具抗病毒活性的滇柴胡地上部分總黃酮的提取富集方法
2023-07-28 06:42:41 2
專利名稱：具抗病毒活性的滇柴胡地上部分總黃酮的提取富集方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥有效部位的提取富集工藝，特別是涉及具有抗病毒活性的滇 柴胡地上部分總黃酮的提取富集工藝，屬中藥技術領域。
背景技術：
柴胡是傘形科(Umbelliferae)柴胡屬Bupleurum植物，為常用的辛涼解表藥，已 有2000多年的應用歷史，《神農本草經》中列為上品。柴胡屬植物在全世界約有200多種。 目前，中國已報導的柴胡屬植物有42種、17變種、7變型。中國藥典2010年版收載的柴胡 為傘形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium ffilld.的乾燥根，作為我國傳統的正品柴胡使用，而國內各地區入藥的柴胡植物不完全一 致，往往取決於當地的資源條件及用藥習慣。滇柴胡(來源為竹葉柴胡Bupleurummarginatum Wall, ex DC.、小柴胡Bupleurum tenue Buch. Ham. ex D. Don禾口馬尾柴古月Bupleurum microcephalum Diels)主要分布於四川 北部、陝西南部、湖北西部以及雲南、貴州等省，為目前市場上藥材柴胡的三大主要來源之 一，主流藥材為竹葉柴胡。滇柴胡作為西南地區的藥用柴胡，以全草入藥，療效顯著，且其資 源豐富，是一種很有開發價值的柴胡品種。經檢索，目前被報導的柴胡地上部分總黃酮的提取富集方法主要有兩種方法一柴胡藥材乙醇提取、過濾、上大孔吸附樹脂或聚醯胺柱，含水醇洗脫，濃 縮，重結晶。(江蘇省中國科學院植物研究所.柴胡莖葉提取物及其製備方法和用途[P]. 中國專利:CN02137936. X，2004-09-15.)方法二 取柴胡水提取液，調PH2-5、過大孔樹脂柱、含水醇洗脫、正丁醇萃取、濃 縮。(江蘇正大天晴藥業股份有限公司.一種抗流感病毒的柴胡黃酮組合物及其製備方法 [P],中國專利:CN02137936. X，2003-01-08)然而，研究表明，滇柴胡中的化學成分與正品柴胡存在差異，且經我們實驗證明 (見表1)，這兩種運用於正品柴胡中總黃酮的提取方法並不適合於滇柴胡地上部分總黃酮 的製備。表1已報導方法與本發明中方法滇柴胡中總黃酮含量比較
提取富集方法總提取物(mg/g)總黃酮含量(%)方法一10. 519. 3方法二9. 8734. 6本發明中方法13. 755.
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種從滇柴胡地上部分中提取富集滇柴胡總黃
3酮的方法，工藝簡單易行，適合工藝生產，並通過系列藥效學實驗證明所得滇柴胡總黃酮具 有抗病毒活性。本發明以如下技術方案解決上述技術問題本發明涉及一種滇柴胡地上部分中總黃酮的提取富集方法，提取物中總黃酮的含 量為 50% -90%。提取總黃酮的方法有以下步驟滇柴胡地上部分經過乾燥、提取、濃縮至無醇味、沉降過濾、萃取，二次濃縮至幹、 加水溶解並調節PH值沉降過濾、濾液進行柱吸附解析，解析液濃縮乾燥即得。本發明的技術方案為1.取滇柴胡地上部分，加50-90%的乙醇8-12倍量熱回流提取2-3次，每次2_3h ；2.合併提取液，濃縮至無醇味，置冰箱冷藏，靜置24h，沉澱葉綠素，取上清液，用 水飽和正丁醇萃取3次，合併正丁醇液，水浴回流至幹，加水溶解，加入5%鹽酸或5%硫酸， 調節PH至1-5，靜置，取上清液；3.上清液過大孔樹脂柱，大孔樹脂型號為HPD100、HPD300、HPD400或HPD600 ；然 後分別用柱體積的3倍量的水、10%乙醇洗脫，棄去；再用柱體積的3倍量的60-90%乙醇 洗脫，收集洗脫液，濃縮至無醇味，噴霧乾燥，得總黃酮，所得總黃酮採用UV法測定，含量大 於 55%。本發明所述的一種具抗病毒活性的滇柴胡地上部分總黃酮的提取富集方法其優 *izti J *(1)改進後的方法與現有方法相比，滇柴胡提取物中總黃酮的含量提高了 2. 8和 1. 6倍。得到的產品採用UV法測定的總黃酮含量大於55%，符合中華人民共和國《藥品管 理法》規定的中藥二類的原料標準。同時，本方法的重複性、穩定性好，從而保證了療效的穩 定；原料有效成分轉移率高，成本低，操作簡便，適用於工業化生產。(2)通過一系列的藥效學實驗證明本發明所得總黃酮具有較明顯的抗病毒作用。 實驗如下實驗例一滇柴胡總黃酮對小鼠流感病毒感染模型的死亡保護作用一、實驗目的用小鼠感染模型對滇柴胡的體內抗流感病毒作用進行研究，為滇柴胡的臨床應用 提供實驗依據。二、實驗材料1.受試藥物配製方法稱取IOmg滇柴胡總黃酮，加入120ml水中溶解，即為滇柴胡藥物原液。2.病毒株及菌株流感病毒鼠肺適應株A/FM1/1/47/ (HlNl)，接種雞胚，收集尿囊液保存。副流感病 毒仙臺株，接種雞胚，收集尿囊液保存。3.實驗動物ICR小鼠，體重18 22g，購自南通大學實驗動物中心，小鼠採用苦味酸標記，給 藥期間自由進食、飲水(Co6°照射飼料和滅菌水)，每天12小時光照，12小時黑暗，溫度 22 士 2 °C，溼度 55-70%。
4
4.陽性對照雙黃連口服液，哈藥集團三精製藥有限公司生產。批號07072924。臨用前以文火 煮沸消毒30分鐘。利巴韋林顆粒，中國藥科大學製藥有限公司生產，規格50mg，批號070401。臨用前 以生理鹽水配製成5mg/ml濃度，以孔徑0. 22 μ m無菌濾膜過濾除菌。三、實驗方法ICR小鼠，早$各半，隨機分為7組滇柴胡總黃酮高劑量組(42mg/kg)、滇柴胡總 黃酮中劑量組(21mg/kg)、滇柴胡總黃酮低劑量(10. 5mg/kg)，雙黃連口服液10ml/kg，利巴 韋林(400mg/kg)，正常對照組和病毒對照組，每組6隻。適應性培養2天後，開始實驗。給藥方法每天給藥兩次，共給藥4d，給藥體積ΙΟΟμ 1，病毒對照組及正常對照組 同法給予等體積生理鹽水。感染方法給藥第二天開始接種病毒，除正常對照組以外，其它各組小鼠用乙醚輕 度麻醉，鼻腔內接種相當於5LD5(i的含流感病毒的雞胚尿囊液200 μ 1/只。自感染次日起，連續14d，每日觀察並記錄小鼠死亡數，計算死亡保護率和平均存 活時間。死亡保護率(％ )=對照組死亡率(％ )_實驗組死亡率(％ )存活時間=同組內每隻動物生存日數相加/實驗動物數四、實驗結果與病毒對照組相比較，滇柴胡各劑量組均能顯著降低流感病毒感染所致的小鼠死 亡率，延長平均存活時間，以42mg/kg劑量組的作用最為顯著。表2滇柴胡對A/FM1/1/47/(Hmi)感染小鼠的死亡保護作用(η = 6)
權利要求
一種滇柴胡地上部分提取物，其特徵是提取物中具有抗病毒活性的主要活性部位滇柴胡總黃酮的含量為50 90％。
2.根據權利1所述的提取物，其特徵是經過以下提取方法獲得滇柴胡地上部分用濃 度為50-90%的低級醇提取、濃縮、沉降過濾、用水飽和正丁醇萃取，二次濃縮、加水溶解並 調節PH值1-5，沉降過濾、濾液上大孔樹脂柱，然後用0-10%乙醇洗脫，棄去；再60-90%乙 醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，乾燥，得總黃酮。
3.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是所述的提取液優選5-12倍量的濃度為50% -90%的乙醇水溶液。
4.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是提取液回流提取3次，每次1-2. 5小時。
5.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是所述的萃取液優選水飽和後的正丁醇溶液。
6.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是加入稀鹽酸或稀硫酸調節PH至1-5。
7.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是用型號分別為HPD100、HPD300、HPD400、HPD600的大孔樹脂分離提純。
8.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是使用2-5倍大孔樹脂柱體積量的純水洗滌、10%乙醇水溶液洗脫。
9.根據權利要求2所述的從滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性總黃酮的方法， 其特徵是解析溶劑優選為3倍大孔樹脂柱體積量的濃度為60% -90%的乙醇水溶液。
全文摘要
本發明提供了一種具有抗病毒活性的滇柴胡地上部分總黃酮的提取富集方法，其提取步驟為滇柴胡地上部分經過乾燥、提取、濃縮至無醇味、沉降過濾、萃取，二次濃縮至幹、加水溶解並調節pH值沉降過濾、濾液進行柱吸附解析，解析液濃縮乾燥即得滇柴胡地上部分總黃酮。本發明提取富集工藝經過改進後，有選擇性的富集活性成分，去除大量雜質，得到的產品總黃酮的含量超過55％，符合中華人民共和國《藥品管理法》規定的中藥五類新藥的原料標準。同時，本方法的重複性，穩定性好，從而保證了療效的穩定；原料有效成分轉移率高，成本低，操作簡便，適用於工業化生產。
文檔編號A61P31/12GK101972289SQ20101050948
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月18日 優先權日2010年10月18日
發明者楊傑, 梅贊, 毛茜, 王強, 竇潔, 賈貝西 申請人:中國藥科大學