) 1.0ulMse I adaper(5pmol/ul) 1.0ulEcoR I 20U/ul) 0.15ulMse I 10U/ul)0.3ulT4ligase酶(10U/ul) 0.5ul所提取的DNA(200ng/ul)2.0ul反應總體積 20ul2反應條件37℃恆溫酶切連接4小時。
3、分別進行預擴增(酶切連接液稀釋6倍)1反應體系DDH2O 12.1ul
PCR緩衝液(10×)2.0uldNTP(25mM/ul) 1.5ul引物1(SEQ ID NO1，50ng/ul) 1.0ul引物2(SEQ ID NO2，50ng/ul) 1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.4ul酶切連接液稀釋液 2.0ul總體積 20ul2PCR條件程序194℃3min程序294℃30s56℃30s72℃1min程序2共30個循環；程序372℃5min程序44℃。
4、分別進行選擇性擴增(預擴增產物稀釋20倍)1反應體系DDH2O 10.1ulPCR緩衝液(10×) 2.0uldNTP(25mM/ul)1.5ul引物1(SEQ ID NO1，50ng/ul) 1.0ul引物2(SEQ ID NO2，50ng/ul) 1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.4ul預擴增稀釋液 4.0ul總體積 20ul2PCR條件程序194℃3min程序294℃30s65℃30s(-0.7℃/循環)72℃1min
13個循環(Touchdown-PCR)。
程序394℃30s56℃30s72℃1min25個循環；程序475℃5min程序54℃。
5、聚丙烯凝膠電泳選擇性擴增產物加入5ul上樣緩衝液(loading buffer)混合後，95℃變性5分鐘後，立刻轉移到冰浴中冷卻，取6ul上樣到6％的聚丙烯凝膠電泳，90W恆功率電泳90分鐘。
6、銀染1固定，塑料盒中倒入1.5L新配製的10％冰醋酸，輕搖至凝膠脫色後用蒸餾水漂洗10分鐘。
2染色，將玻璃板從塑料盒中拿出，放入1gAgNO3/H2O並加入1.5ml甲醛的硝酸銀水溶液。
3水洗，用DDH2O洗膠板不超過5秒。
4顯影，膠板移至2L預冷的顯影液中，輕搖至帶紋出現。
5定影，帶紋出現後放入固定液，固定5分鐘。
6衝洗，用DDH2O洗膠板5分鐘。
7膠的乾燥，室溫下自然乾燥後照相。
三、試驗結果所有的毛白楊2n雄配子植株中均沒有擴增出1條大小為246bp的多態性條帶，與之相反，所有的毛白楊單倍性雄配子植株中均擴增出1條大小為246bp的多態性條帶(SEQ ID NO5)(圖1)。
一、試驗材料和方法試驗材料和方法均與試驗例1相同，唯一不同的是進行分子標記時的引物組合的序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
二、試驗結果從所有的毛白楊2n雄配子植株中擴增出1條大小為204bp的多態性條帶(SEQID NO6)，與之相反，所有的毛白楊單倍性雄配子植株中均未擴增出1條大小為204bp的多態性條帶(圖2)。
試驗結果表明，本發明方法能夠快速、準確地鑑別出毛白楊2n雌雄配子植株，可應用於生產或科研實踐中毛白楊2n雌雄配子植株的鑑別。
序列表110北京林業大學120一種鑑別毛白楊2n配子植株的方法130p08981606170PatentIn version 3.3210121119212DNA213Artificial220
223
4001gactgcgtac caattccat 19210221119212DNA213Artificial220
223
4002gatgagtcct gagtaaact 19210321119212DNA213Artificial220
223
4003gactgcgtac caattcaaa 19210421119212DNA213Artificial220
223
4004gactgcgtac caattcaaa 192105211246212DNA213(Poppulus tomentosa Carr.)4005gatgagtcct gagtaaactg atgaaggctt gttgagctta tgcattccaa ccataattgt 60gtttcttcag caaattggtg aggggtttac taatgatccc aaaatgtcat atgaacttcc120tataataccc agccaacccc aggaatcctc gtaattcctt caaggattgc aaagtaggcc180aattgtccac aacttcaatt ttcttcctat tggttgccac tccttctatg gaattggtac240gcagtc 246
2106211204212DNA213(Poppulus tomentosa Carr.)4006gactgcgtac caattcaaat ggttctacca gggtagtgaa attccagaat ggttcggtga 60caaaggaatt ggatcttcac ttaccataca gttgccctca aattgttatc agctcaaggg120aattgctttt tgccttgtct ttctactcca tcttccctcc tataaaatgg tatattttga180ttaccatgtt actcaggact catc 20權利要求
1.一種鑑別毛白楊2n雌或雄配子植株的方法，包括以下步驟以SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列作為分子標記的引物組合，採用常規的擴增片段多態性分子標記方法對需要鑑別的毛白楊無性系植株進行分子標記，如果從待鑑別的毛白楊植株中沒有擴增出1條大小為246bp的多態性條帶，則該待鑑別毛白楊植株是2n雌或雄配子植株；或以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列作為分子標記的引物組合，採用常規的擴增片段多態性分子標記方法對需要鑑別的毛白楊植株進行分子標記，如果從待鑑別的毛白楊植株中擴增出1條大小為204bp的多態性條帶，則該待鑑別毛白楊植株為2n雌或雄配子植株。
全文摘要
本發明公開了一種鑑別毛白楊2n雌雄配子植株的方法，屬於植物遺傳育種領域。本發明採用常規的擴增片段多態性作為分子標記的方法，以篩選得到的特定核苷酸序列組合作為分子標記的引物，對需鑑別的毛白楊無性系植株進行AFLP分子標記，根據標記結果中特定多態性條帶的有或無，能夠快速、準確地鑑別出毛白楊2n雌雄配子植株。本發明方法對於毛白楊三倍體育種具有重要的意義，同時，對其它相似植物2n配子植株的選擇也有一定的借鑑價值。
文檔編號C12Q1/68GK1858257SQ200610064959
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月20日 優先權日2006年3月20日
發明者康向陽, 張正海 申請人:北京林業大學