狗膽粉及其在製藥中的應用的製作方法
2023-07-29 00:34:31 3
專利名稱:狗膽粉及其在製藥中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及狗膽粉及其在製藥中的新用途，特別涉及狗膽粉在製備防治肝纖維化的藥物中的應用。
背景技術：
狗膽是犬科動物狗的膽汁，對狗膽的應用《本草綱目》中早有記載，「凡氣血痛及傷損者，熱酒服半個，淤血盡下。治刀箭瘡，去腸中膿水，耵耳出膿，拔白換湯不換黑，血氣攝痛，反胃吐食，痞塊疳積，赤白下痢」。作為藥材民間應用已久，具有清肝明目，止血消腫之功效。近代，狗膽作為一種傳統中藥材被收編於《中藥大詞典》中，但對狗膽的研究、利用甚少。查閱文獻，迄今為止國內外尚未見狗膽在抗肝纖維化方面的研究報導，更沒有發現利用狗膽在製備防治肝纖維化的藥物中的應用。
發明內容本發明的目的在於提供一種狗膽粉及其新用途，尤其是在製備防治肝纖維化的藥物中的應用。
實際上，本發明涉及的一種狗膽粉，通過以下方法步驟製得提供新鮮狗膽囊並取膽汁，經100目篩過濾，在60℃下乾燥，經研磨後再過100目篩，最後消毒。
本發明的狗膽粉涉及在製備防治肝纖維化的藥物中的應用。
為了更好地理解本發明的實質，下面將狗膽粉的藥理實驗及結果來說明其在製藥領域中的新用途。
一、狗膽粉對二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)誘發大鼠肝纖維化的防治作用(一)狗膽粉對二甲基亞硝胺誘發大鼠肝纖維化的抑制作用本實驗用DMN製備大鼠肝纖維化模型，以類似品—熊膽為藥物對照，進一步證明狗膽抑制肝纖維化的作用。
1材料和方法1.實驗動物S-D雄性大白鼠，體重160-180g。
2.試劑及藥物二甲基亞硝胺(DMN)；直接紅(Direct Red 80)；免疫組化單克隆抗體ED1(Serotec.co.uk)和αSMA(Dako，Denmak)。
本發明的狗膽粉；熊膽粉(吉林省延邊熊廠提供的明月山牌)。
3.動物模型製作將60隻動物隨機分為6組，中毒組(10隻)1％DMN(生理鹽水稀釋)1ml/kg連續3天/周，腹腔內注射共4周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。狗膽1、2、3組(每組10隻)1％DMN腹腔內注射，劑量、時間同上，同時用狗膽小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每日灌胃共4周。熊膽組(10隻)1％DMN腹腔內注射，劑量、時間同上，同時用熊膽400mg/kg/d灌胃共4周。對照組(10隻)注射用生理鹽水1ml/kg連續3天/周，腹腔內注射共4周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。實驗第4周末麻醉大鼠，心臟採血離心處理，處死動物後立即取肝臟。
4.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇的測定血清AST、ALT的測定採用Reiman氏方法，血清總蛋白的測定採用Biuret法，血清總膽固醇的測定採用酶法，全部Kit購自Eiken Chemical(Tyoko，Japan)公司，嚴格按Kit說明書進行操作，利用分光光度計(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)測定吸光度，對照標準曲線計算AST、ALT值，總蛋白、總膽固醇含量。
5.病理檢查大鼠肝/體重的檢測處死前測量動物的體重，採血後立即取肝臟稱重量，計算肝/體重百分比。稱重後於肝左葉相同部位取組織二塊，經10％的中性福馬林固定，常規石蠟包埋，切片行H-E、直接紅染色(0.1％直接紅picric acid飽和液)，光鏡下觀察肝組織的病理變化及纖維組織增生程度，。直接紅染色的切片利用CMIAS真彩色病理圖象分析系統(北京航空航天大學)進行膠原纖維的定量分析。觀察條件物鏡10倍，每張切片隨機選4個視野，圖象採集、分割處理，參數統計分析，得出目標總面積/統計場總面積之比值。免疫組織化學染色切片厚4～5μm，常規脫蠟至水，用ABC法進行免疫組織化學染色，ED1工作濃度為1∶500，α-SMA工作濃度為1∶50。
6.統計學處理數據取均值行t檢驗。
2結果1.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇檢測結果見下表1。
表1 各組實驗動物4周後血清生化指標的檢測結果(
)
***與中毒組比較p＜0.001，*與中毒組比較p＜0.052.肝/體重比檢測結果見下表2。
表2 各組實驗動物4周後肝/體重百分比(
)
***與中毒組比較p＜0.0013.肝組織纖維組織增生圖象分析結果見下表3。
表3各組實驗動物4周後肝組織膠原纖維面積密度％(
)
▲▲與中黴組比較P＜0.01，**與熊膽組比較P＜0.01。
4.病理學觀察結果如下對照組肝小葉結構正常，無明顯變性、壞死，個別標本中見門管區內少量炎細胞浸潤。
中毒組肝小葉結構紊亂，肝細胞腫脹、變性，部分肝細胞胞漿濃縮，核深染，可見較多再生的肝細胞，肝細胞灶狀或片狀壞死，門管區內大量纖維組織增生，形成較粗的纖維間隔深入肝組織內，形成瀰漫性假小葉的7/9隻。
熊膽組肝小葉結構紊亂，肝細胞變性，並可見較多的點狀、灶狀壞死，門管區內較多纖維組織增生，形成較細的纖維間隔深入肝組織內，形成瀰漫性假小葉的4/9隻。
狗膽各組肝小葉結構基本正常，肝細胞輕度變性、個別標本中偶見點狀壞死，門管區內纖維組織增生，形成纖細的纖維間隔深入肝組織內，僅有個別動物形成假小葉。狗膽3種不同劑量組之間病理變化及纖維組織增生程度無明顯差異。
免疫組化染色結果對照組ED1+細胞在門管區、肝小葉中央靜脈周圍和肝實質內少量散在分布。α-SMA+細胞在門管區的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達，肝細胞間無陽性細胞分布。中毒組ED1+、α-SMA+細胞在增生的纖維間隔間大量瀰漫分布，肝實質間散在分布。熊膽組ED1+、α-SMA+細胞分布同上，但數量比中毒組減少。狗膽各組ED1+、α-SMA+細胞分布與熊膽組相似，但數量比熊膽組少，狗膽三個不同劑量組兩種陽性細胞的數量相似。
結論DMN是一種具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化學物質，DMN在微粒體代謝後形成乙醛，從而損傷肝細胞，並使核酸和蛋白質甲基化，導致肝細胞壞死。DMN可使肝細胞變性、壞死，4周後形成與人類酒精性肝硬化相似的病理所見，並有停藥後仍維持肝硬化幾個月的特點。
本實驗的血清AST、ALT值和總蛋白的含量檢測結果看，狗膽和熊膽均有較好的降酶及增加血清總蛋白作用，而狗膽的作用優於熊膽，但熊膽組有較好的降低血清膽固醇的作用。本實驗肝/體重比、肝纖維組織的圖象檢測結果，狗膽組與熊膽組比較有顯著差異，狗膽3個組之間纖維組織增生程度無明顯差異；肝組織病理觀察表明，中毒組肝細胞排列紊亂，失去正常結構，肝細胞瀰漫性變性，可見較多灶狀、片狀壞死。熊膽組病變比中毒組輕，但仍可見較多肝細胞變性，可見較多的點狀、灶狀壞死。狗膽組肝細胞輕度變性，偶見點狀壞死。上述結果從病理學角度上進一步證實了狗膽對肝細胞的保護作用。根據本實驗中血清AST、ALT的檢測、肝/體重比、肝纖維組織圖象分析結果及肝組織的病理檢查結果，狗膽粉具有較好的抑制DMN誘發的肝纖維化的作用，其作用優於熊膽。
(二)狗膽粉在對二甲基亞硝胺誘發大鼠肝纖維化的治療作用用1％二甲基亞硝胺腹腔注射4周誘發肝纖維化的模型後進行治療。將60隻大鼠隨機分為狗膽組(3種不同劑量)、熊膽組、中毒組及對照組。觀察各組大鼠肝/體重比、血清AST、ALT值，總蛋白、總膽固醇含量。肝組織標本行直接紅染色，經病理圖象分析系統測定肝組織內膠原纖維的面積。免疫組化採用ABC方法，觀察肝組織內ED1、α-SMA陽性細胞的數量及分布。
1材料和方法1.實驗動物S-D雄性大白鼠，體重160-180g。
2.試劑及藥物(1)二甲基亞硝胺(DMN)；直接紅(Direct Red80)；免疫組化單克隆抗體ED1(Serotec.co.uk)和αSMA(Dako，Denmak)。
(2)本發明的狗膽粉；熊膽粉(吉林省延邊熊廠提供的明月山牌)。
3.動物模型製作將60隻動物隨機分為6組，中毒組(10隻)1％DMN(生理鹽水稀釋)1ml/kg連續3天/周，腹腔內注射共4周，第5周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共3周。狗膽1、2、3組(每組10隻)1％DMN腹腔內注射，劑量、時間同上，第5周開始用狗膽小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每日灌胃共3周。熊膽組(10隻)1％DMN腹腔內注射，劑量、時間同上，第5周開始用熊膽400mg/kg/d灌胃共3周。對照組(10隻)注射用生理鹽水1ml/kg連續3天/周，腹腔內注射共4周，第5周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共3周。實驗第7周末麻醉大鼠，心臟採血離心處理，處死動物後立即取肝臟。
4.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇的測定血清AST、ALT的測定採用Reiman氏方法，血清總蛋白的測定採用Biuret法，血清總膽固醇的測定採用酶法，全部Kit購自Eiken Chemical(Tyoko，Japan)公司，嚴格按Kit說明書進行操作，利用分光光度計(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)測定吸光度，對照標準曲線計算AST、ALT值，總蛋白、總膽固醇的含量。
5.病理檢查大鼠肝/體重的檢測處死前測量動物的體重，採血後立即取肝臟稱重量，計算肝/體重百分比。稱重後於肝左葉相同部位取組織二塊，經10％的中性福馬林固定，常規石蠟包埋，切片行H-E、直接紅染色(0.1％直接紅picric acid飽和液)，光鏡下觀察肝組織的病理變化及纖維組織增生程度，肝纖維化分級分為4級未見明顯纖維間隔形成者為「-」，有纖細的纖維間隔形成，但尚未形成假小葉「+ 」，肝組織部分區域形成假小葉(50％以下)「++」，肝組織內形成瀰漫性假小葉「+++」。
直接紅染色的切片利用CMIAS真彩色病理圖象分析系統(北京航空航天大學)進行膠原纖維的定量分析。觀察條件物鏡10倍，每張切片隨機選4個視野，圖象採集、分割處理，參數統計分析，得出目標總面積/統計場總面積之比值。免疫組織化學染色切片厚4～5μm，常規脫蠟至水，用ABC法進行免疫組織化學染色，ED1工作濃度為1∶500，α-SMA工作濃度為1∶50。
6.統計學處理數據取均值行t檢驗。
2結果
1.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇檢測結果見下表4。
表4 各組實驗動物7周後血清生化指標的檢測結果
2.肝纖維化的分級見表5表5各組實驗動物7周後肝纖維化的分級
3.肝/體重比檢測結果見下表6。
表6 各組實驗動物7周後肝/體重百分比
4.肝組織纖維組織增生圖象分析結果見下表7。
表7 DMN7周狗膽抗肝纖維化的作用
5.病理學觀察結果如下對照組肝小葉結構正常，無明顯變性、壞死，個別標本中見門管區內少量炎細胞浸潤。
中毒組肝小葉結構紊亂，肝細胞腫脹、變性，部分肝細胞胞漿濃縮，核深染，可見較多再生的肝細胞，肝細胞灶狀或片狀壞死，門管區內大量纖維組織增生，形成較粗的纖維間隔深入肝組織內，形成瀰漫性假小葉的6隻。
熊膽組肝小葉結構紊亂，肝細胞變性，並可見較多的點狀、灶狀壞死，門管區內較多纖維組織增生，形成較細的纖維間隔深入肝組織內，形成瀰漫性假小葉的4/8隻。
狗膽各組肝小葉結構基本正常，肝細胞輕度變性、個別標本中偶見點狀壞死，門管區內纖維組織增生，形成纖細的纖維間隔深入肝組織內，僅有個別動物形成假小葉。隨著狗膽劑量的增加病理變化及纖維組織增生程度減輕。
免疫組化染色結果對照組ED1+細胞在門管區、肝小葉中央靜脈周圍和肝實質內少量散在分布。α-SMA+細胞在門管區的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達，肝細胞間無陽性細胞分布。中毒組ED1+、α-SMA+細胞在增生的纖維間隔間大量瀰漫分布，肝實質間散在分布。
熊膽組ED1+、α-SMA+細胞分布同上，但數量比中毒組減少。狗膽各組ED1+、α-SMA+細胞分布與熊膽組相似，但數量比熊膽組少，隨著狗膽劑量的增加兩種陽性細胞的數量減少。
結論本實驗的血清AST、ALT值和總蛋白的含量檢測結果看，狗膽和熊膽均有降酶及增加血清總蛋白作用，但統計學無顯著性差異，而熊膽組有較好的降低血清膽固醇的作用。本實驗肝/體重比、肝纖維組織的圖象檢測結果，狗膽組與熊膽組比較有顯著差異，隨著狗膽劑量的增加差異更顯著；肝組織病理觀察表明，中毒組肝細胞排列紊亂，失去正常結構，肝細胞瀰漫性變性，可見較多灶狀、片狀壞死。熊膽組病變比中毒組輕，但仍可見較多肝細胞變性，可見較多的點狀、灶狀壞死。狗膽組肝細胞輕度變性，偶見點狀壞死。上述結果從病理學角度上進一步證實了狗膽對肝細胞的保護作用。根據本實驗中血清AST、ALT的檢測、肝/體重比、肝纖維組織圖象分析結果及肝組織的病理檢查結果，狗膽具有較好的治療DMN誘發的肝纖維化的作用，作用優於熊膽，隨著劑量的增加其治療效果更好。
二、狗膽對四氯化碳誘發大鼠肝纖維化防治作用本實驗用四氯化碳(CCl4)製備大鼠肝纖維化模型，以類似品熊膽為藥物對照，進一步證實狗膽抗肝纖維化的作用1材料和方法1.實驗動物S-D雄性大白鼠(清潔級)，體重160-180g。
2.試劑及藥物CCl4；直接紅(Direct Red 80)；免疫組化單克隆抗體ED1，單克隆抗體α-SMA；血清ALT、AST、ALP、TP(總蛋白)、TB(總膽紅素)檢測試劑；免疫組化單克隆抗體ED1，單克隆抗體α-SMA。
藥物本發明狗膽粉；熊膽粉(吉林省延邊熊廠提供的明月山牌)。
3.動物模型製作實驗1將46隻動物隨機分為5組，對照組(6隻)注射用生理鹽水1ml/kg/2次/周，腹腔內注射共12周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共12周。中毒組(10隻)50％CCl4(橄欖油稀釋)1ml/kg 2次/周，腹腔內注射共12周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共12周。狗膽組小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每組10隻；50％CCl41ml/kg2次/周腹腔內注射，劑量、時間同上，同時用狗膽小劑量、大劑量每日灌胃共12周。熊膽組(10隻)50％CCl41ml/kg 2次/周腹腔內注射，劑量、時間同上，同時用熊膽400mg/kg/d灌胃共12周。實驗第12周末用乙醚麻醉大鼠，心臟採血離心處理，處死動物後立即取肝臟。
實驗2將46隻動物隨機分為5組，對照組(6隻)注射用生理鹽水1ml/kg/2次/周，腹腔內注射共8周，第9周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。中毒組(10隻)50％CCl4(橄欖油稀釋)1ml/kg 2次/周，腹腔內注射共8周，第9周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。狗膽組小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每組10隻；50％CCl41ml/kg 2次/周腹腔內注射，劑量、時間同上，第9周開始用狗膽小劑量、大劑量每日灌胃共4周。熊膽組(10隻)50％CCl41ml/kg2次/周腹腔內注射，劑量、時間同上，第9周開始用熊膽400mg/kg/d灌胃共4周。實驗第12周末用乙醚麻醉大鼠，心臟採血離心處理，處死動物後立即取肝臟。
4.血清生化指標的檢測血清AST、ALT的測定採用Reiman-Rankel氏方法，ALP採用kind-King法(改良的K-K法)，血清總蛋白採用Biuret法，血清總膽紅素採用Evelyn-Malloy法，嚴格按Kit說明書進行操作，利用分光光度計(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)在490nm測定吸光度，對照標準曲線計算AST、ALT、ALP值，總蛋白、總膽紅素的含量。
5 .病理學檢查(1)大鼠肝/體重比的檢測處死前測量動物的體重，採血後立即取肝臟稱重量，計算肝/體重百分比。
(2)肝組織病理學觀察稱重後於肝左葉相同部位取二塊組織，經10％的中性福馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，切片作H-E染色觀察肝組織病理形態學變化，直接紅染色(0.1％直接紅picric acid飽和液)，觀察肝組織內纖維組織增生程度。
(3)肝纖維化的分級0級無纖維化；I級匯管區纖維組織增生，有纖細的纖維間隔進入肝組織內，形成匯管區-匯管區的纖維間橋。II級在I級的基礎上肝組織可見個別假小葉。III級匯管區纖維組織明顯增生，纖維間隔較粗，肝組織部分區域(50％)形成大的假小葉。IV級匯管區纖維組織大量增生，纖維間隔粗大，肝組織內形成瀰漫性、大小不等的假小葉。
(4)膠原纖維的定量分析直接紅染色的切片利用CMIAS真彩色病理圖象分析系統(北京航空航天大學)進行膠原纖維的定量分析。觀察條件物鏡4倍，每張切片隨機選2個視野，圖象採集、分割處理，參數統計分析，得出目標總面積/統計場總面積之比值。
(5)免疫組織化學染色切片厚4～5μm，常規脫蠟至水，用ABC法進行免疫組織化學染色，ED1工作濃度為1∶100，α-SMA工作濃度為1∶50。
6.統計學處理數據取均值行t檢驗。
結果1.血清生化指標的檢測結果見下表。
實驗1 大鼠血清生化指標檢測結果
ALT熊膽組、狗膽1組與中毒組比較P＜0.01，狗膽2組與中毒組比較P＜0.05。AST熊膽組、狗膽各組與中毒組比較P＜0.01。ALP熊膽組、狗膽各組與中毒組比較ALP值下降，但無統計學意義。TP熊膽組、狗膽2組與中毒組比較P＜0.01，TB熊膽組、狗膽各組與中毒組比較TB值下降，但無統計學意義。
實驗2 大鼠血清生化指標檢測結果
ALT熊膽組與中黴組比較P＜0.05。AST狗膽2組與中毒組比較P＜0.05。ALP熊膽組、狗膽各組與中毒組比較ALP值無統計學意義。TP狗膽各組與中毒組比較P＜0.01，TB熊膽組與中毒組比較P＜0.05。
2.病理學檢查結果(1)大鼠肝/體重比實驗1由於CCl4導致肝細胞瀰漫性脂肪變性，注射CCl4的大鼠肝臟體積增大，重量比對照組明顯增高，中毒組大部分形成瀰漫性肝硬化，大量纖維組織增生，肝臟體積相對縮小，重量減輕，熊膽組與中毒組相似，狗膽組肝/體重比與中毒組和熊膽組比較有顯著性差異，見下表。
實驗1 大鼠肝/體重比(X±SD)
*P＜0.001狗膽組間無顯著性差異實驗2由於CCl4腹腔注射到第8周末，第9周開始停止注射CCl4，第12周末中毒組肝組織內脂肪變性消失，肝纖維化減輕，肝臟重量接近恢復正常，狗膽組肝/體重比略高於中毒組與熊膽組，但統計學上無顯著性差異。
實驗2 大鼠肝/體重比X±SD
(2).肝組織的病理學變化實驗1對照組肝小葉結構正常，以中央靜脈為中心，肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞無變性、壞死，個別標本中門管區內有少量炎細胞浸潤。
中毒組肝小葉結構破壞，肝細胞明顯腫脹，胞漿內可見瀰漫性、大小不等的脂肪空泡，可見點狀、灶狀壞死，門管區內大量纖維組織增生，粗大的纖維間隔深入肝組織內，大部分形成瀰漫性、大小不等的假小葉(5/6)。
熊膽組肝小葉結構紊亂，肝細胞脂肪變性較中毒組輕，門管區內較多纖維組織增生，形成較粗的纖維間隔深入肝組織內，形成大的假小葉(4/6)。
狗膽各組肝小葉結構輕度紊亂，肝細胞輕度脂肪變性，門管區內纖維組織增生，形成纖細的纖維間隔深入肝組織內，個別形成假小葉。
實驗2對照組肝小葉結構正常，以中央靜脈為中心，肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞無變性、壞死，個別標本中門管區內有少量炎細胞浸潤。
中毒組肝小葉結構紊亂，肝細胞脂肪變性消僅見失輕度變性，偶見點狀壞死，門管區內纖維組織增生，纖維間隔纖細，染色淡，細胞成分少，與實驗1組的中毒組比較，肝纖維化開始恢復。
熊膽組肝小葉結構紊亂，肝細胞輕度變性，門管區內纖維組織較中毒組少，纖維間隔纖細，染色淡，細胞成分少。
狗膽各組肝小葉輕度結構紊亂，肝細胞輕度變性，門管區內纖維組織較熊膽組少，纖維間隔纖細，染色淡，細胞成分少。
(3).肝纖維化的分級實驗1中毒組纖維間隔粗大，深入肝組織內，大部分形成瀰漫性、大小不等的假小葉。熊膽組形成較粗的纖維間隔深入肝組織內，大部分形成大的假小葉。狗膽各組纖細的纖維間隔深入肝組織內，個別形成瀰漫性假小葉，見下表。
實驗1 肝纖維化的分級
實驗2中毒組與實驗1中毒組比較肝纖維化減輕，匯管區纖維組織減少，淡染，肝內纖維間隔變細，深入肝組織內，一半形成大的假小葉。熊膽組和狗膽各組形成纖細的纖維間隔深入肝組織內，個別形成大的假小葉，見下表。
實驗2 肝纖維化的分級
(4).膠原纖維面密度實驗1中毒組肝組織內大量纖維組織增生，膠原纖維面密度明顯增高，熊膽組纖維組織增生減少，膠原纖維面密度與中毒組比較有顯著性差異，狗膽組纖維增生明顯減少，與熊膽組比較有顯著性差異，狗膽組間無顯著性差異，見下表。
實驗1 大鼠膠原纖維面密度X±SD
**P＜0.001狗膽組間無顯著性差異實驗2中毒組肝組織內仍有較多纖維組織增生，但比實驗1的中毒組肝纖維化減輕，熊膽組與中毒組比較纖維組織減少，膠原纖維面密度有顯著性差異，狗膽組與熊膽組比較也有顯著性差異，狗膽組間無顯著性差異，見下表。
實驗2.大鼠肝膠原纖維面密度X±SD
**P＜0.001狗膽組間無顯著性差異(5).免疫組化染色結果實驗1ED1對照組ED1+細胞在門管區、肝小葉中央靜脈周圍和肝實質內散在分布。
中毒組ED1+細胞在匯管區增生的纖維組織及纖維間隔內大量分布，肝實質內明顯增多。
熊膽組ED1+細胞在匯管區增生的纖維組織、纖維間隔及肝實質內分布。但其數量較中毒組少。
狗膽各組ED1+細胞分布同上，但數量比熊膽組少，隨著狗膽劑量的增加ED1+細胞的數量減少。
α-SMA對照組α-SMA+細胞在門管區的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達，肝細胞間無陽性細胞分布。中毒組α-SMA+細胞在匯管區增生的纖維組織、纖維間隔內大量分布，且靠近肝細胞分布。熊膽組α-SMA+細胞分布同上，但數量比中毒組減少。
狗膽各組α-SMA+細胞分布與熊膽組相似，但數量減少。除了對照組，中毒組、熊膽組及狗膽組大鼠間匯管區增生的纖維組織及纖維間隔內α-SMA陽性表達是不均勻的。
實驗2ED1對照組ED1+細胞在門管區、肝小葉中央靜脈周圍和肝實質內散在分布。中毒組ED1+細胞在匯管區增生的纖維組織及纖維間隔內大量分布，肝實質內明顯增多。熊膽組ED1+細胞在匯管區增生的纖維組織、纖維間隔及肝實質內分布。但其數量較中毒組少。狗膽各組ED1+細胞分布同上，但數量比熊膽組少。
α-SMA對照組α-SMA+細胞在門管區的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達，肝細胞間無陽性細胞分布。
中毒組α-SMA+細胞分布同上，匯管區增生的纖維組織及纖維間隔內無陽性細胞表達。
熊膽組及狗膽各組α-SMA+細胞分布同上，匯管區增生的纖維組織及纖維間隔內無陽性細胞表達。
結論CCl4是經典肝毒性物質，在體內形成Free radical，產生脂質過氧化，並影響細胞內鈣離子濃度，從而損傷肝細胞，CCl4可直接損傷肝臟，引起肝細胞脂肪變性、中央靜脈周圍肝細胞壞死，長期慢性中毒可導致肝纖維組織增生，形成肝纖維化及肝硬化。在動物實驗中單投CCl46周可形成肝纖維化，12-15周可發生肝硬化，目前CCl4誘發的肝纖維化、肝硬化動物模型仍被廣泛應用，但此模型一旦停止攻擊可以恢復。
本實驗的血清AST、ALT值和總蛋白的含量檢測結果看，狗膽和熊膽均有較好的降酶及增加血清總蛋白作用，而狗膽的作用優於熊膽，但熊膽有較好的降低血清膽固醇的作用。肝/體重比、肝纖維組織的圖象檢測結果，實驗1的狗膽組與熊膽組比較有顯著差異，狗膽組間無明顯差異；肝組織病理觀察表明，中毒組肝組織的正常結構破壞，肝細胞瀰漫性脂肪變性，脂肪空泡大小不一，可見散在的灶狀、片狀壞死。熊膽組病變比中毒組輕，但仍可見較多肝細胞脂肪變性，可見點狀、灶狀壞死。狗膽組肝細胞輕度脂肪變性，偶見點狀壞死。肝纖維化的分級結果看中毒組匯管區大量纖維組織增生，並形成粗大的纖維間隔，絕大多數形成瀰漫性肝硬化(5/6)，熊膽組肝纖維化與中毒組比較減輕，而狗膽組僅有個別形成瀰漫性肝硬化。實驗2停止攻擊4周後肝組織內無脂肪變性，肝重量恢復接近正常，狗膽組肝/體重比略高於中毒組，但統計學上無顯著性差異。除了對照組，中毒組肝纖維化減輕，但仍可見纖維間隔尚未完全恢復，纖維組織的圖象檢測結果中毒組仍有較多的纖維組織，熊膽組與中毒組比較纖維組織有顯著性差異，狗膽組與熊膽組比較也有顯著性差異。肝組織病理觀察表明，中毒組肝組織結構紊亂，肝細胞輕度變性，膠原纖維淡染，自然吸收一部分，纖維間隔變細，纖維化程度減輕，但仍有一半形成大的假小葉，而熊膽組和狗膽組肝纖維化比中毒組輕，僅有個別形成大的假小葉。上述結果從病理學角度進一步證實了狗膽抗肝纖維化的作用。根據本實驗中血清AST、ALT檢測、肝/體重比、肝組織的病理變化、肝纖維化的分級、肝纖維組織定量分析結果，狗膽具有良好的預防和治療CCl4誘發大鼠肝纖維化的作用，其作用優於熊膽。
具體實施方式實施例1狗膽粉通過以下方法步驟製得提供新鮮狗膽囊並取膽汁，經100目篩過濾，在60℃下乾燥，經研磨後再過100目篩，最後用紫外線消毒30分鐘。在無菌條件下，把狗膽粉裝入膠囊，每粒膠囊0.25g，包裝10粒/板，一盒4板。用法及用量一次1-2粒、一日2次，口服。
實施例2狗膽粉的製備方法同實施例1，製備的狗膽粉與蟲草菌絲、丹參等重量配製膠囊，每粒膠囊0.25g，包裝10粒/板，一盒4板。用法及用量一次1-2粒、一日2次，口服。另外，狗膽粉也可與其它具有抗肝纖維化作用的中藥材等量配製複方製劑膠囊，提高防治肝纖維化的效果。
權利要求
1.一種狗膽粉，通過以下方法步驟製得提供新鮮狗膽囊並取膽汁，經100目篩過濾，在60℃下乾燥，經研磨後再過100目篩，最後消毒。
2.狗膽粉在製備防治肝纖維化的藥物中的應用。
專利摘要
本發明公開了一種狗膽粉，通過以下方法步驟製得提供新鮮狗膽囊並取膽汁，經100目篩過濾，在60℃下乾燥，經研磨後再過100目篩，最後消毒。本發明還公開了狗膽粉的新用途，即狗膽粉在製備防治肝纖維化的藥物中的應用，尤其是狗膽粉在製備對狗膽粉在對二甲基亞硝胺誘發大鼠肝纖維化藥物的防治作用；狗膽粉在製備對四氯化碳誘發大鼠肝纖維化藥物的防治作用。
文檔編號A61K9/14GK1994325SQ200610016505
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日
發明者樸東明 申請人:樸東明導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan