一種用於基因治療的超分子納米組裝體及其製備方法
2023-07-15 01:20:21
一種用於基因治療的超分子納米組裝體及其製備方法
【專利摘要】一種用於基因治療的超分子納米組裝體，其構築單元以環糊精修飾的金納米粒子為主體，蒽修飾的金剛烷為客體，通過主-客體包結作用構築超分子組裝體；其製備方法是：1）製備金納米粒子；2）製備N-（9-甲蒽基）-N'-金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺；3）將上述製得的金納米粒子與N-（9-甲蒽基）-N'-金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺溶解入水中，均勻混合後即可製得溶液態超分子納米組裝體。本發明的優點是：該超分子納米組裝體能夠有效地誘導DNA凝聚，其凝聚能力可以很方便地通過控制主客體投入比來調節，在基因治療領域有著廣泛的應用前景；其製備方法簡單，組分間具有較強的鍵合能力，為基因治療提供了一種新的製備基因載體的方法。
【專利說明】一種用於基因治療的超分子納米組裝體及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於納米超分子材料【技術領域】，特別是一種用於基因治療的超分子納米組裝體及其製備方法。
【背景技術】[0002]基因治療(Gene Therapy)是利用基因(DNA或RNA)作為藥物的一種疾病治療方法。從1990年美國NIH臨床中心第一次採用基因治療成功治癒腺苷脫氨酶(ADA)基因缺陷症開始，基因治療在二十多年中得到了快速的發展，很多基因治療方案也已經進入臨床試驗階段。考慮到裸露的基因很難被生物細胞吞噬，且很容易被體內的核酸酶所降解，因此尋找穩定、高效和安全的基因載體就成為科學家研究的重點，參見I) Niven，R.; Pearlman,R.; Wedekingj T.; Mackeiganj J.; Nokerj P.; Simpson-Herrenj L ; Smith, J.G.J.Pharm.ScL 1998，87，1292-9 ；2) Ortiz Melletj C.; Garcia Fernandez, J.M.;Benito, J.M.Chem.Soc.Re.2011, 40，1586-608。到目前為止，很多種生物分子，諸如病毒、脂質體、樹枝狀高聚物和無機金屬納米粒子等，已經被作為基因載體用於基因治療，參見 I) Tanaka，T.; Caoj Y.; Folkmanj J.; Fine, H.A.Cancer Res.1998，58，3362-3369 ；2) Ooyaj T.; Choi, H.S.; Yamashitaj A.; Yuij N.; Sugayaj Y.; Kano,A.; Maruyamaj A.; Akita, H.; Itoj R.; Kogurej K.; Harashimaj H.J.Am.Chem.Soc.2006，128，3852-3 ；3) Haenslerj J.; Szoka Jr., F.C.Bioconjugate Chem.1993，4，372-379 ；4) Wang, H.; Chen, Y.; Li, X.-Y.; Liuj Y.MoL Pharm.2007，4，189-198。其中，金納米粒子(Gold Nanoparticle)因其高比表面、穩定低毒、易於製備和較高的藥物傳遞能力等獨特的化學物理性質，受到越來越廣泛的關注，參見I) Connor,E.E.; Mwamukaj J.; Golej A.; Murphy, C.J.; Wyatt, M.D.Small (Veinheim ander Bergstrasse， Germany) 2005, 1，325-327 ；2) Shenoyj D.; Little, S.; LangerjR.; Amiji，M.MoL Pharm.2005，2，357-366 ;3)Sahoo，S.K.; Labhasetwarj V.MoLPharm.2005，2，373-383。Rotello等人報導了季銨陽離子配體修飾的金納米粒子能夠通過電荷吸引與DNA骨架發生相互作用，參見Han，G.; Martin, C.T.; Rotello，V.Μ.Chem.Bi0.Drug Des.2006, 67，78_82。隨後，Klibanov課題組證明，樹枝狀聚乙烯亞胺(PEI)修飾的金納米粒子與未修飾的PEI相比，其轉染效率提高了 12倍，參見Thomas，Μ.;Klibanovj A.M.Proc.NatL Acad.Sc!.1/SA2003, 100，9138-9143。Rotello 等人進一步利用鄰硝基苄基脂作為連接基團，將一種季銨鹽修飾到金納米粒子上，得到了一種光誘導釋放的 DNA 納米載體，參見 Han，G.; You, C._C.; Kimj B.-J.; Turinganj R.S.;Forbes, N.S.; Martin, C.T.; Rotello, V.M.Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.2006，45，3165-3169。儘管金納米粒子作為基因載體已經被廣泛的研究，但目前主要通過共價修飾的方法，將功能基因連接到金納米粒子上。這樣就存在合成過程複雜，難以獲得具有複雜功能的納米材料等缺點。另一方面，不同於傳統的共價化學，主要研究分子弱相互作用如範德華力、靜電作用、堆積和疏水相互作用等的超分子化學方法，可以利用分子組裝得到具有多組份複雜結構的超分子聚集體，實現一些共價化學難以解決的問題。
[0003]另一方面，在超分子化學研究中，環糊精(Cyclodextrin)是一類非常重要的主體化合物。環糊精是由D- (+)-吡喃葡萄糖單元通過I，4-糖苷鍵首尾相連形成的大環化合物。習慣上用小寫希臘字母來表示環糊精中葡萄糖單元的個數，最常見的如α-，β-和Υ-環糊精分別含有6，7和8個葡萄糖單元。環糊精疏水空腔深度約為7.0Α，α-，β-和Υ-環糊精的空腔內徑分別為4.5A、7.0A和8.5Α。由於具有疏水的空腔和親水的外表面，而且具有手性的微環境，環糊精可以選擇性地鍵合各種有機、無機以及生物分子形成主-客體包結配合物。同時，環糊精還具有良好的水溶性、生物相容性以及無毒等特點，使其越來越受到化學家和生物醫學領域專家的廣泛關注。在較早的研究中我們發現，環糊精修飾的金納米粒子能夠有效地凝聚DNA並將其傳遞到細胞中，參見Wang，H.; Chen, Y.; Li, X.-Y.;Liu, Y.MoL Pharm.2007, 4，189-198。含有芳香基團的基於環糊精的超分子組裝體也能夠有效地凝聚 DNA，參見 I) Liu, Y.; Yu, L.; Chen, Y.; Zhao, Y.-L.; Yang, H.J.Am.Chem.Soc.2007，129，10656-10657 ；2) Liu, Y.-P.; Yu, Z.-L.; Zhang, Y.-Μ.;Guo, D.-S.; Liu, Y.-P.J.Am.Chem.Soc.2008，130，10431-10439 ；3)Chen, Y.; Yu,L.; Feng, X.-Z.; Hou, S.; Liu, Y.Chem.Commun.2009, 4106-4108。這些發現促使我們設計和構築基於環糊精修飾金納米粒子和含芳香基團客體的超分子基因傳遞體系。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對上述技術分析，提供一種用於基因治療的超分子納米組裝體及其製備方法，該超分子納米組裝體基於環糊精修飾的金納米粒子和蒽修飾的金剛烷客體，能夠凝聚DNA，且其凝聚能力可以通過調節主客體比來調節。
[0005]本發明的技術方案:
一種用於基因治療的超分子納米組裝體，其構築單元以環糊精修飾的金納米粒子為主體，蒽修飾的金剛烷為客體，通 過主-客體包結作用構築超分子組裝體。
[0006]一種所述用於基因治療的超分子納米組裝體的製備方法，步驟如下:
1)在氬氣保護下，將溶有6-硫辛醯胺-6脫氧β-環糊精和硼氫化鈉的二甲基亞碸溶液和溶有氯金酸的二甲基亞碸溶液快速混合，室溫下避光攪拌24小時，然後加入乙腈使產品析出，離心分離固體並用二甲基亞碸和乙腈的混合溶液洗滌8-10次，在0.1MPa下真空乾燥後得到紅棕色金納米粒子固體；
2)將9-蒽醛和二乙烯三胺加入體積比為5:3的無水乙醇和二氯甲烷的混合溶劑中，室溫攪拌24小時後，加入硼氫化鈉，繼續攪拌8小時，減壓除去溶劑，殘留物用蒸餾水洗滌後用二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥後，減壓除去溶劑，0.1MPa下真空乾燥得到固體，將所得固體與1-金剛烷酸醯氯溶解於20 mL無水二氯甲烷中，然後加入三乙胺，氬氣保護下室溫攪拌8小時後，減壓除去溶劑，殘留物以體積比10:1的二氯甲烷和甲醇混合溶劑作為淋洗劑，採用矽膠薄層色譜法分離得到1.27克白色固體N- (9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺(An-Ad)產品；
3)將上述製得的紅棕色金納米粒子固體與N-(9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺溶解入水中，均勻混合後即可製得溶液態超分子納米組裝體。
[0007]所述6-硫辛醯胺-6脫氧β -環糊精、硼氫化鈉、氯金酸、二甲基亞碸和乙腈用量比為 lmmol:5mmol: IOOmmol:4.5L:4.5L。
[0008]所述混合溶液中二甲基亞碸與乙腈的體積比為1:1。
[0009]所述9-蒽醛、二乙烯三胺、無水乙醇和二氯甲烷的混合溶劑和硼氫化鈉的用量比為1.1克:2.7 mL:200 mL:1.9克；9-蒽醛、1-金剛烷酸醯氯、無水二氯甲烷和三乙胺的用量比為 1.1 克:1.0 克:20 mL:2.1 mL。
[0010]所述金納米粒子在水中的濃度為0.62 g/L, N- (9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺在水中的濃度為1Χ10-6-2Χ10-4 mol/L。
[0011]本發明的優點是:該超分子納米組裝體能夠有效地誘導DNA凝聚，其凝聚能力可以很方便地通過控制主客體投入比來調節，在基因治療領域有著廣泛的應用前景；其製備方法簡單，組分間具有較強的鍵合能力，為基因治療提供了一種新的製備基因載體的方法。
[0012]【【專利附圖】
【附圖說明】】
圖1為主體和客體的結構及超分子組裝體構築示意圖。
[0013]圖2為β -環糊精和N- (9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺客體鍵合行為的量熱滴定曲線。
[0014]圖3為環糊精修飾金納米粒子的透射電鏡圖。
[0015]圖4為超分子組裝體的透射電鏡圖。
[0016]圖5為超分子組裝體吸光度隨小牛胸腺DNA濃度變化曲線。
[0017]圖6為固定DNA濃度條件下，金納米粒子吸光度隨N- (9-甲蒽基)_Ν』_金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺客體濃度變化曲線。
[0018]圖7為不同主客體濃度下質粒DNA(pBR322)瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0019]圖8為超分子組裝體凝聚小牛胸腺DNA透射電鏡圖。
[0020]圖9為超分子組裝體凝聚小牛胸腺DNA原子力顯微鏡圖。
[0021]圖10為超分子組裝體對人乳腺癌細胞系-7 (MCF-7)細胞的3_ (4，5_ 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT)毒性實驗。
[0022]【【具體實施方式】】
實施例:
一種用於基因治療的超分子納米組裝體，其構築單元以環糊精修飾的金納米粒子為主體，蒽修飾的金剛烷為客體，通過主-客體包結作用構築超分子組裝體；其製備方法，步驟如下:
I)將20 mL溶有氯金酸(50.0 mg, 0.1 mmol)的二甲基亞碸溶液與20 mL溶有6-硫辛醯胺_6脫氧β-環糊精(20.0 mg, 0.02 mmol)和硼氫化鈉(75.5 mg, 2.0 mmol)的二甲基亞碸溶液快速混合，並在室溫下攪拌24小時。然後向反應混合物中加入40 mL乙腈，使產品沉出。將沉澱離心分離，並用100 mL體積比1:1的二甲基亞碸/乙腈的混合溶液洗滌8次。離心收集的產品用截留分子量為3500的透析袋對重蒸水透析數次，旋轉蒸發除去溶劑後，在80° C、0.1MPa條件下真空乾燥12小時，得到環糊修飾的金納米粒子(AuNP)。元素分析(％):C,10.10 ;H，2.73 ;N，0.30。原子發射光譜(ICP)測定Au含量(％):25.7。計算得金納米粒子中環糊精含量為0.162 mmol/go
[0023]2)將1.1克9-蒽醛和2.7 mL 二乙烯三胺溶解於125 mL無水乙醇和75 mL 二氯甲烷的混合溶劑中，室溫攪拌24小時後，加入1.9克硼氫化鈉，繼續攪拌8小時。減壓除去溶劑，殘留物用50 mL蒸餾水洗滌並用200 mL二氯甲烷萃取。有機相用無水硫酸鈉乾燥後，減壓除去溶劑，0.1MPa下真空乾燥。將所得固體與1.0克1-金剛烷醯氯及溶解於20 mL無水二氯甲烷中，然後加入2.1 mL三乙胺。氬氣保護下室溫攪拌8小時後，減壓除去溶劑，殘留物以體積比10:1的二氯甲烷/甲醇混合溶劑為淋洗劑，矽膠薄層色譜法分離得到1.27克白色固體N- (9-甲蒽基)-N』_金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺(An-Ad)產品(產率:55.7%)。
[0024]1H NMR (D2O, 400MHz): δ (ppm) = 1.47-1.72 (m, 12H), 1.84-1.93 (s, 3H),3.00-3.09 (t, 2H), 3.27-3.50 (m, 6H)，5.08-5.15 (s, 2H)，7.53-7.61 (t, 2H)，7.63-7.72 (t, 2H), 8.04-8.13 (d, 2H), 8.18-8.26 (d, 2H)，8.56-8.62 (s, 1H).13CNMR (D2O, 100MHz): δ (ppm) = 183.1, 130.9，130.2，129.5，127.7，125.5，122.7，47.7, 43.5, 40.4, 38.2, 36.2, 35.6, 27.5.高分辨質譜(MALDAI, m/z):理論值:[M+H]+ 456.3015,實驗值:456.3013.元素分析(%):理論值:C30H37N3O5H2O, C 66.03 ,H 8.68, N 7.70;實驗值:C 66.29，H 8.64, N 8.00。
[0025]3)將上述製得的6.20 mg金納米粒子分別和0.05 mg、0.46 mg、2.3 mg、4.6 mg和9.2 mg的N- (9-甲蒽基)-N』_金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺客體溶解於I mL水中並均勻混合，製得不同表面客體包結率的超分子組裝體。
[0026]圖1為主體和客體的結構及超分子組裝體構築示意圖。
[0027]圖2為β -環糊精和N- (9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺客體鍵合行為的量熱滴定曲線，圖中表明:β-環糊精和N- (9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺之間具有較高的鍵合常數，能夠在實驗條件下形成穩定的主-客體包合物。
[0028]圖3為環糊精修飾金納米粒子的透射電鏡圖，圖中表明:所製得的金納米粒子為平均粒徑3.3±0.5納米球形粒子。
[0029]圖4為超分子組裝體的透射電鏡圖，圖中表明:形成超分子組裝體後，金納米粒子乃能穩定存在，並且沒有觀察到明顯的聚集現象。
`[0030]該超分子組裝體凝聚DNA的實驗:
I)在水溶液中，固定超分子組裝體的濃度(0.62 g/L)，加入不同濃度的小牛胸腺DNA，測定溶液的吸光度，發現520 nm左右的金納米粒子的表面等離子共振(SPR)峰隨DNA濃度增加，出現紅移現象，證明金納米粒子發生的團聚，如圖5所示。
[0031]2)在水溶液中，固定小牛胸腺DNA(5X Kr5 mol/L)和環糊精修飾金納米粒子(0.62g/L)的濃度，加入不同濃度的客體，測定溶液的吸光度，發現520 nm左右的金納米粒子的表面等離子共振(SPR)峰隨客體濃度增加，出現紅移現象，證明組裝體對DNA的凝聚能力隨著表面客體包結率的增加而增大，如圖6所示。
[0032]3)固定質粒DNA CpBR 322)的濃度，加入不同濃度的金納米粒子、客體和組裝體溶液，進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。結果如圖7所示，其中帶I為單獨DNA (5Pg/L)，帶2為DNA(5Pg/L)和環糊精修飾金納米粒子CD-AuNP ([CD] = 0.90 μΜ)，帶3為DNA (5Pg/L)和客體An-Ad (0.90 μΜ)，帶 4-8 為 DNA (5Pg/L)與組裝體(濃度分別為:[CD] = [3] = 0.05 μΜ,0.10 μΜ, 0.30 μΜ, 0.50 μΜ, and 0.70 μΜ)。結果表面，隨著組裝體濃度的增大，DNA遷移率減小，在組裝體濃度超過0.30 μΜ後，部分DNA出現抓孔現象，如圖7所示。表明組裝體能有效地凝聚DNA。
[0033]4)通過透射電子顯微鏡表徵，證明組裝體能夠使小牛胸腺DNA凝聚成約40納米左右的聚集體，如圖8所示。
[0034]5)通過原子力顯微鏡表徵，證明裝體能夠使小牛胸腺DNA凝聚成約40納米左右的聚集體，如圖9所示。
[0035]6)通過3- (4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)細胞毒性實驗表明，在實驗濃度下，超分子組裝體對人乳腺癌細胞系-7 (MCF-7)細胞沒有顯示出明顯的毒性，如圖10所示。
【權利要求】
1.一種用於基因治療的超分子納米組裝體，其特徵在於:構築單元以環糊精修飾的金納米粒子為主體，蒽修飾的金剛烷為客體，通過主-客體包結作用構築超分子組裝體。
2.一種如權利要求1所述用於基因治療的超分子納米組裝體的製備方法，其特徵在於步驟如下: 1)在氬氣保護下，將溶有6-硫辛醯胺-6脫氧β-環糊精和硼氫化鈉的二甲基亞碸溶液和溶有氯金酸的二甲基亞碸溶液快速混合，室溫下避光攪拌24小時，然後加入乙腈使產品析出，離心分離固體並用二甲基亞碸和乙腈的混合溶液洗滌8-10次，在0.1MPa下真空乾燥後得到紅棕色金納米粒子固體； 2)將9-蒽醛和二乙烯三胺加入體積比為5:3的無水乙醇和二氯甲烷的混合溶劑中，室溫攪拌24小時後，加入硼氫化鈉，繼續攪拌8小時，減壓除去溶劑，殘留物用蒸餾水洗滌後用二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥後，減壓除去溶劑，0.1MPa下真空乾燥得到固體，將所得固體與1-金剛烷酸醯氯溶解於20 mL無水二氯甲烷中，然後加入三乙胺，氬氣保護下室溫攪拌8小時後，減壓除去溶劑，殘留物以體積比10:1的二氯甲烷和甲醇混合溶劑作為淋洗劑，採用矽膠薄層色譜法分離得到1.27克白色固體N- (9-甲蒽基)-N』-金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺(An-Ad)產品； 3)將上述製得的紅棕色金納米粒子固體與N-(9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺溶解入水中，均勻混合後即可製得溶液態超分子納米組裝體。
3.根據權利要求2所述用於基因治療的超分子納米組裝體的製備方法，其特徵在於:所述6-硫辛醯胺-6脫氧β-環糊精、硼氫化鈉、氯金酸、二甲基亞碸和乙腈用量比為lmmol:5mmol: IOOmmol:4.5L:4.5L。
4.根據權利要求2所述用於基因治療的超分子納米組裝體的製備方法，其特徵在於:所述混合溶液中二甲基亞碸與乙腈的體積比為1:1。
5.根據權利要求2所述用於基因治療的超分子納米組裝體的製備方法，其特徵在於:所述9-蒽醛、二乙烯三胺、無水乙醇和二氯甲烷的混合溶劑和硼氫化鈉的用量比為1.1克:2.7 mL:200 mL:1.9克；9-蒽醛、1-金剛烷酸醯氯、無水二氯甲烷和三乙胺的用量比為1.1克:1.0 克:20 mL:2.1 mL。
6.根據權利要求2所述用於基因治療的超分子納米組裝體的製備方法，其特徵在於:所述金納米粒子在水中的濃度為0.62 g/L, N- (9-甲蒽基)-N』 -金剛烷甲醯胺基乙基乙二胺在水中的濃度為1Χ10-6-2Χ10-4 mol/L。
【文檔編號】B82Y40/00GK103550786SQ201310550587
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】劉育, 趙帝, 陳湧 申請人:南開大學