同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的方法
2023-07-15 00:32:51 2
專利名稱：同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的方法
技術領域：
本發明屬於天然產物分析技術領域，尤其涉及一種同步檢測啤酒花中黃腐酚、異 黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的方法。
背景技術：
啤酒花(Humulus lupulus L.)是桑科律草屬的多年生草本植物，它是啤酒釀造中 的重要原料之一，能夠賦予啤酒特有的芳香與爽口的苦味，維持啤酒泡沫的穩定性並且具 有一定防腐能力。啤酒花中含有豐富的黃酮類物質，其中，黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基 柚皮素因其具有良好的生物活性而受到越來越多關注。黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚 皮素的結構式分別如下所示 黃腐酚 異黃腐酚 8-異戊烯基柚皮素黃腐酚(Xanthohumol，簡稱XN)是啤酒花中特有的異戊烯基黃酮，其含量為啤酒 花乾重的0.1 1%。目前研究表明啤酒是人體攝入黃腐酚的唯一途徑。黃腐酚具有良好 的生理活性，是一種良好的癌症預防劑，它可以通過抑制致癌前體物質的代謝來阻止癌細 胞在早期的生長，從而起到有效預防癌症的作用。此外，黃腐酚在抗氧化方面，預防、治療糖 尿病方面以及抗病毒方面均有一定的功效。異黃腐酚(Isoxanthohumol，簡稱IXN)是黃腐酚在加熱過程中產生的一種同分異 構體。在啤酒釀造的麥汁煮沸過程中，大部分黃腐酚會被異構化為異黃腐酚，因此啤酒中異 黃腐酚含量遠高於黃腐酚，雖然異黃腐酚的生理活性沒有黃腐酚那麼強，但在體外實驗中 它也顯示出了預防癌症等積極的效果。8-異戊烯基柚皮素(8-prenylnaringenin，簡稱8-PN)是異黃腐酚脫甲基後的衍 生物，被認為是目前最有效的植物雌性激素，可以有效預防骨質疏鬆、乳腺癌，且可以延緩 更年期。8-異戊烯基柚皮素現已逐步作為天然激素被人們認可，並被認為是激素代替療法 的未來替代品。目前國內關於這三種黃酮類物質的同步檢測方法研究甚少，王寧等公開了一種用 RP-HPLC方法測定啤酒花中黃腐酚的方法(RP-HPLC法測定啤酒花中的黃腐酚；《食品工業 科技》，2009年05期)，該方法較好地解決了黃腐酚的檢測問題，但對於啤酒花中另兩種重 要的物質並未進行深入研究。同樣，公開號為CN101337876A的中國專利申請中也只公開了黃腐酚的檢測方法，對另兩種物質的檢測未有涉及。
發明內容
本發明提供了一種利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同步檢測啤酒花中黃腐 酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的方法，該方法的精密度高，操作簡單。一種同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的方法，包括步 驟(1)待測樣品的預處理用有機溶劑提取含啤酒花的待測樣品，過濾，所得濾液用 有機溶劑定容，獲得樣品待測液；(2)RP-HPLC_紫外檢測採用反相碳十八色譜柱和紫外可見分光檢測器，流動相 為乙腈和水相的混合溶液，流速為0. 7ml/min 1. Oml/min，採用梯度洗脫，在雙檢測波長 350nm 390nm和260nm 290nm分析樣品待測液，得到樣品待測液的色譜圖；所述的水相為甲酸質量百分比濃度為0. 5% 1. 5%的甲酸水溶液；(3)將樣品待測液的色譜圖上的峰面積在標準工作曲線上回歸，計算樣品待測液 中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的含量。步驟(1)中，所述的有機溶劑選用本領域對黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮 素具有很好的溶解性且不與黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素進行化學反應的有機 溶劑，優選乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷或者正丁醇中的一種。步驟(1)中，所述的含啤酒花的待測樣品可選自啤酒花粉末(即啤酒花顆粒經研 磨過篩而得到的粉末)、啤酒花的乙醇浸膏、啤酒花的co2萃取浸膏等市售產品中的一種。為了提高提取的效率及效果，所述啤酒花粉末粒徑優選小於60目。步驟(1)中，所述的提取條件優選為在功率為300W 450W超聲條件下於30°C 45°C回流提取20min 60min，該提取條件可以更好地提取出啤酒花中所含的黃腐酚、異黃 腐酚和8-異戊烯基柚皮素。步驟⑴中，有機溶劑與含啤酒花的待測樣品的質量比優選為10 15 1，以保 證在提高提取效果的前提下節約資源。由於黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素這三種待測物質的極性相當，為了能 夠使上述三種待測物質充分的質子化，從而在流動相梯度洗脫條件下取得較好的分離效 果，本發明特定選用甲酸質量百分比濃度為0.5% 1.5%的甲酸水溶液作為流動相中的 水相，為了取得最佳的的分離效果，優選甲酸質量百分比濃度為的甲酸水溶液作為流動
相水相。
步驟(2)中，所述的梯度洗脫條件優選為
洗脫時間乙腈在流動相中的體積百分含量
Omin40%
20min100%
25min100%
28min40%。
由於黃腐酚在350nm 390nm波長吸收較好，而在260nm
低，而異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素均在260nm 290nm波長吸收較好，在350nm 390nm
4波長几乎沒有吸收，因此為了提高檢測方法對黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素檢測 的靈敏度，在本發明方法步驟(2)中採用雙檢測波長350nm 390nm和260nm 290nm進 行檢測，優選雙檢測波長為370nm和288nm。為了得到黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素色譜峰的最佳峰形，所述的流速 優選為 0. 8ml/min。所述的RP-HPLC-紫外檢測的柱溫為25°C 30°C，優選30°C。本發明具有如下有益效果(1)本發明採用了特定的RP-HPLC-紫外檢測條件，實現了啤酒花中黃腐酚、異黃 腐酚、8-異戊烯基柚皮素的精確分離和含量測定。
(2)利用本發明方法對黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的混合標準品溶液 進行檢測，並採用外標法獲得標準工作曲線(即以標準品溶液中黃腐酚、異黃腐酚或8-異 戊烯基柚皮素的濃度對峰面積作線性回歸所得的線性方程)，黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊 烯基柚皮素與峰面積間的相關係數R2均大於0. 998 ；對同一待測樣品進行多次測定得到 本發明方法的精密度RSD < ；利用標準物質加入法測定本發明方法的回收率在93% 106%，由此可見本發明方法具有很高的精度。
圖1為實施例1中黃腐酚濃度為40mg/L、異黃腐酚濃度為10mg/L且8_異戊烯基 柚皮素濃度為10mg/L的混合標準待試液在370nm檢測波長和288nm檢測波長的高效液相 色譜圖；縱坐標峰吸收強度，橫坐標保留時間(分鐘)；圖2為實施例1中啤酒花提取物樣品在370nm檢測波長和288nm檢測波長的高效 液相色譜圖；縱坐標峰吸收強度，橫坐標保留時間(分鐘)。
具體實施例方式實施例1分析方法及標準工作曲線的建立採用的高效液相色譜儀及螢光檢測器WaterS2695高效液相色譜儀，Waters996 紫外檢測器(美國Waters公司)。RP-HPLC-紫外檢測條件反相碳十八色譜柱(250 X 4. 6mm, 4 μ m),檢測溫度30°C， 進樣量10 μ L，檢測波長分別為288nm和370nm，流速0. 8ml/min，流動相為乙腈和甲酸質量 百分比濃度為的甲酸水溶液(即甲酸水溶液)，梯度洗脫程序如表1 表 1 採用的相關試劑如下黃腐酚標準品、異黃腐酚標準品和8-異戊烯基柚皮素標準品(均購於sigma公 司，純度>98%)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，高純水，其餘試劑均為分析純。標準儲備液和標準待試液的配製分別準確稱取0. Smg黃腐酚標準品、Img異黃腐酚標準品和8_異戊烯基柚皮素標 準品於3個IOmL的容量瓶中，分別加適量色譜純甲醇溶解後，用色譜純甲醇定容至10mL，分 別得到濃度為80mg/L的黃腐酚標準儲備液、濃度為100mg/L的異黃腐酚標準儲備液以及濃 度為100mg/L的8-異戊烯基柚皮素標準儲備液。標準待試液由上述三種標準儲備液分別用甲醇依次稀釋一定倍數後得到。將濃度為80mg/L的黃腐酚標準儲備液用甲醇依次稀釋一定倍數後得到濃度分別 為80mg/L、20mg/L、4mg/L、0. 4mg/L的黃腐酚標準待試液，用於建立標準工作曲線。將濃度為100mg/L的異黃腐酚標準儲備液用甲醇依次稀釋一定倍數後得到濃度 分別為10mg/L、5mg/L、lmg/L、0. 5mg/L的異黃腐酚標準待試液，用於建立標準工作曲線。將濃度為100mg/L的8_異戊烯基柚皮素標準儲備液用甲醇依次稀釋一定倍數後 得到濃度分別為lmg/L、0. 5mg/L、0. 3mg/L、0. 2mg/L的8-異戊烯基柚皮素標準待試液，用於 建立標準工作曲線。樣品待試液的製備待測樣品的預處理準確稱取粒徑小於60目的啤酒花粉末3g，用45mL甲醇在 400W超聲功率的超聲波中於40°C回流提取30min。提取結束後進行過濾，濾液用甲醇定容 至IOOmL,製得樣品待試液。RP-HPLC-紫外檢測將上述各濃度的標準待試液經0. 22 μ m濾膜過濾後進行RP-HPLC-紫外檢測，得到 各濃度的標準待試液的色譜圖，記錄各標準待試液的峰面積，分別以標準待試液中黃腐酚 的濃度(C)、異黃腐酚的濃度(C)或8-異戊烯基柚皮素的濃度(C)對標準待試液中黃腐酚 的峰面積(A)、異黃腐酚的峰面積(A)或8-異戊烯基柚皮素的峰面積(A)作線性回歸，分別 繪製標準工作曲線，得到峰面積與濃度(即含量)之間的關係曲線，並對該檢測方法進行線 性關係考察、精密度考察與回收率考察，結果見表2，表3和表4。表2檢測方法線性關係考察 從表中數據可知，黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素這三種物質的線性相關 係數R2都很高，說明在線性範圍中這三種待測物與峰面積之間線性關係良好。配製濃度為5mg/L異黃腐酚標準待試液、濃度為10mg/L8_異戊烯基柚皮素標準待 試液以及濃度為4mg/L黃腐酚標準待試液，分別連續進行6次重複測定，對保留時間和峰面 積精密度進行考察，數據如表2 表3方法精密度考察 從上表中可以看出無論是保留時間還是峰面積，相對標準偏差RSD均小於1 %，精 密度高，說明該方法可以精確測定黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素。回收率試驗通過向啤酒花粉末中添加黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素標 準品，並按樣品待試液的製備方法進行製備，進行RP-HPLC-紫外檢測分析，測定被加入標 準品的回收量，計算回收率，結果見表4。表4方法回收率考察 結果顯示，黃腐酚、異黃腐酚和8_異戊烯基柚皮素這三種物質的回收率在93%-106. 33%，表明該方法可以用於準確測定啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基 柚皮素的含量。配製黃腐酚濃度為40mg/L、異黃腐酚濃度為10mg/L且8_異戊烯基柚皮素濃度為 10mg/L的混合標準待試液，進行RP-HPLC-紫外檢測分析，其在370nm和288nm雙檢測波長 的高效液相色譜圖見圖1，圖1中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的保留時間與黃腐 酚標準待試液中黃腐酚的保留時間、異黃腐酚標準待試液中異黃腐酚的保留時間和8-異 戊烯基柚皮素標準待試液中8-異戊烯基柚皮素的的保留時間差別不大，說明本發明方法 可以同時檢測黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素。樣品待試液中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的同步檢測樣品待試液經0. 22 P m微孔膜過濾後進行RP-HPLC-紫外檢測，得到樣品待試液的 色譜圖，如圖2所示，記錄樣品待試液中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的峰面積， 根據表2中異黃腐酚的線性方程A = 35494c-5034. 7，8-異戊烯基柚皮素的線性方程A = 25811c+889. 34，黃腐酚的線性方程A = 118969c_76223計算得到啤酒花粉末中異黃腐酚、 8-異戊烯基柚皮素和黃腐酚的含量，結果見表5。實施例2 6不同溶劑啤酒花提取物中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素含
量除了分別用乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇替代甲醇作為有機溶劑，其 餘操作均同實施例1，同步檢測啤酒花粉末中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的含 量，結果如表5所示。表5採用不同有機溶劑提取啤酒花粉末檢測的黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚 皮素含量 注「_」表示未檢測到。
權利要求
一種同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的方法，包括步驟(1)待測樣品的預處理用有機溶劑提取含啤酒花的待測樣品，過濾，所得濾液用有機溶劑定容，獲得樣品待測液；(2)RP-HPLC-紫外檢測採用反相碳十八色譜柱和紫外可見分光檢測器，流動相為乙腈和水相的混合溶液，流速為0.7ml/min～1ml/min，採用梯度洗脫，在雙檢測波長350nm～390nm和260nm～290nm分析樣品待測液，得到樣品待測液的色譜圖；所述的水相為甲酸質量百分比濃度為0.5％～1.5％的甲酸水溶液；(3)將樣品待測液的色譜圖上的峰面積在標準工作曲線上回歸，計算樣品待測液中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的含量。
2.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己 烷或者正丁醇中的一種。
3.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述的含啤酒花的待測樣品選自啤酒花粉末、啤酒花的乙 醇浸膏、啤酒花的C02萃取浸膏中的一種。
4.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素 的方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述的提取條件為在功率為300W 450W超聲條件下於 30°C 45°C 回流提取 20min 60min。
5.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於，步驟(1)中，有機溶劑與含啤酒花的待測樣品的質量比為10 15 1。
6.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的水相選自甲酸質量百分比濃度為的甲酸水溶液。
7.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的梯度洗脫條件為洗脫時間 乙腈在流動相中的體積百分含量Omin40%20min100%25min100%28min40%。
8.根據權利要求6所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的雙檢測波長為370nm和288nm。
9.根據權利要求1所述的同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的 方法，其特徵在於所述的流速為0. Sml/min。
全文摘要
本發明公開了一種同步檢測啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素方法，包括用有機溶劑提取含啤酒花的待測樣品，過濾，所得濾液用有機溶劑定容，獲得樣品待測液；採用反相碳十八色譜柱和紫外可見分光檢測器，流動相為乙腈和水相的混合溶液，流速為0.7ml/min～1ml/min，採用梯度洗脫，在雙檢測波長350nm～390nm和260nm～290nm分析樣品待測液，得到樣品待測液的色譜圖；所述的水相為甲酸質量百分比濃度為0.5％～1.5％的甲酸水溶液；將樣品待測液的色譜圖上的峰面積在標準工作曲線上回歸，計算含啤酒花的待測樣品中黃腐酚、異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的含量。該方法的精密度高，操作簡單。
文檔編號G01N30/89GK101871924SQ20101018767
公開日2010年10月27日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者何國慶, 傅明亮, 劉婧, 劉曉傑, 陳啟和 申請人:浙江大學