無蛋白質配子和胚胎處理及培養基產品的製作方法

2023-07-15 00:32:46 3

專利名稱：無蛋白質配子和胚胎處理及培養基產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及專門用於人類生殖和生育程序，並且針對該程序經過優化的無蛋白質 培養基(PFM)。本文中描述的基本上無蛋白質的培養基產品可用於防止結合於蛋白的病原 體(特別是朊病毒等)傳播給正在接受不孕症治療的患者、通過輔助生殖技術(ART)懷育 的新生兒、和這些領域的從業人士，特別涉及在人ART中的應用。
背景技術：
用於人類ART程序(procedures)的傳統市售胚胎培養基含有從人血液和組織來 源獲得的人血清白蛋白(HAS)。在一些實驗室中，也使用類似地從牛血液和組織來源獲得 的牛血清白蛋白(BSA)作為人類胚胎培養程序中蛋白質的來源(Loutradis et al. , 1992 ； Quinn, 1994) 含有HSA和BSA的培養基的效力據報導是相似的(Staessen et al.，1998)。 在培養基中使用從供體(人類或牛)獲得的蛋白質有將疾病傳播給接受輔助懷孕治療的患 者的潛在可能。近年來尚未有人描述過在化學限定的(沒有添加的蛋白質或白蛋白、或動物 或人來源的蛋白提取物)培養系統中，從收集卵母細胞開始，隨後進行精子衝洗(sperm washing)、授精、受孕到卵裂胚階段，最後進行胚胎移植，產生活的人類胚胎的過程。儘管 近年來報導了用於小鼠、家兔和靈長類動物的化學限制培養基(Spindle，1995 ;Li et al., 1996 ；Schramm and Bavister，1996)，。先前聲稱的用於人類的化學限定無蛋白質培養基 (PFM)實際上不是真的沒有蛋白質，因為用於受精的精子仍然是在含有血清蛋白的培養 基中製備的(Mohr & Trounson，1986 ;Serta and Kiessling 1997 (Abst) ；Parinaud et al. 1999)。因此，迄今為止尚未描述過用於ART程序的完全無蛋白質的培養基。本領域中需要有用於產生活的早期分裂階段的人類胚胎的化學限定培養基，以避 免使用潛在有危險的供體蛋白，保證正在進行輔助生殖治療的患者的安全。人們對可能傳 播病原性疾病(pathogenic disease)，特別是病毒性疾病，例如人類獲得性免疫缺陷綜合 徵(AIDS)和肝炎，或者由血源產物中的朊病毒等傳播的Creutzfeldt-Jakob病(CJD)等的 擔憂，已經促使全世界ART領域內的許多醫療服務供應商開始搜尋供體蛋白的替代物來用 於胚胎培養和處理程序。致死性病毒疾病(AIDS)通過血源產品對血友病患者的傳播已經有大量的文獻記 錄(見例如 Craven et al. , 1997,Med. Sci. Law 37 215-227 ；Keshavjeeet al.，2001，Soc. Sci. Med. 53 1081-1094 ；Weinberg et al. ，2002, Ann.Intern. Med. 136312-319 ；Evatt, 2006，Semin. Hematol.型S4-9)。從垂體提取的人類生長激素已被發現能夠向人體傳播 CJD (Esmonde et al.，1994)，並且人促性腺激素注射也能夠在人與人之間傳播CJD (CDC， 1985)。CJD可以通過血液傳播(儘管CJD朊病毒的滴度在血液中較低；Heye et al.，1994)。 過去曾在大約200名IVF患者在接受了在含有被乙型病毒汙染的混合血清(pooled sera) 的培養基中培養的胚胎後發生了B型肝炎流行(van Os et al.，1991)。最近，科學界面臨 著這樣的難題，即必須通知他們的患者，用於胚胎培養和處理的市售培養基製劑可能被由 後來死於CJD的人捐獻的白蛋白所汙染(Kemmarm，1998)。
有大量報導在無蛋白質培養基中從受精卵和卵裂階段育成了小鼠胚泡。最早的 報導包括Brinster (1965)和Cholewa and Whitten (1970)，後者使用高分子量膠體聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)作為潤滑劑和用於增加培養基的粘度。該項工作之後，許多其它的工作者 在無蛋白質培養基中成功培養了小鼠以及其它哺乳動物胚胎(Dandekar and Glass, 1990 ； Spindle, 1995 ；Li et al. , 1996 ；Schramm and Bavister，1996)。近些年，除了 PVP 之外， 聚乙烯醇(PVA) (Bavister，1995)也被用於替代培養基中的血清蛋白質。例如，Biggers等 (1997)研究了用聚乙烯醇(PVA)和/或胺基酸代替牛血清白蛋白(BSA)對小鼠受精卵發育 的影響。他們評論到(observed)，PVA不能完全代替小鼠胚胎培養基中的BSA。PVA對胚泡 發育速度的影響僅比BSA略低，但是部分孵化(partial hatching)的速度卻顯著降低。用 PVA代替BSA會降低整體響應，但不會導致大的幹擾。除了其許多生物學作用之外，血清蛋白可帶來許多有用的物理性質，例如培養基 的潤滑和粘度。為了容易處理和操作胚胎並防止其附著於培養盤和胚胎移植導管(embryo transfer catheter)的壁上，需要增加培養基的潤滑和粘度。PVP和PVA的加入僅僅是提 供與血清蛋白一樣的物理屬性。然而，PVP和PVA不是固定化氮的來源，並且它們也不執 行蛋白質的各種生物學作用。此外，PVP和PVA的致畸性質(teratological properties) 尚沒有得到完全檢查，使其在人類治療性輔助生殖中的使用存在疑問(Gardner and Lane, 1998a)。一些研究人員已經嘗試在無蛋白質培養系統中產生活的人類胚胎，最近的是 Serta等(1997)和Parinaud等(1998a)。然而，Serta與其合作者(1997)用於授精的精 子是通過沿BSA柱下遊(swim-down)製備的(儘管隨後的培養在無蛋白質培養基中進行)。 這些工作者實現了 31% (η = 45)的懷孕率，其中一些懷孕足月產下了正常後代。Parinaud 等(1998a)用在無蛋白質培養基中製備的精子進行受精，授精在相同的培養基中進行。然 而，得到的受精卵是在BMl培養基中培養的，儘管該參考文獻沒有詳述其BMl培養基是否 含有蛋白質，但是該研究組的先前出版物提示，BMl培養基含有HSA(Parinaud et al.， 1998b)。一些工作者已經顯示，在小鼠和人類中，用單一的抗氧化劑和螯合劑例如EDTA代 替血清蛋白(Mehta and Kiessling, 1990 ；Serta et al.，1997)不會破壞受精和活胚胎 的分裂(cleavage)。然而，Serta等(1997)建議用無蛋白質培養基充分漂洗胚胎移植導 管，這暗示胚胎易於粘附到胚胎移植導管內壁。血清蛋白質還具有保持培養基PH的作用 (Moessner et al.，1993)。除了其作為生物系統中營養物的作用之外，蛋白質還具有許多 其它的作用，例如鏈斷裂性抗氧化劑(chain-breaking antioxidant)和金屬離子螯合劑 (Barber, 1961 ；Vidlakova et al.，1972 ；Wayner et al.，1987)。白蛋白和血漿蛋白的一般生理學功能已經有大量文獻證明。白蛋白在防止膜過氧 化中的作用表明其在膜穩定性中具有直接的作用。它參與毛細管膜滲透性和滲透壓調節。 白蛋白提供了血漿中總膠體滲透壓的80%。白蛋白參與二氧化碳的運輸並發揮pH緩衝劑 的作用；白蛋白佔據血漿中非碳酸氫鹽緩衝劑值的最大部分(95%)。蛋白質還作為能量的 來源。脫氨基的丙氨酸是丙酮酸鹽，其可以被轉化成乙醯-CoA或葡萄糖和糖原。白蛋白可 以輔助溶解脂質和運輸激素、維生素和金屬。它充當這些組分釋放和使用的蓄池。因此，替換培養基中血清白蛋白的任何嘗試都應當考慮到這些有用於在體外進行胚胎處理和操作的體內作用和物理性質。單一的組分不可能滿足血清蛋白質的所有功能。儘管先前已經描述了支持大量動物物種發育的無蛋白質培養基，但是這些無蛋白 質培養基均沒有成功地用於人類，也無法假定這些培養基可以支持或者人類胚胎發育或者 對於人類胚胎發育而言是最優的。因此，仍然非常需要有特別適用於人類ART和IVF的限 定的無蛋白質培養基。相關
背景技術：
先前已知有用於處理和培養哺乳動物細胞，特別是來自嚙齒類動物(小鼠、大鼠、 豚鼠等)的細胞的推定「無蛋白質」培養基，也可用於人類體外受精中的受精、胚胎發育和 妊娠。Caro等已經描述過一種這樣的用於人類的「無蛋白質」培養基，然而它們不能克服 精子製備培養基對蛋白質的需要，因為蛋白質是誘導精子獲能所需要的，沒有它們，精子不 能獲得穿透和/或使卵子受精的能力。因此，Caro與其合作者的培養基系統不是完全沒有 蛋白質的。類似地，Serta等(1997 ；摘要)和Parinaud等(1998a，摘要；1999)也描述了 用於人類ART的「無蛋白質」培養基，但是他們與之前的Caro等(1986) —樣，在其培養系 統的至少一個階段內使用了蛋白質。如這些參考文獻中描述的，用含有外加蛋白的培養基衝洗先前製備的精子不能完 全確信可除去汙染的感染原，特別是病毒和朊病毒。此外，這也是不利的，因為它使精子經 歷不必要的壓力(stressful)清洗過程，並需要消耗多餘的人力和資源。在例如下列文獻中公開了與IVF無關的用於培養哺乳動物特別是人細胞 的「無蛋白質」培養基Κον Γ et al. , 1987, Biotechnology Letters, vol. 9no. 4, p. 259-264 「Iron Compounds at high Concentrations Enable Hybridoma Growth in a Protein-free Medium" ；Keen,1995, Cytotechnology, vol. 17 :193-202 「The culture of rat myeloma and rat hybridoma cells in a protein-free medium" ；Stoll et al., 1996, J. Biotechnology, vol. 45,p.111-123 "Systematic improvement of a chemically defined protein-free medium for hybridoma growthand monoclonal antibody production. 」。該工作具體地涉及單克隆抗體產生，而沒有公開將這種培養基用於IVF 或ART用途。其它出版物公開了無蛋白質生長介質，但不適宜或適合於人類IVF程序，這 些出版物包括:Zang et al.，1995，Biotechnology, vol. 13，p. 389-392, "Production of Recombinant Proteins in Chinese Hamster Ovary Cells Using A Protein-Free Cell Culture Medium」 ；和國際專利申請公開 no. WO 2005/120576A2。本發明概要本發明涉及新型無蛋白質培養基配方，其用於人類卵子獲取(retrieval) (i. 「衝 洗培養基」)，精子操作和保存(ii. 「配子處理培養基」)，人類卵子受精(iii. 「胚胎培養 培養基」)，配子和胚胎處理(iv. 「配子和胚胎操作培養基」)，以及受精卵在培養條件下經 過1-2個分裂周期的發育(v.胚胎培養基)，在使用ART程序治療和減輕生育力低下和不 孕的人體應用中使用。本發明包括配製單一培養基溶液，該溶液能夠代替(Mplace)上述 的所有新培養基溶液，和/或可以用作上述所有新培養基溶液的替換品(!^placement)/ 介質(medium)。本發明的基本上沒有蛋白質的培養基與先前由相同發明人報導的無蛋白 質培養基(彼處稱作ART-7和ART-7b系列)(Ali，1997 ；Ali et al.，2000)截然不同。在先前報導中，發明人描述了他們所進行的系統性研究，該研究導致他們配製出了三種前驅 (precursor)培養基，稱作ART-1、ART-2和ART-3。在同一報導中，這些發明人描述了基本 上無蛋白質的培養基系列ART-7和ART-7b是如何從ART-I培養基演變而來的。通過在基 本上無蛋白質的ART-7和ART-7b培養基系列中進行胞質內精子注射(ICSI)產生的胚胎被 成功地用於治療11/21名(52.4% )39歲以下的婦女，實現了臨床妊娠。ART_1、ART_7和 ART-7b培養基系列的配方尚沒有公開。本發明提供了基本上無蛋白質的培養基，其從前驅 ART-3培養基配製而來，但又與之不同。本發明人已經描述了前驅ART-3培養基的開發，但 沒有描述其組成(Ali, 1997 ；Ali et al.，2000)。在本發明的舉例實施方案中，具體公開了一系列基本上無蛋白質的培養基，這裡 稱作PFM-Il系列。這些培養基具有明確的優點，即成分均勻，沒有潛在有危險的不均一的 (non-uniform)生物成分，這些不均勻生物成分可能危害配子和胚胎，並可能向正在進行 ART治療的患者、通過這種治療受孕的嬰兒和參與ART治療程序的衛生工作者傳播目前已 知或者迄今未知的致死性疾病，該培養基符合管理體外受精技術和方法的嚴格的新標準和 規章。本發明基本上無蛋白質的培養基配方的完全被限定的性質，也使得它可以 用來幫助進行對胚胎植入前的胚胎代謝的研究。目前可用的胚胎培養基配方沒有限 定，而且成分不均勻，阻礙了這方面的研究。使用連續超小液滴(cUMD) (continuous ultramicrodroplet)培養技術在這些基本上無蛋白質的培養基(PFM)中產生的第2天人 類胚胎的質量與在含有血清蛋白質的對照商業培養基配方中發育的胚胎相當或者更好。所 述PFM培養基對人類精子無毒。通過傳統IVF和胞質內精子注射(ICSI)進行受精和隨後 人類胚胎的發育與對照相當。本發明基本上無蛋白質的培養基還適用於基本上無蛋白質的人類胚胎培養 和操作培養基，並可保證不會向患者和新生兒傳播蛋白質結合的疾病(protein-bound diseases)。本發明的基本上無蛋白質的培養基可以在-20°C冷凍保存長達2年，而不會損 失效力。本發明成功地克服了在培養系統中添加供體蛋白質的需要，並提供了用於人類 ART應用的基本上無蛋白質的培養基系統，所述人類ART應用使用基本上無蛋白質的培養 基產品，從卵子獲取開始，經過精子製備、授精(insemination)、受精(fertilization)、所 得胚胎培養和胚胎移植。這個特徵有利地將本發明的培養基與先前描述的「無蛋白質」培 養系統區分開，先前系統在程序的某些點上使用含有蛋白質的培養基產品，因此不是完全 無蛋白質的。結果，這些先前的培養基可能被感染原(infectious agent)汙染，並可能面 臨法規限制。在本文中提出了本發明的組成、範圍、優選範圍和各種成分的具體規格。本發明是通過研究能夠在體內和體外部分代替蛋白質的各種作用的單個成 分(例如胺基酸、抗氧化劑和螯合劑、滲透物、維生素、營養物和替代能量源)的效果 (effect)、耐受性(tolerance)；並確定它們的最佳水平而獲得的；其例示了蛋白質在本發 明的沒有供體血清蛋白質的各種無蛋白質操作培養基(例如精子和卵子操作培養基，和 ICSI培養基)和胚胎培養基中的作用。利用上述成分的最佳濃度配製多種胚胎培養基。隨 後，鑑定了這些培養基中顯示最佳胚胎發育和顯著更高胚泡孵化率的培養基，並進一步優 化，以在不添加血清蛋白質的條件下支持人類胚胎發育。本發明基本上無蛋白質的培養基能夠支持用在相同培養基中製備的精子對人類卵子授精。所得的配子隨後在基本上無蛋白 質的培養基中發育形成活的早期卵裂階段的人類胚胎。移植這些胚胎，可實現正常的妊娠 和活產。因此，本發明成功地提供了可用於整個IVF/ART程序(卵子獲取、精子製備、播種、 授精、所得胚胎的培養和胚胎移植)的培養基，其克服了在培養系統中添加蛋白質的需要。本發明某些實施方案的詳細說明本發明提供了一系列營養溶液，一般地稱作胚胎操作培養基和培養培養基，其沒 有任何蛋白質和類蛋白質成分。這些培養基可用於人類卵子的受精和隨後受精卵在體外發 育達2-6天。這些營養溶液稱作「胚胎培養培養基」。除了 IVF和ART之外，可有利地使用基 本上無蛋白質的營養生長培養基的其它方法和技術包括幹細胞技術和治療、細胞/組織再 生和移植治療程序。技術人員可意識到如何將本文中所述培養基加以改造用於這些用途。如將在下面進一步詳細公開的，通過將本發明的基本上無蛋白質的培養基用於人 類配子和胚胎，增加了 IVF和ART的效力。例如，使用基本上無蛋白質的培養基(PFM-Il) 進行常規IVF獲得的臨床懷孕率在所有年齡組中均增加到了 50% (14/28)，而且在年齡低 於40歲的婦女中高達53. 8% (14/26)；相比之下，目前可得的含蛋白質胚胎培養基對於組 合的所有年齡組僅有33%的懷孕率(如Ali，2004中所引述)。使用本發明基本上無蛋白 質培養基的ICSI臨床懷孕率在所有年齡組中同樣增加到46. 2% (12/26)，在年齡低於40 的婦女中高達54. 5% (12/22)。該差異是統計學上顯著的，其優勢在本發明的基本上無蛋 白質的培養基一方，表明本發明的基本上無蛋白質的培養基至少等同於(並可能優於)目 前市場上可得的商業含蛋白質培養基。從通過常規IVF在PFM-Il培養基中產生的胚胎出 生的嬰兒數量為12，而通過ICSI出生的嬰兒數量為12。從在本發明PFM-Il中產生的胚胎 出生的嬰兒外觀正常、聰明、健談並且活潑(根據父母報告)。這些統計數據從一個包含至 少24個這樣出生的孩子的樣本中產生。如這裡所使用的，術語「無蛋白質」、「實質上無蛋白質」和「基本上無蛋白質」意圖 表示所述培養基是用不含蛋白質的組分(如本文將更詳細描述的)製備的，並且沒有向培 養基中添加蛋白質或含蛋白質的組分。本發明的舉例實施方案包括一系列基本上無蛋白質的培養基，稱作PFM-Il系列。 這些培養基系列具有眾多專門的培養基產品，即1.基本上無蛋白質的衝洗培養基2.基本上無蛋白質的配子(精子)操作培養基3.基本上無蛋白質的配子(卵母細胞/胚胎)操作培養基4.基本上無蛋白質的胚胎培養基這些培養基根據下文提出的方法加以使用，這些方法意圖舉例說明這些培養基的 用途，但並不限制這些培養基的任何其它用途，例如在本領域技術人員已知的IVF或ART方 法中的其它用途。在如這裡提出的實驗中開發本發明培養基時，每一個程序用常規的含蛋 白質培養基和本發明的舉例PFM平行地進行。人類精子製備男性患者通過自慰產生人類精液。通過標準上遊技術(swim-up technique)製備 精子，偶爾使用密度梯度離心。在密度梯度程序中，將回收的離心沉澱(pellet)清洗兩次，並重新懸浮在培養基中。精子製備物用試驗或對照培養基(視情況適宜)加以製備。具體 地說，在基本上無蛋白質的培養基(PFM-Il)中製備用於ICSI或IVF的精子，用於考察蛋白 缺乏對胚胎發育的影響的實驗。收集的精子在5% CO2氣氛下37°C溫育，直到使用。卵巢刺激和卵母細胞獲得通過皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑(Buserelin ；Suprefact ；Hoescht, Frankfurt,Germany)誘導卵巢刺激，從黃體中期開始，直到月經或者實現下調。當子宮內膜 厚度為4mm或更少，並且當血液雌二醇、黃體酮和LH水平達到基線值時，認為實現了下調。 注射促卵泡(follicle)激素(FSH ；Metrodin ；Serono, Rome, Italy)三天，以引發卵泡募集 (recruitment of follicles)。之後，根據患者的響應施用人絕經期促性腺激素(Pergonal 500 ；Serono, Rome, Italy)，以刺激卵泡發育。在卵泡大小達到16mm或者更大後，通過注射 10，OOOIU人絨毛膜促性腺激素(hCG ；Pregnyl ；Organon，Oss，Holland)誘導排卵。36h後通 過超聲引導陰道抽吸(ultrasound guided vaginal aspiration)進行卵母細胞抽取(OR)。授精和培養技術在經過平衡和胚胎測試的(equilibrated and embryo tested)礦物油(M8410， Sigma Chemicals, and USA)下，卵母細胞用在經平衡的培養培養基微液滴中100，000個/ mL的活動精子個別授精。受精的卵母細胞在含5% CO2的空氣的氣氛下37°C培養。第二天早 上，卵母細胞用剝露移液器(denuding pipettes) (Stripper ,MidAtlantic Diagnostics, USA)剝露。胞質內精子注射(ICSI)在一種可選擇的程序中(用於例如克服人類男性因素生育率低下)，執行ICSI。 通過暴露於透明質酸酶溶液 30 秒(80IU/mL ；Cat No. 10110010, Medi-Cult A/S, LerS0 Parkalle 42,2100 Copenhagen, Denmark)製備用於ICSI的卵母細胞，然後轉移到平衡的 Medi-Cult 或本發明基本上無蛋白質的培養基中。將人類卵母細胞在含5% CO2的空氣的 氣相中於培養基中37°C溫育5-7分鐘，然後用剝露移液器(ART No. 1670, International Medical Products BV, Zutphen,Holland)剝露。將剝露的人卵母細胞清洗，並最終在培養 基中進一步溫育30-60分鐘。使用商業上可得的ICSI移液器進行顯微操作(注射針頭，Cat No. 130340B ；手持 移液器(holding pipette) ,Cat No. 13030013 ；Laboratoire CCD，60Rue Pierre Charron, 75008Paris, France 或注射針頭，Cat. No. 10-MIC ；手持移液器，Cat. No. 10-MPH-120 ； Humagen, Charlottesville, Virginia 22911，USA)。 將 5yL PVP(Cat No. 1089001， Medi-Cult A/S,Denmark)超微液滴在一個培養皿(Cat No. 1006,Falcon Plastics,Becton Dickinson, Rutherford, New Jersey,07070, USA)的中心薄薄展開。將展開的 PVP 用最 多 5個 IOyL HEPES 緩衝的 IVF 培養基(Gamete-1009Scandinavian IVF Sciences AB, Gothenberg, Sweden)微液滴包圍。將這些微液滴用經平衡和胚胎測試的礦物油(M8410， Sigma Chemicals,USA)覆蓋。將精子製備物(HyL)加入到展開的PVP的中心。以常規 方式進行成熟卵母細胞的ICSI (例如，Palermo等，1992所述)。超微液滴培養在事先充滿平衡礦物油的4孔培養皿中製備培養基的超微液滴(UMD ；1. 5-2 μ L 用於3-7個人類胚胎的培養)。將培養皿在含5% CO2的空氣中37°C溫育。在預備試驗中(preliminary experiment)，每天用精細拉制的巴斯德吸管(finely drawn out Pasteur pipette)用平衡的培養基更換培養基(UMD技術)，但在後來的實驗中則培養3天後才更換 (cUMD ；或連續 UMD)。受精的確定在ICSI或IVF後18h_20h確定受精。當可以見到兩個迥然不同的原核時，認為卵 母細胞已經受精。將受精的卵母細胞在5% CO2氣氛下在37°C平衡培養基的微液滴或超微 液滴中培養。在24h後評估分裂和胚胎質量。受精卵阻滯率(Zygote Arrest rate)這個參數用於確定本發明的培養培養基是否導致發育在一細胞期發生停滯。培養 基的效力可以用該測定方法加以確定。發育停滯於一細胞期的比例高，表明培養基有缺陷 或效力低。確定第二日分裂胚胎質量採用兩個參數確定第二日胚胎的胚胎質量，也就是平均卵裂球得分和平均胚胎 等級。它們如下確定
(i) 平均卵裂球得分=卵裂球總數
胚胎總數
(ii) 平均胚胎等級=總胚胎等級
胚胎總數因為大多數健康的第二日人類胚胎一般會達到四細胞期，平均卵裂球得分為4或 者更高(範圍在2-6)被認為是優秀的。胚胎根據1-4的級別進行分級，其中數字1表示質 量差，4表示質量優秀。胚胎根據至少3個(但優選地4個)實驗人員的結果綜合進行分 級。此外，還包含兩個其它的參數用於確定卵裂期胚胎發育速率的差異。它們是在人類研 究中培養第二日(i)處於四細胞期或者更高階段的胚胎的比例和(ii)等級為3或者更高 的胚胎的比例。培養基配方這裡描述的一種作為示例的本發明的基本上無蛋白質的培養基的配方如下。白蛋 白，人們已經知道它是固定氮和營養物的來源，是一種抗氧化劑，還具有許多其它作用，包 括膜穩定化。因此，本發明地基本上無蛋白質的培養基用其它培養基組分代替白蛋白，這些 組分可以在培養中單獨地或組合地發揮白蛋白的功能。用於這些目的的單個胚胎培養培養 基組分包括胺基酸(包括但不僅限於丙氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯 胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、牛磺酸、蘇氨酸、色氨 酸、酪氨酸、纈氨酸、絲氨酸)、抗氧化劑和螯合劑(例如EDTA、還原性穀胱甘肽、生育酚)、替 代能量源(例如果糖、穀氨醯胺、丙酮酸鈉)、滲透質(包括甘露醇和肌醇)、維生素(抗壞 血酸、氰鈷維生素、葉酸、生育酚等)和元素鐵。各個組分的支持最高卵泡發育的濃度被認為是最佳的。在本發明的研發過程 中製備了三種培養基(ART-1、ART-2和ART-3)。本發明人先前描述了為了從培養培養基 ART-I (Ali，1997 ；Ali et al. ,2000)配製基本上無蛋白質培養基ART-7和ART_7b系列而進行的各種實驗。本發明，PFM-Il無蛋白質的培養基系列，是從培養基ART-3(Ali，1997 ；Ali et al.，2000)配製而得的。PFM-Il系列的各種培養基產品的最終配方在下面的表中列出。HEPES和碳酸氫鹽 在這些培養基製備物中的濃度有不同，本文對此進行了說明。本發明的基本上無蛋白質培養基包括礦物鹽、胺基酸、抗氧化劑、抗生素、能量組 分和緩衝劑組分(HEPES和碳酸氫鹽，用於在補充CO2的條件下溫育)，它們與市售的含蛋白 質的培養基相似，但細節上不同。本發明的基本上無蛋白質的培養基獨特地包含大分子物 質(甲基纖維素和相關聚合物)，和任選的非代謝性糖醇(D-甘露醇)。構成本發明基本上無蛋白質的培養基的大分子是具有化學式I的甲基纖維素
權利要求
一種用於人類生殖細胞的基本上無蛋白質的細胞培養基，其適用於供體外受精和其它輔助生殖技術用的人類生殖細胞的體外處理的全過程中，該培養基包含礦物鹽、胺基酸、抗氧化劑、維生素、營養物、抗生素、D 甘露醇，和分子量為14,000道爾頓的甲基纖維素。
2.根據權利要求1的基本上無蛋白質的培養基，其中所述甲基纖維素具有這樣的特 徵，使得2%溶液在25°C具有15釐泊的粘度。
3.其中每一個R獨立地為H或CH3，n是數值為大約34-大約43的整數，並且其中甲氧基 取代以重量計為27. 5% -31. 5%。
4.根據權利要求4的基本上無蛋白質的培養基，其中在化學式I的化合物的每個糖模 塊上搭接的CH3取代基的平均數目為1.5-1.9。
5.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中所述甲基纖維素在溶液 中以0. 01g/L(0. 71微摩爾)-0. 5g/L(0. 036mM)的濃度存在。
6.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中所述甲基纖維素在溶液 中的存在濃度為 0. 01g/L(0. 71 微摩爾)-0. 15g/L(0. OOOllmM)。
7.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中所述甲基纖維素在溶液 中以大約0. Ig/L(0. 007ImM)的濃度存在。
8.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中所述胺基酸是L-精氨 酸、L-胱氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、 L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-牛磺酸、L-穀氨酸、L-穀氨醯 胺或甘氨酸，或其任意組合。
9.根據權利要求8的基本上無蛋白質的培養基，其中胺基酸的存在濃度為L-精氨酸 HC1，大約 0. 018mM-大約 0. 18mM ；L-胱氨酸.2HC1，大約 0. 0025mM-大約 0. 025mM ；L-組氨 酸HC1. H20,大約0. 005mM-大約0. 05mM ；L-異亮氨酸，大約0. OlmM-大約0. ImM ；L-亮氨 酸，大約0. OlmM-大約0. ImM ；L-賴氨酸.HC1，大約0. 0125mM-大約0. 125mM ；L-甲硫氨酸， 大約0. 0025mM-大約0. 025mM ；L-苯丙氨酸，大約0. 005mM-大約0. 05mM ；L-蘇氨酸，大約 0. OlmM-大約 0. ImM ；L-色氨酸，大約 0. 00125mM-大約 0. 0125mM ；L-酪氨酸.2Na2H20,大約 0. 005mM-大約0. 05mM ；L-纈氨酸，大約0. OlmM-大約0. ImM ；L-丙氨酸，大約1. OmM-大約 10mM ；L-牛磺酸，大約1. OmM-大約30mM ；穀氨酸，大約0. OlmM-大約1. OmM ；L-穀氨醯胺， 大約1. OmM-大約50mM ；或者L-甘氨酸，大約0. ImM-大約1. OmM。
10.根據權利要求9的基本上無蛋白質的培養基，其中胺基酸的存在濃度為0.5mM L_精氨酸；0. OlmM L-胱氨酸.2HC1 ；0. 02mM L-組氨酸；0. 04mM L-異亮氨酸；0. 04mM L-亮 氨酸；0. 05mM L-賴氨酸*HC1 ；0. OlmM L-甲硫氨酸；0. 02mM L-苯丙氨酸；0. 04mM L-蘇氨酸；0. 005mM L-色氨酸；0. 02mM L-酪氨酸.2Na2H20 ；0. 04mM L-纈氨酸；0. 5mM L-丙氨酸； 20mML-牛磺酸；0. 5mM L-穀氨酸；和20mM L-穀氨醯胺或者0. 25mM L-甘氨酸。
11.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中構成該培養基的礦物鹽 是氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉和磷酸鈉。
12.根據權利要求11的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的礦物鹽 的存在濃度為大約 3. 0mM(0. 23g/L)-3. 6mM(0. 27g/L)氯化鈣；大約 0. 7mM(0. 086g/ L) _ 大約 0. 81mM(0. 098g/L)硫酸鎂；大約 4. 7mM(0. 35g/L)-大約 5. 4mM(0. 4g/L)氯化 鉀；大約 0. 1M(6. 12g/L)_ 大約 0. 12M(6. 95g/L)氯化鈉和大約 0. 89mM(0. 107g/L)-大約 1. 0mM(0. 122g/L)磷酸二氫鈉。
13.根據權利要求12的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的礦物鹽的 存在濃度為3. lmM(0. 235g/L)氯化鈣；0. 72mM(0. 087g/L)硫酸鎂；4. 8mM(0. 355g/L)氯化 鉀；0. 11M(6. 171g/L)氯化鈉；和 0. 88mM(0. 108g/L)磷酸二氫鈉。
14.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的維生 素是氯化膽鹼、肌醇、煙醯胺、D-泛酸、吡哆醇HC1、核黃素、硫胺HC1、葉酸、維生素B12、維生 素E，或其任意組合。
15.根據權利要求14的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的維 生素的存在濃度為大約0. 004mM(0. 0005g/L) -0. 005mM(0. 0007g/L)氯化膽鹼；大 約 0. 0024mM(0. 0006g/L)-0. 0028(0. 0007g/L)D-生物素；大約 0. 0067mM(0. 0012g/ L)-0. 0078mM(0. 0014g/L)肌醇；大約 0. 005mM (0. 0006g/L)-0. 0057mM (0. 0007g/ L)煙醯胺；大約 0. 0025mM(0. 0005g/L)-0. 003mM(0. 0007g/L)D-泛酸；大約 0. 003(0. 0006g/L)mM-0. 0034mM(0. 0007g/L)卩比哆醇 HC1 ；大約 0. 00016mM(0. 00006g/ L) -0. 00019mM(0. 00007g/L)核黃素；大約 0. 0018mM(0. 0005g/L)-0. 0021mM(0. 0006g/ L)硫胺 HC1 ；大約 0. 0014mM(0. 006g/L)-0. 0016mM(0. 0007g/L)葉酸；大約 443pM(600ng/ L)-885pM(l. 2mg/L)維生素 B12 ；和 0. 008mM(0. 003g/L)-0. 012mM(0. 005g/L)維生素 E。
16.根據權利要求15的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的維生 素的存在濃度為0. 004mM(0. 0005g/L)氯化膽鹼；0. 0024mM(0. 0006g/L)D_生物素； 0. 0067mM(0. 0012g/L)肌醇；0. 005mM(0. 0006g/L)煙醯胺；0. 0025mM(0. 0005g/L) D-泛酸； 0. 003(0. 0006g/L)吡哆醇 HC1 ；0. 00016mM(0. 00006g/L)核黃素；0. 0018mM(0. 0005g/L)硫 胺 HC1 ；0. 0014mM(0. 006g/L)葉酸；616pM(800ng/L)維生素 B12 ；和 0. 010mM(0. 004g/L)維 生素E。
17.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的營養 物是D-葡萄糖、丙酮酸鹽(或酯)、果糖、乳酸，或其任意組合。
18.根據權利要求17的基本上無蛋白質的培養基，其中構成所述培養基的營養物的存 在濃度為 4. 3mM(0. 78g/L)D-葡萄糖；0. 3mM(0. 02975g/L)丙酮酸鈉；5. lmM(0. 92g/L)果糖 和 10mM(l. 13g/L)乳酸鈉。
19.根據權利要求18的基本上無蛋白質的培養基，其中D-葡萄糖的存在濃度為 3. 0mM(0. 75g/L)-5. 6mM(l. Og/L)。
20.根據權利要求19的基本上無蛋白質的培養基，其中果糖的存在濃度為lmM(0.18g/ L)-5. 6mM(l. Olg/L)。
21.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中溶液中的抗氧化劑是谷 胱甘肽。
22.根據權利要求21的基本上無蛋白質的培養基，其中穀胱甘肽的濃度為大約 0. 25mM(0. 077g/L) -0. 35mM(0. llg/L)。
23.根據權利要求22的基本上無蛋白質的培養基，其中穀胱甘肽的濃度為 0. 3mM(0. 092g/L)。
24.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，進一步包含EDTA。
25.根據權利要求24的基本上無蛋白質的培養基，其中EDTA的濃度為大約 0. lmM(0. 0416g/L)-0. 103mM(0. 043g/L)。
26.根據權利要求25的基本上無蛋白質的培養基，其中EDTA的濃度為 0. lmM(0. 0418g/L)。
27.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，進一步包含HEPES。
28.根據權利要求27的基本上無蛋白質的培養基，其中HEPES的濃度為15mM(3.6g/L) 或 25mM(5. 96g/L)，並且 D-葡萄糖的濃度為大約 3. 3mM(0. 59g/L)_ 大約 3. 6mM(0. 65g/L)。
29.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，進一步包括酚紅或其它pH 指示劑。
30.根據權利要求29的基本上無蛋白質的培養基，其中酚紅的濃度為0.031mM(0. 011g/L)。
31.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中溶液中存在濃度為大約1.5mg/L-大約4mg/L的硫酸慶大黴素。
32.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中存在濃度為75mg/L的青毒素G。
33.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，其中存在濃度為大約0.056 微摩爾_大約6. 9微摩爾的D-甘露醇。
34.根據權利要求33的基本上無蛋白質的培養基，其中存在濃度為2.8微摩爾的D-甘露醇。
35.根據權利要求1、2、3或4的基本上無蛋白質的培養基，進一步包含碳酸氫鈉。
36.根據權利要求35的基本上無蛋白質的培養基，其中碳酸氫鈉的存在濃度為 26. 2mM(2. 2g/L)。
37.根據權利要求36的基本上無蛋白質的培養基，其中碳酸氫鈉的存在濃度為 4. 0mM(0. 336g/L) -26. 2mM(2. 2g/L)。
38.培養基在輔助生殖技術中的應用，包括使用權利要求36的基本上無蛋白質的培養 基處理人生殖細胞的步驟。
39.根據權利要求38的培養基在輔助生殖技術中的應用，其中所述基本上無蛋白質的 培養基是權利要求36的培養基。
40.根據權利要求38的培養基在輔助生殖技術中的應用，其中所述人類生殖細胞是未 受精卵。
41.根據權利要求38的培養基在輔助生殖技術中的應用，其中所述人類生殖細胞是多 個精子。
42.根據權利要求38的培養基在輔助生殖技術中的應用，其中所述人類生殖細胞是受 精卵。
43.根據權利要求38的培養基在輔助生殖技術中的應用，其中該培養基專門用於子宮 內授精。
44.根據權利要求1的用於人類生殖細胞的基本上無蛋白質的細胞培養基，其是從礦 物鹽、胺基酸、抗氧化劑、維生素、營養物、抗生素、D-甘露醇和分子量為14，000道爾頓的甲 基纖維素的至少一種或多種儲液製備的，其中將所述儲液用水稀釋以形成基本上無蛋白質 的細胞培養基。
45.一種用於人類生殖細胞的基本上無蛋白質的細胞培養基，其適用於供體外受精 和其它輔助生殖技術用的人類生殖細胞的體外處理的全過程中，所述培養基包含0. 5mM L_ 精氨酸；0. OlmM L-胱氨酸.2HC1 ;0. 02mM L-組氨酸，0. 04mM L-異亮氨酸；0. 04mM L_亮氨酸；0. 05mM L-賴氨酸.HC1 ;0. OlmM L-甲硫氨酸；0. 02mM L_苯丙氨酸；0. 04mM L_ 蘇氨酸；0. 005mM L_ 色氨酸；0. 02mM L_ 酪氨酸.2Na2H20 ;0. 04mM L_ 纈氨酸；0. 5mM L_丙氨酸；20mM L-牛磺酸；0. 5mM穀氨酸(0. 39mM) ；20mM L_穀氨醯胺或0. 25mML_甘 氨酸；3. lmM(0. 235g/L)氯化鈣；0. 72mM(0. 087g/L)硫酸鎂；4. 8mM(0. 355g/L)氯化鉀； 0. 11M(6. 171g/L)氯化鈉；0. 88mM(0. 108g/L)磷酸二氫鈉；0. 004mM(0. 0005g/L)氯化膽鹼； 0. 0024mM(0. 0006g/L)D-生物素；0. 0067mM(0. 0012g/L)肌醇；0. 005mM(0. 0006g/L)煙醯 胺；0. 0025mM(0. 0005g/L)D-泛酸；0. 003(0. 0006g/L)吡哆醇 HC1 ；0. 00016mM(0. 00006g/ L)核黃素；0. 0018mM(0. 0005g/L)硫胺素 HC1 ；0. 0014mM(0. 006g/L)葉酸；616pM(800ng/L) 維生素 B12 ；0. 010mM(0. 004g/L)維生素 E ；4. 3mM(0. 78g/L)D-葡萄糖；0. 3mM(0. 02975g/ L)丙酮酸鈉；5. lmM(0. 92g/L)果糖；10mM(l. 13g/L)乳酸鈉；0. 3mM(0. 092g/L)穀胱甘肽； 0. lmM(0. 0418g/L)EDTA ；0. 031mM(0. Ollg/L)酚紅；2. 8 微摩爾 D-甘露醇；26. 2mM(2. 2g/L) 碳酸氫鈉；75mg/L青黴素G ；和1. 5mg/L硫酸慶大黴素。
46.權利要求45的基本上無蛋白質的細胞培養基，其中硫酸慶大黴素的濃度為4mg/L。
47.權利要求45的基本上無蛋白質的細胞培養基，其中D-葡萄糖的濃度為 3. 3mM(0. 59g/L)-大約 3. 6mM(0. 65g/L)，並進一步包含 15mM(3. 6g/L)HEPES。
48.權利要求45的基本上無蛋白質的細胞培養基，其中D-葡萄糖的濃度為 3. 3mM(0. 59g/L)-大約 3. 6mM(0. 65g/L)，並進一步包含 25mM(5. 96g/L)HEPES。
49.權利要求46的基本上無蛋白質的細胞培養基，其中D-葡萄糖的濃度為 3. 3mM(0. 59g/L)-大約 3. 6mM(0. 65g/L)，並進一步包含 15mM(3. 6g/L)HEPES。
50.權利要求46的基本上無蛋白質的細胞培養基，其中D-葡萄糖的濃度為 3. 3mM(0. 59g/L)-大約 3. 6mM(0. 65g/L)，並進一步包含 25mM(5. 96g/L)HEPES。全文摘要
本發明公開一種用於輔助生殖技術(assisted reproductive technologies)的含14kDa甲基纖維素的基本上無蛋白質的細胞培養基。
文檔編號C12N5/075GK101945992SQ200880127343
公開日2011年1月12日 申請日期2008年12月19日 優先權日2007年12月21日
發明者賈法·阿里賓M·阿布杜拉 申請人:賈法·阿里賓M·阿布杜拉