修飾的米麴黴乳糖酶及其製備方法和應用的製作方法
2023-07-15 01:59:56 1
專利名稱：修飾的米麴黴乳糖酶及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及修飾的酶及其製備方法，尤其涉及修飾的米麴黴乳糖酶及其製備方法和應用，屬於米麴黴乳糖酶的修飾領域。
背景技術：
隨著人們生活水平的提高，健康的飲食習慣越來越受到重視，最明顯的表現就是乳及乳製品的消費量迅速增加。但是亞洲人口中約有70%的人患有不同程度的「乳糖不耐症」，「乳糖不耐症」在很大程度上限制了人們對乳及乳製品的攝入，會產生一系列不良影響，如引發鈣吸收不良、腹瀉、軟骨病和骨質疏鬆等，阻礙了乳工業的發展。利用乳糖酶降解乳糖目前是解決「乳糖不耐症」的最佳處理方法。
乳糖酶(Lactase)是一類催化特殊類型的糖苷鍵——β -半乳糖苷類化合物中 β -半乳糖苷鍵發生水解斷裂的酶。乳糖酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，並具有半乳糖苷的轉移作用，在乳糖分子的半乳糖一側連接1-4個半乳糖，生成低聚半乳糖。米麴黴乳糖酶是胞外酶，發酵成本低，分離提取方便，而且較耐熱、耐酸，穩定性好。米麴黴乳糖酶屬高溫乳糖酶，最適作用溫度較高，一般在50°C以上，生產中能有效地防止雜菌的汙染；反應速度快，反應時間短，酶的用量少，生產效率高。
乳糖酶可廣泛應用於食品工業和醫藥工業。乳糖酶可以將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，可明顯提高乳製品的甜度，減少甜味劑的用量，降低乳製品中乳糖的含量，提高乳製品的可消化性。由於乳糖的溶解度較低，在冷凍乳製品中容易結晶析出，影響產品的質量，乳糖的降解可以克服乳製品中乳糖的析出問題，從而延長產品的貨架期。在發酵乳製作酸乳中添加乳糖酶，可以縮短發酵時 間，減少蔗糖用量，改善發酵乳的風味和口感。乳糖酶可以催化半乳糖基轉移反應，因此可以用於低聚半乳糖的生產，低聚半乳糖是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，能夠促進人體腸道內有益菌的增殖；促進礦物元素的吸收，特別是促進鈣的吸收；改善脂質代謝，降低血清中膽固醇的濃度，提高血清中高密度脂蛋白所佔比例。乳糖酶在醫藥工業中可做為助消化類藥物，適用於嬰兒各種消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、由胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉、由感冒及消化不良等引起的繼發性腹瀉，特別是黴菌所產的乳糖酶耐酸性較強，不被胃酸分解，能夠到達小腸降解乳糖，緩解消化不良等症狀。
聚乙二醇(PEG)是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長鏈高分子聚合物，是一種安全載體，PEG通過共價鍵與蛋白質連接，可以與蛋白質分子中的α-氨基、ξ_氨基反應對蛋白質分子進行修飾，通過對蛋白質表面氨基進行修飾以有效地改變蛋白質的生理特性。修飾後的蛋白質具有一些特殊的性質1、PEG化可以使蛋白質穩定性、抗酸能力、抗變性能力及抗蛋白酶水解能力提高；2、PEG化可以降低蛋白質的藥物抗原性，擴大應用範圍；3、PEG 化對酶活性影響不太，大多數酶活性損失不大。
米麴黴乳糖酶分子量在90000Da左右，最適反應溫度為55°C，低溫下相對穩定， 4°C保存I個月後，酶活開始下降，高溫條件下穩定性較差，70°C保溫2h，殘留酶活力幾乎完全喪失，僅存5%左右；最適反應pH值為5. 5, pH值為4. O 8. O時相對穩定。在最適條件下，米麴黴乳糖酶活力為13000U/g。發明內容
本發明的目的之一是將米麴黴乳糖酶用聚乙二醇或其衍生物進行修飾得到修飾的米麴黴乳糖酶；
本發明的目的之二是提供一種修飾米麴黴乳糖酶的方法；
本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的
聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，其結構通式為=R1-NH-R2 ；
其中，R1為活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；
優選的，所述的活化的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇；
所述的活化的聚乙二醇衍生物選自單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯並三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、 丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛或單甲氧基聚乙二醇乙醛；
其中，所述的聚乙二醇是直鏈的聚乙二醇或是帶支鏈的聚乙二醇，聚乙二醇的分子量為5000 20000 ；
R2為去除一個氨基的米麴黴乳糖酶分子。
本發明的另外一個目的是提供製備所述聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的方法，該方法包括以下步驟
將米麴黴乳糖酶溶液的pH值調節為弱酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物進行修飾反應，得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶；
本發明通過實驗發現，米麴黴乳糖酶溶液的pH值對於修飾反應的修飾率以及修飾後產物的相對酶活有較為明顯的影響；本發明通過大量的試驗發現，將米麴黴乳糖酶溶液的PH值調節為4. 5 7. 5時，能夠有效提升修飾率，修飾後的米麴黴乳糖酶也能保持較高的酶活；本發明通過進一步的實驗發現，當米麴黴乳糖酶溶液的pH值為5. O 6. O,尤其是5. 5時，不僅修飾率達到最高點，修飾的產物-米麴黴乳糖酶也能保持較高的酶活；為此， 本發明修飾反應中，米麴黴乳糖酶溶液的PH值優選為5. O 6. O,最優選為5. 5。
本發明通過實驗發現米麴黴乳糖酶溶液的濃度對修飾效果影響不大，所以在修飾反應中米麴黴乳糖酶溶液的濃度可以根據反應的情況(例如所加入活化劑的濃度等)進行調整，作為參考，本發明修飾反應中的米麴黴乳糖酶溶液的濃度可以為500 5000U/mL，優選為 2000U/mL。
本發明通過大量的試驗進一步發現，所加入的活化劑(活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)與米麴黴乳糖酶的摩爾比對於修飾反應的修飾率以及修飾後產物米麴黴乳糖酶的酶活有非常顯著的影響；本發明通過大量的篩選試驗發現，所加入的活化劑 (活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)與米麴黴乳糖酶的摩爾比為3 20 :1，修飾反應的產物具有較高的修飾率，產物也能保持較高的酶活；活化劑與米麴黴乳糖酶的摩爾比優選為15 20 :1，進一步優選為16 20 :1，特別優選為16 17 :1，在上述摩爾比範圍內，修飾率不僅有非常顯著的提升，修飾後的米麴黴乳糖酶也能保持較高的酶活，其中，當活化劑與米麴黴乳糖酶的摩爾比為16:1時，修飾後的米麴黴乳糖酶在相對酶活和修飾率之間達到了最佳平衡。
所述的修飾反應的溫度優選為4 37°C，優選為20 25°C，最優選為25°C。
所述的修飾反應的時間優選為10 120分鐘，優選為25 40分鐘，最優選為30分鐘。
本發明進一步提供一種從上述修飾反應產物中分離和純化聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的方法，該方法包括以下步驟
將反應產物依次經過離子交換層析和凝膠過濾層析提純，去除游離的聚乙二醇 (PEG)和未反應蛋白，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
所述的離子交換層析可以採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質包括聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖型、瓊脂糖型等，陽離子交換體積可以為6 600mL，流速可以為O. 5 50mL/min，用起始緩衝液平衡3 8倍柱體積，上液量為2 200mL，先用 I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩衝液、起始緩衝液+0 O. 4mol/LNaCl溶液，洗脫3 15倍柱體積；所述起始緩衝液可使用磷酸鹽緩衝液和醋酸鹽緩衝液等，PH值在4. 5 7. 5 ;收集各組分洗脫液，採用高效液相色譜分析各組分，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
所述的凝膠過濾層析的方法包括將離子交換層析中所收集的洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質包括葡聚糖型和瓊脂糖型等，凝膠過濾層析柱體積可以為25 2500mL，流速可以為O.1 10mL/min，pH4. 5 7. 5緩衝液平衡I 2倍體積，上液量為O. 2 20mL，pH4. O 7. O緩衝液洗脫I 2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
採用本發明方法所製備得到的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，米麴黴乳糖酶轉化率在90%以上，修飾後的米麴黴乳糖酶相比未修飾酶，其酶活能保持在85%以上，修飾後的米麴黴乳糖酶熱穩定性和抗酸能力有顯著提高；修飾後的乳糖酶抗蛋白酶水解能力顯著提高，穩定性提高；修飾後的米麴黴乳糖酶的免疫抗原性明顯降低，擴大了應用範圍。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
1、乳糖酶活力測定方法
以鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷(ONPG)為底物，在一定條件下水解，生成鄰硝基苯酚 (ONP)和半乳糖，鄰硝基苯酚在420nm處有特異性吸收，用分光光度計測定OD值，與標準曲線比較測定生成的鄰硝基苯酚的量。
酶活定義每分鐘水解ONPG產生I μ mo I鄰硝基苯酚所需的酶量為1U。
2、乳糖酶修飾率的測定方法
取Iml含O.1 Img修飾蛋白的溶液，加入lmL4%pH8. O的磷酸鹽緩衝液，20分鐘後加入Iml O. 1%2，4，6 一三硝基苯磺酸鈉(TNBS)溶液，40°C保溫2小時，再加入lmL10%十二烷基磺酸鈉溶液和O. 5ml lmol/L的鹽酸終止反應。335nm下讀取吸光度。同樣濃度的蛋白質在修飾反應前後光吸收值之比即為殘留氨基量。
修飾率=1-殘留氨基率。
實施例1乳糖酶的修飾及分離純化
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節5. 5，加入單甲氧基聚乙二醇(購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的單甲氧基聚乙二醇與米麴黴乳糖酶的摩爾比為16 1 ;修飾反應的溫度為25°C，反應40分鐘，得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物；
將上述反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為89. 3%，修飾率為68. 9%。
實施例2乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節5. 5，加入單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯與米麴黴乳糖酶的摩爾比為3 1 ;修飾反應的溫度為25°C，反應時間為40分鐘，得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
將上述反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mo 1/L NaCl溶液，洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為97. 3%，修飾率為11. 6%ο
實施例3乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節5. 5，加入甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯(購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯與米麴黴乳糖酶的摩爾比20 1 ;修飾反應的溫度為25°C，修飾反應的時間為 40分鐘，得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mo 1/L NaCl溶液，洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖 酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為67. 8%，修飾率為78. 2%。
實施例4乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節為7. 5，加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯(購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯與米麴黴乳糖酶的摩爾比為15 1 ;修飾反應的溫度為37°C，修飾反應的時間為10分鐘；得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在7. 5)、起始緩衝液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH7. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為85. 2%，修飾率為54. 6%。
實施例5乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節為5. 5，加入單甲氧基聚乙二醇(購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的單甲氧基聚乙二醇與米麴黴乳糖酶的摩爾比為17 1 ;修飾反應的溫度為25°C，修飾反應的時間為40分鐘；得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為78. 1%，修飾率為69. 2%。
實施例6乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節為5. 5，加入單甲氧基聚乙二醇(購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的單甲氧基聚乙二醇與米麴黴乳糖酶的摩爾比為15 1 ;修飾反應的溫度為25°C，修飾反應的時間為40分鐘；得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為85. 7%，修飾率為53. 2%。
實施例7乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節5. 5，加入單甲氧基聚乙二醇甲醛 (購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的單甲氧基聚乙二醇甲醛與米麴黴乳糖酶的摩爾比為12 1 ;修飾反應的溫度為25°C，修飾反應的時間為40分鐘；得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為89. 6%，修飾率為47. 6%。
實施例8乳糖酶的修飾
將米麴黴乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值調節5. 5，加入單甲氧基聚乙二醇乙醛 (購自上海炎怡生物科技有限公司)進行修飾反應，所加入的單甲氧基聚乙二醇乙醛與米麴黴乳糖酶的摩爾比為8 1 ;修飾反應的溫度為25°C，修飾反應的時間為40分鐘；得到含有聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的反應產物。
將反應產物採用離子交換層析和凝膠過濾層析，分離並純化得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶
離子交換層析將反應產物採用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質為聚苯乙烯型，陽離子交換體積為IOOmL,流速為20mL/min，用起始緩衝液平衡6倍柱體積，上液量為IOOmL,先用I 5倍柱體積的起始緩衝液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫， 梯度液組成為起始緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PH值在5. 5)、起始緩衝液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脫6倍柱體積，收集各組分洗脫液；
凝膠過濾層析將洗脫液用醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，使用的凝膠過濾介質(葡聚糖型)，凝膠過濾層析柱體積為500mL,流速為5mL/min,pH5. 5緩衝液平衡2倍體積，上液量為10mL，pH5. 5緩衝液洗脫2倍體積，收集各洗脫組分，採用高效液相色譜分析，合併聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
經檢測，本實施例所製備的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的相對酶活為92. 9%，修飾率為31. 7%。
實驗例I乳糖酶熱穩定性實驗
1、實驗材料
供試材料實施例1-8所製備的修飾後米麴黴乳糖酶；
對照材料未修飾的米麴黴乳糖酶；
2、實驗方法
將供試材料和對照材料分別在不同溫度條件下(60°C ,70°C)的水浴中保存，不同時間(O. 5小時、I小時、2小時、3小時、4小時)後取樣，迅速用冰水冷卻至55°C，測定乳糖酶殘留的活力。
3、實驗結果
實驗結果表明，70°C保溫2h後，未修飾米麴黴乳糖酶(對照材料)活力幾乎完全喪失，僅存5% ;而修飾的米麴黴乳糖酶(供試材料)的相對酶活平均為43. 1%，保溫4h後，相對酶活仍平均有20%。
實驗例2乳糖酶pH穩定性實驗
1、實驗材料
供試材料實施例1-8所製備的修飾後米麴黴乳糖酶；
對照材料未修飾米麴黴乳糖酶；
2、實驗方法
將供試材料和對照材料分別溶於不同pH值(pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、 pH9、pH10)的緩衝液中保存，不同時間點取樣，測定乳糖酶殘留的活力。
3、實驗結果
實驗結果表明，相同條件下，實施例1-8所製備的PEG化乳糖酶殘餘酶活均比未修飾酶高，尤其是在pH較低條件下，如pH為3時，保存2h後，未修飾米麴黴乳糖酶相對酶活僅為40%，而實施例1-8所製備的PEG化乳糖酶相對酶活平均達75%，供試材料顯示出更高的pH穩定性。
實驗例3乳糖酶抗酶解能力實驗
1、實驗材料
供試材料實施例1-8所製備的修飾後米麴黴乳糖酶；
對照材料未修飾米麴黴乳糖酶
2、實驗方法
將未修飾米麴黴乳糖酶和修飾後米麴黴乳糖酶Iml分別加入人工腸液9ml中，充分混勻，37°C保溫，O. 5h時、Ih時、2h時、3h時分別取樣測定剩餘酶活力。
人工腸液取磷酸二氫鉀6. 8g,加水500ml使之溶解,用O. 4%的氫氧化鈉溶液調節pH至6. 8 ;另取胰酶IOg加水適量溶解，將兩液混合後，加水稀釋至IOOOml即可。
3、實驗結果
實驗結果表明保溫3h後，本發明實施例1-8所製備的修飾後米麴黴乳糖酶殘留酶活為73%，而未修飾米麴黴乳糖酶不到60%，修飾後的米麴黴乳糖酶比未修飾酶對蛋白酶具有更好的抗性。
實驗例4活化劑與乳糖酶的摩爾比對修飾效果的影響實驗
1、實驗方法
將活化劑單甲氧基聚乙二醇與乳糖酶按照表I所述的摩爾比溶於5mLpH值5. 5的乙酸緩衝液或磷酸鹽緩衝液中，室溫(20-25°C)下反應40分鐘，然後在反應液中分別加入 lmol/L甘氨酸1. 5mL終止反應，以未修飾的乳糖酶的活力為100%，分別測定產物的酶活變化和修飾率。
2、實驗結果
實驗結果見表I。
表I
權利要求
1.聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，其特徵在於，其結構通式為=R1-NH-R2；其中，R1為活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；R2為去除一個氨基的米麴黴乳糖酶分子。
2.按照權利要求1所述的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，其特徵在於所述的活化的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇；所述的活化的聚乙二醇衍生物選自單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯並三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛或單甲氧基聚乙二醇乙醛。
3.按照權利要求1所述的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶，其特徵在於所述的聚乙二醇是直鏈的聚乙二醇或是帶支鏈的聚乙二醇，聚乙二醇的分子量為5000 20000。
4.一種製備權利要求1-3任何一項所述聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的方法，該方法包括以下步驟將米麴黴乳糖酶溶液的PH值調節為弱酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物進行修飾反應，得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
5.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於將米麴黴乳糖酶溶液的pH值調節為.4.5 7. 5，優選為5. 5。
6.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於所加入的活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物與米麴黴乳糖酶的摩爾比為3 20 :1，優選為15 .20 :1，更優選為16 20 :1，最優選為16 =I0
7.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的修飾反應的溫度為4 37°C，優選為20 25 °C，最優選為25 °C。
8.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的修飾反應的時間為10 120分鐘， 優選為25 40分鐘，最優選為30分鐘。
9.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的所述的活化的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇；所述的活化的聚乙二醇衍生物選自單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯並三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛或單甲氧基聚乙二醇乙醛。
10.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於，還包括以下步驟將反應產物依次經過離子交換層析和凝膠過濾層析提純，去除游離的聚乙二醇和未反應蛋白，得到純化的聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。
全文摘要
本發明公開了修飾的米麴黴乳糖酶及其製備方法和應用。所述聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶的結構通式為R1-NH-R2；其中，R1為活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；R2為去除一個氨基的米麴黴乳糖酶分子。本發明進一步公開了製備所述修飾的米麴黴乳糖酶的方法，該方法包括將米麴黴乳糖酶溶液的pH值調節為酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物進行修飾反應得到聚乙二醇修飾的米麴黴乳糖酶。本發明方法米麴黴乳糖酶轉化率高，所修飾得到的米麴黴乳糖酶酶活保持在85%以上，熱穩定性和抗酸能力有顯著提高，免疫抗原性有所降低，擴大了應用範圍。
文檔編號C12N9/38GK102994477SQ201210487038
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日
發明者趙從波, 陳文杰, 馬清河, 章淑豔, 李軍, 王雲鵬, 秦豔梅 申請人:河北省微生物研究所