一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法

2023-07-14 16:46:11 3

專利名稱:一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法
技術領域：
本發明屬於植物組織培養技術領域：
，具體是一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法，該方法通過植物組織培養技術進行鐵皮石斛種苗高效快繁。
背景技術：
鐵皮石斛，民間俗稱「藥中黃金」，是一種附生、多年生的草本植物，開花多，平均自然結實率僅為0.31%，且種子萌發率很低，因而種子資源有限。自秦漢的《神農本草經》將鐵皮石斛入列為上品，後續的《本草綱目》、《道藏》等陸續有相關記載，並將其列為中華九大仙草之首。2010年版《中華人民共和國藥典》將鐵皮石斛單列出來，據記載，其主要成分為多糖、石斛鹼、胺基酸和微量元素等，具有增強免疫功能、抗腫瘤、抗衰老和抑制血栓形成等多種功效。現已製成多種中成藥，著名的有心血管藥「脈絡寧」，眼科藥「石斛夜光丸」以及咽喉疾病用的「慢咽寧」等。目前，鐵皮石斛的鮮條年產量還未達200噸，需求量卻達3萬噸/年，使得野生資源進一步枯竭，成為瀕危、珍稀、高附加值的資源性藥材，其種植生產有很大的利潤空間。
目前，鐵皮石斛種苗主 要通過種子人工栽培、扦插繁殖、器官再生、經愈傷組織的間接體胚再生及直接體胚再生等方式獲取。專利文獻CN102440130A所公開的發明創造，選取成熟自然開裂果實為外植體，以木屑、碎樹皮、珍珠巖為基質，噴霧供給種胚萌發所需營養元素，通過種子自然繁殖來生產石斛種苗，石斛種子的萌發率可達75%左右。CN102499085A、CN102422811A、CN101803515A，以及 CN101461328B、CN101933456B、CN1324946C的專利文獻所公開的發明創造均以鐵皮石斛蒴果為外植體，通過蒴果一原球莖一小苗一成苗的路線獲取鐵皮石斛種苗，此路線獲得株高5cm以上的種苗，育苗周期最少需要5個月，最長達14個月，且此法增殖係數最高為10。CN101336589A及金銀兵(中國農學通報.2009，25 (12):50-52)以扦插的方式進行鐵皮石斛種苗繁殖，分別通過1%。高錳酸鉀及6-BA溶液處理，相應誘導生根及長芽，前者生根率達92 %，後者側芽誘導率最高78 %，前者一個分支誘導成一株苗，後者增殖係數最大為2.58，兩者育苗周期為3 4個月。朱恩燦(公開號 CN102369881A)、劉星華(公告號 CN101548644B)，YIH-JUH SHIAU 等(InVitro Cell.Dev.Biol._Plant2005,41:666-670)、Zhao等(Plant Cell Tiss Organ Cult,2007,90:131-139)以及劉健等(寧波農業科技，2012，1: 14-16)以腋芽為外植體，通過器官再生的方式進行鐵皮石斛種苗的繁殖，育苗周期4 8個月，幼苗再生率最高達78%，增殖係數最高達24.5。蔣武軒(公開號CN101653096A)、田芳(申請號CN102499092A)、滕正平(公開號 CNlO23I856IA)以及 Zhao 等(In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 2008,44:178-185)以鐵皮石斛種子、植株等為外植體，經由愈傷組織的間接體胚再生的方式進行鐵皮石斛種苗繁殖，育苗周期6 11個月，愈傷組織的誘導率最高可達82%，增殖係數最高達50。孔祥瑩(公告號CN101258835B)、蘇有勇(公開號CN101180949A)以及王小霞(公開號CN101273709A)分別選取未展葉芽、莖芽、莖尖為外植體，經表面消毒後誘導擬原球莖，以直接體胚再生的方式繁殖鐵皮石斛種苗，育苗周期6 7個月。張世定(公開號CN102282998A)、李躍宇(公告號CN102138415B)、趙興兵(公告號CN102124936B)、李明焱(CN101352140B)以及滕士元(公告號CN101347101B)從煉苗大棚的設計、出瓶前管理、出瓶後處理、移栽基質選擇等方面對鐵皮石斛煉苗移栽進行了系統的研究。分別採用松樹皮、苔蘚+木屑混合物、砂礫巖+木炭+碎紅磚+樹皮/葉混合物、松木鋸木+松木屑+泥炭+松木樹皮混合物作為煉苗栽培基質，並輔以調整光照來使幼苗逐漸適應外部環境，移栽成活率達到95%以上。以上文獻及專利的研究，為鐵皮石斛規模化種植，緩解資源供應壓力奠定了堅實的基礎，但在鐵皮石斛大規模種植時，仍存在不足:以種子為外植體，其種質來源受限、種苗周期與繁殖係數未能同時達到較好的效果；以腋芽為外植體的器官再生方式，其育苗周期較短，但增殖係數不高，且需要大量的外植體材料；現有的以莖芽及頂芽為外植體的體胚再生方式，雖然縮短了育苗周期，但最短也需要160天；另外，上述報導中根的誘導效率不高，只有2 5條/株，不利於移栽。目前市場存在巨大的供需缺口，因而亟需一種短時間內高效快繁出大批量鐵皮石斛種苗的新方法。

發明內容
本發明目的在於提供一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法，可以在相對短時間內高效擴繁出大批量石斛種苗。
本發明提供的一種鐵皮石斛種苗快繁方法，主要包括以下步驟:
(I)擬原球莖誘導及增殖培養
選取鐵皮石斛的莖尖或無菌幼苗接種於誘導培養基，誘導培養基為:(1/4 1)MS培養基+蔗糖20g/L 30g/L+瓊脂8g/L 12g/L+TDZ (苯基噻二唑脲)0.5mg/L 4mg/L+NAA (萘乙酸)0.5mg/L 4mg/L+2,4-D (2,4- 二氯苯氧乙酸)0.5mg/L 2mg/L,進行擬原球莖的誘導及增殖培養，得到擬原球莖；
(2)擬原球莖分化培養
將上步培養所得擬原球莖轉接於分化培養基，分化培養基為:MS培養基+蔗糖20g/L 30g/L+ 瓊脂 8g/L 12g/L+NAA0.25mg/L 2mg/L+6_BA (6-節基腺嘿呤)2mg/L 10mg/L，進行分化成苗培養，得到叢生幼苗；
(3)叢生幼苗的生根壯苗
將上步中分化培養的叢生幼苗分株接種於生根壯苗培養基，生根壯苗培養基為:(1/4 3/4)MS 培養基 + 鹿糖 20g/L 30g/L+ 瓊脂 8g/L 12g/L+6_BA0.5mg/L 3mg/L+NAA0.25mg/L 4mg/L+IBA(卩引噪丁酸)3mg/L 6mg/L+ 土 提取物 100g/L 400g/L+活性碳2g/L 5g/L，進行生根壯苗；
⑷煉苗移栽
自然光下煉苗，洗淨培養基，移栽於水苔、松樹皮、蛭石混合的基質上，維持基質含水量為50% 70%及空氣溼度為40% 70%，室內溫度控制在25°C ±3°C，保持通風透氣。
作為上述技術方案的改進，所述擬原球莖誘導及增殖培養、擬原球莖分化培養、叢生幼苗的生根壯苗的培養條件均為:培養溫度25°C ±3°C，光照培養時間8小時/天 16小時/天，光照強度:15001x 30001x，空氣溼度60% 80%，pH值為5.5 6.0。
作為上述技術方案的進一步改進，所述的莖尖或無菌幼苗高為0.5cm 1.5cm ;所述的擬原球莖誘導培養周期為10天 15天；所述的擬原球莖增殖培養周期為25 35天；所述的擬原球莖分化培養的培養周期為25天 30天；所述生根壯苗的培養周期為40天 50天。
作為上述技術方案的更進一步改進，步驟(4)中，所述煉苗移栽，煉苗7天 10天，以噴霧處理維持空氣溼度及含水量，所述栽培基質中松樹皮長寬在0.5cm 4cm，蛭石粒徑為小於等於4mm,基質分三層,底層為Icm 3cm厚的水苔，中間為松樹皮與蛭石按體積比2:1 4:1的比例混合,頂層為3cm 5cm厚的水苔。
本發明是一種利用擬原球莖再生途徑高效快繁繁殖鐵皮石斛種苗的方法的快繁方法。該方法是以鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗為外植體，組培過程中，通過採用高效激素組合、添加有機提取物、優化培養條件等措施，達到縮短種苗周期、提高繁殖係數、種質來源不受局限、快速生產大批量的種苗 的目標。本發明所提供的方法具有外植體來源廣泛，增殖係數可以高達50株/0.1g擬原球莖，獲取種苗周期短，種苗整齊，生根率可以達到100%，且根長5cm以上且根數多達10條以上，移栽成活率最高可以達到99%以上等優點，可快速生產大批量的種苗，適用於大規模生產。
具體實施方式
下面結合實例對本發明的具體實施方式
作進一步說明。在此需要說明的是，對於這些實施方式的說明用於幫助理解本發明，但並不構成對本發明的限定。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特徵只要彼此之間未構成衝突就可以相互組合。
實施例1:
選取0.5cm 1.5cm高的鐵皮石斛芽尖，接種於擬原球莖誘導培養基:1/2MS+蔗糖 30g/L+瓊脂 10g/L+TDZ0.5mg/L+NAAlmg/L+2,4-D0.5mg/L,培養 12 天可見擬原球莖形成，發生率達92%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期30天。
將增殖培養後的擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+蔗糖20g/L+瓊脂10g/L+NAA2mg/L+6-BA10mg/L,經28天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，平均45個芽/0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；1/2MS培養基+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BAlmg/L+NAAlmg/L+IBA6mg/L+ 土豆提取物 200g/L+2g/L 活性碳，培養50天，生根率100%，植株平均株高7.8cm，平均根數13.8條，平均根長5.6cm。
總計約123天可獲得株高5cm以上的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗7天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層2cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比2: I) +水苔薄層(頂層3cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40 % 70 %，保持室內通風，移栽成活率可達98 %以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值5.8，培養溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣溼度設定65% (實際65% ±5%)，光照10小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。
上述移栽時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。[0027]實施例2:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛苗莖尖或無菌幼苗，接種於擬原球莖誘導培養基:MS+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 12g/L+TDZlmg/L+NAA4mg/L+2，4-D0.5mg/L,培養 10 天可見擬原球莖形成，發生率達98%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期30天。
將增殖培養後的擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+NAA0.5mg/L+6-BA4mg/L,經30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約50個芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；3/4MS培養基+蔗糖 25g/L+ 瓊脂 12g/L+6-BA0.5mg/L+NAAlmg/L+IBA3mg/L+ 土豆提取物 100g/L+3g/L 活性碳，培養40天，生根率100%，植株平均株高5.5cm，平均根數10.2條，平均根長5.3cm。
總計115天可獲得株高5cm以上的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗8天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層3cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比3: I) +水苔薄層(頂層4cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40 % 70 %，保持室內通風，移栽成活率可達99 %以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值6.0,培養溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣溼度設定65% (實際65% ±5% )，光照8小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。
上述移栽時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實施例3:
選取0.5cm 1.5cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種於擬原球莖誘導培養基:1/4MS+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L+TDZlmg/L+NAAlmg/L+2，4-Dlmg/L，培養 12 天可見擬原球莖形成，發生率達96%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期30天。
將增殖培養後的擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+蔗糖30g/L+瓊脂12g/L+NAAlmg/L+6-BA5mg/L,經25天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約40個芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；1/4MS培養基+鹿糖 20g/L+ 瓊脂 8g/L+6-BA3mg/L+NAA2mg/L+IBA3mg/L+ 土豆提取物 100g/L+4g/L 活性碳，培養45天，生根率100 %，植株平均株高6cm，平均根數8.4條，平均根長4.3cm。
總計112天可以犾得株聞6cm左右的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗7天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層2cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比3: I) +水苔薄層(頂層5cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40 % 70 %，保持室內通風，移栽成活率可達95 %以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值5.5，培養溫度25°C ±3°C，光照15001x，空氣溼度設定70% (實際70% ±5%)，光照12小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。
上述移栽時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實施例4:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種於擬原球莖誘導培養基:1/4MS+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+TDZ2mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-Dlmg/L,培養 10 天可見擬原球莖形成，發生率達96%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期30天。
將增殖培養後的擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+鹿糖25g/L+瓊脂8g/L+NAA0.25mg/L+6-BA2mg/L,經30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約45個芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；1/2MS培養基+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BA0.5mg/L+NAA4mg/L+IBA3mg/L+ 土豆提取物 100g/L+3g/L 活性碳，培養45天，生根率100%，植株平均株高5.7cm，平均根數11.8條，平均根長5.4cm。
總計115天，可獲得株高5cm以上的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗10天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層Icm) +松樹皮蛭石混合物(體積比2: I) +水苔薄層(頂層5cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40% 70%，保持室內通風，移栽成活率可達95%以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值5.5，培養溫度25°C ±3°C，光照15001x，空氣溼度設定75% (實際75% ±5%)，光照16小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。
上述移栽 時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實施例5:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種於擬原球莖誘導培養基:1/4MS+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L+TDZ2mg/L+NAA2mg/L+2，4-D2mg/L，培養 15 天可見擬原球莖形成，發生率達80%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期35天。
將增殖培養後的擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+蔗糖30g/L+瓊脂12g/L+NAA0.5mg/L+6-BA3mg/L,經30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約48個芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；3/4MS培養基+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 12g/L+6-BA2mg/L+NAA0.25mg/L+IBA6mg/L+ 土豆提取物 200g/L+5g/L 活性碳，培養50天，生根率100%，植株平均株高7.3cm，平均根數9.8條，平均根長6.4cm。
總計120天可獲得株高5cm以上的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗8天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層2cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比4: I) +水苔薄層(頂層4cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40 % 70 %，保持室內通風，移栽成活率可達95 %以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值5.8，培養溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣溼度設定70% (實際70% ±5%)，光照10小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。[0058]上述移栽時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實施例6:
選取0.5cm 1.5cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種於擬原球莖誘導培養基:MS+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 10g/L+TDZ2mg/L+NAA2mg/L+2，4-Dl.0mg/L,培養 12 天可見擬原球莖形成，發生率達90%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期30天。
將增殖培養後的擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+鹿糖30g/L+瓊脂10g/L+NAAlmg/L+6-BA3mg/L,經28天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約45個芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；1/4MS培養基+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BA2mg/L+NAA0.25mg/L+IBA5mg/L+ 土豆提取物 200g/L+5g/L 活性碳，培養50天，生根率100%，植株平均株高7.5cm，平均根數11.3條，平均根長5.6cm。
總計118天可獲得株高5cm以上的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗9天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層3cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比4: I) +水苔薄層(頂層3cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40 % 70 %，保持室內通風，移栽成活率可達95 %以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值5.8，培養溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣溼度設定70% (實際70% ±5%)，光照10小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。`
上述移栽時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實施例7:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種於擬原球莖誘導培養基:MS+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 12g/L+TDZ4mg/L+NAAlmg/L+2，4-Dl.5mg/L,培養 15 天可見擬原球莖形成，發生率達85%，將原球莖接種於原誘導培養基上進行增殖培養，繼代周期30天。
經增殖培養數代後，將擬原球莖接種於擬原球莖分化培養基:MS培養基+蔗糖25g/L+瓊脂10g/L+NAA0.5mg/L+6-BA5mg/L,經30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約50個芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個芽/株，接種至生根壯苗培養基；1/2MS培養基+鹿糖 25g/L+ 瓊脂 8g/L+6-BA2mg/L+NAAlmg/L+IBA6mg/L+ 土豆提取物 400g/L+5g/L 活性碳，培養50天，生根率100%，植株平均株高6.7cm，平均根數9.3條，平均根長5.2cm。
總計120天可獲得株高5cm以上的優質種苗。
將壯苗培養所得瓶苗室內開蓋煉苗8天，後取出洗淨根部培養基，移入預先浸溼的栽培基質:水苔薄層(底層Icm) +松樹皮蛭石混合物(體積比3: I) +水苔薄層(頂層4cm),松樹皮長寬在0.5em 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,維持基質含水量50% 70%,噴霧維持空氣溼度為40 % 70 %，保持室內通風，移栽成活率可達95 %以上。
上述無菌培養階段的培養基pH值5.5，培養溫度25°C ±3°C，光照15001x，空氣溼度設定75% (實際75% ±5%)，光照12小時/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾製得。
上述移栽時期，栽培室內溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧1 2次/天。
本發明從外植體到供移栽幼苗只需4個月，縮短了育苗周期，擬原球莖成苗的增殖係數高達50株/0.1g擬原球莖，種苗生長整齊、健壯，葉色濃綠，根系發達，煉苗移栽方法簡單易行、適合大批量生產。
以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限於該實施例所公開的內容。所以凡是不脫離本發·明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的範圍。
權利要求
1.一種鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，它包括如下步驟: (1)擬原球莖誘導及增殖培養 選取鐵皮石斛的莖尖或無菌幼苗接種於誘導培養基，誘導培養基為:(1/4 1)MS培養基+鹿糖20g/L 30g/L+瓊脂8g/L 12g/L+TDZ(苯基噻二唑脲)0.5mg/L 4mg/L+NAA (萘乙酸)0.5mg/L 4mg/L+2,4-D (2,4- 二氯苯氧乙酸)0.5mg/L 2mg/L,進行擬原球莖的誘導及增殖培養，得到擬原球莖； (2)擬原球莖分化培養 將上步培養所得擬原球莖轉接於分化培養基，分化培養基為:MS培養基+蔗糖20g/L 30g/L+瓊脂 8g/L 12g/L+NAA0.25mg/L 2mg/L+6_BA (6-節基腺嘿呤)2mg/L IOmg/L，進行分化成苗培養，得到叢生幼苗； (3)叢生幼苗的生根壯苗 將上步中分化培養的叢生幼苗分株接種於生根壯苗培養基，生根壯苗培養基為:(1/4 3/4)MS 培養基 + 鹿糖 20g/L 30g/L+ 瓊脂 8g/L 12g/L+6_BA0.5mg/L 3mg/L+NAA0.25mg/L 4mg/L+IBA(卩引噪丁酸)3mg/L 6mg/L+ 土 提取物 100g/L 400g/L+活性碳2g/L 5g/L，進行生根壯苗； (4)煉苗移栽 自然光下煉苗，洗淨培養基，移栽於水苔、松樹皮、蛭石混合的基質上，維持基質含水量為50% 70%及空氣溼度為40% 70%，室內溫度控制在25°C ±3°C，保持通風透氣。
2.根據權利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，所述擬原球莖誘導及增殖培養、擬原球莖分化培養、叢生幼苗的生根壯苗的培養條件均為:培養溫度25°C ±3°C，光照培養時間8小時/天 16小時/天，光照強度:15001x 30001x，空氣溼度60% 80%，pH 值為 5.5 6.0。
3.根據權利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述誘導培養周期為10天 15天。
4.根據權利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述增殖培養周期為25 35天。
5.根據權利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述分化培養的培養周期為25天 30天。
6.根據權利要求
1至5所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(3)中，所述生根壯苗的培養周期為40天 50天。
7.根據權利要求
1至5中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述莖尖或無菌幼苗高為0.5cm 1.5cm。
8.根據權利要求
6中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述莖尖或無菌幼苗高為0.5cm 1.5cm。
9.根據權利要求
1至5中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(4)中，所述煉苗移栽，煉苗7天 10天，以噴霧處理維持空氣溼度及含水量，所述栽培基質中松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,基質分三層,底層為Icm 3cm厚的水苔，中間為松樹皮與蛭石按體積比2:1 4:1的比例混合,頂層為3cm 5cm厚的水苔。
10.根據權利要求
8中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特徵在於，步驟(4)中，所述煉苗移栽，煉苗7天 10天，以噴霧處理維持空氣溼度及含水量，所述栽培基質中松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小於等於4mm,基質分三層,底層為Icm 3cm厚的水苔，中間為松樹皮與蛭石 按體積比2:1 4:1的比例混合,頂層為3cm 5cm厚的水苔。
專利摘要
本發明公開了一種鐵皮石斛種苗高效繁殖的方法。步驟包括a.選用鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗為外植體，進行擬原球莖的誘導及增殖培養；b.擬原球莖的分化成苗；c.叢生幼苗的生根壯苗培養；d.無菌苗的煉苗及移栽。本發明利用莖尖和無菌幼苗為外植體，避免了僅以莖芽及頂芽為外植體誘導擬原球莖，外植體來源受限的問題，可大量、快速、持續獲得成熟的擬原球莖，擬原球莖發生率最高達99％，幼苗分化係數高達50株/0.1g擬原球莖，獲取種苗周期僅需4個月，種苗整齊，生根率100％，根長5cm左右且根數多達10條/叢，移栽成活率可高達95％以上等優點，達到縮短種苗周期、提高繁殖係數、種質來源不受局限的目標。可快速生產大批量的種苗，適用於大規模生產。
文檔編號A01H4/00GKCN103155871SQ201310071862
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月7日
發明者付春華, 王麗瓊, 餘龍江, 董豔山 申請人:華中科技大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan