竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用的製作方法

2023-07-28 06:09:46

專利名稱：竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域。本發明涉及一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用。具體地說是具有抗菌、抑菌、抗炎、抗前列腺增生、抗血小板聚集、抗腫瘤和免疫促進等作用的竹葉總黃酮作為前列腺疾病防治的天然藥物或膳食補充劑在藥品及保健食品中的應用。
背景技術：
隨著21世紀全球進入老齡化社會，疾病譜和醫療模式均發生了重要的變化，加上合成藥物帶來的藥害及傳統藥物療法在世界各地開展後取得的明顯成效，都為天然藥物的發展帶來了良好的機遇，現在全世界對傳統醫學都開始進行重新認識，對天然藥物「維護健康」或者「預防及治療」都有很高的期待。安全、無副作用、作用溫和、具有適應多樣性的天然藥物製劑將是對慢性病特別是多臟器疾病的老年患者最理想的藥物。在這個意義上說，21世紀將是天然藥物的時代。
近20年來，前列腺疾病呈上升和年輕化趨勢，已成為威脅男性健康的常見病。前列腺疾病主要為前列腺炎和前列腺增生，前列腺癌也日漸增多。
前列腺炎症候群(Prostatitis Sysndrome，PS)是舉世公認的醫療頑症，有「不是癌症的不治之症」之稱。PS是男性泌尿系統的常見病、多發病，佔泌尿外科門診的25％。我國的發病率為24.3％，國外文獻報導為35％～98％。兩個患病年齡高峰分別為30～39歲和60～69歲。1990年Bennett等報導美國的發病率為73％，每年約有200萬患者，主要以前列腺急性炎症和慢性炎症混合型為主，而我國以多灶慢性炎症為主。50％的男性一生中某個時期會受到PS的影響[CollinsMM et al.How common is prostatitis？A national survey of physician visits.J Urol1998；1591224-1228；何樂業.前列腺炎綜合症.中華泌尿外科雜誌2000，21(11)697-699；Roberts RO et al.A review of clinical and pathological prostatitissyndromes.Urology 1997；49809-821]。
臨床上通常將PS分為四類急性細菌性前列腺炎(ABP)、慢性細菌性前列腺炎(CBP)、慢性非細菌性前列腺炎(NCP)和前列腺痛(PD)。其中ABP和CBP大約佔5％，NCP佔64％，PD佔31％[Gerald JD et al.Prostatitis.Clin Microbiol Rev1998；11(4)604-613]。可見，慢性非細菌性前列腺炎(NCP)佔了PS病例的大部分。PS病因、病理複雜，目前的研究認為其發生、發展與病原微生物感染、前列腺內尿液返流(IPUR)、機體和局部組織的免疫功能等多種因素密切相關，但確切的發病機理尚不清除。
目前臨床上沒有一種抗菌藥物能對PS產生良好的治療效果。一是由於前列腺解剖位置特殊，有利於尿道中的細菌進入腺體，不利於腺體引流，致使炎性分泌物易瀦留而不易排出；二是前列腺組織結構特殊，前列腺上皮有脂膜存在，抗菌藥物不易自血漿彌散入前列腺腺泡，且受前列腺液pH值的影響，要達到腺體內有效的殺菌、抑菌濃度，需具有一定的脂溶性、離解常數高、與血漿蛋白結合率低、毒性低，且能較長時間服用的藥物，而目前臨床上運用的抗菌藥尚不具備這些特點。前列腺本身的病理改變，病灶周圍易纖維化，又常影響抗菌藥物向病灶擴散。目前市場急需治療PS的特效藥物[李衛真主編.前列腺病中醫診療學.北京北京科學技術出版社1996.p181，186]。
在PS的治療中抗生素是最常用的，如5-氟喹諾酮、磺胺類、四環素或紅黴素等，用藥時間長達8～10周，慢性PS停用抗生素後易復發。非細菌性PS一般無需使用抗生素。目前臨床使用許多抗生素結合局部治療方法，如輸精管內注射、前列腺內局部注射、前列腺周圍注射、前列腺周圍封閉等，也有一定的療效，但不能根治慢性PS。由於不少人合併有多種感染(同時感染衣原體、支原體、黴菌滴蟲、葡萄球菌、耐藥淋球菌等)，而目前的許多抗菌素難以同時對付這幾種病原體，聯合大劑量用藥對臟腑危害甚大，服用大劑量抗菌素後易導致中毒性肝炎、中毒性腎炎和胃腸功能損傷。腺體內注射所選取的藥物也並不能同時殺滅幾種病原體，同時由於多次注射對腺體內腺管的機械性損傷所造成的硬結粘連可能給患者造成永久傷害，給最後的治療帶來極大的困難和無可挽救的後遺症。
α-受體阻滯劑，如鹽酸坦索羅新(Tamsulosin)和多沙唑嗪(Doxazosin)，能降低後尿道壓力，緩解TPUR，改善慢性PS患者的症狀，與抗生素合用效果更佳。多沙唑嗪可以作為NCP的一線用藥，同時也可輔助治療CBP。非甾體抗炎劑如布洛芬能暫時改善疼痛症狀，減輕炎症。別嘌呤醇能降低全身及前列腺中尿酸濃度，清除活性氧自由基，減輕炎症，緩解疼痛。另外，服用抗膽鹼藥Oxybutinin、橫紋肌鬆弛劑Diazepam、花粉提取物Cenilton(舍尼通)和口服鋅劑均可能對某些PS病例有效[何樂業.前列腺炎綜合症.中華泌尿外科雜誌2000，21(11)697-699；許明等.舍尼通和抗菌藥物在慢性非細菌性前列腺炎中治療作用比較.上海醫科大學學報2000；27(6)497-498]。
前列腺增生(BPH)是老年男子常見的前列腺疾病之一。據目前統計結果表明，本病始發於40歲，高發於50～70歲。國外一組屍檢結果表明，50歲以上男子半數以上有BPH，年逾70歲者發病數增至75％。我國過去發病年齡似較歐美各國要晚10年，但近年來呈上升趨勢。除平均壽命延長外，還與飲食水平改善、大量菸酒及壯陽物品的刺激等多方面因素有關。
前列腺癌(PC)是歐美國家常見的男性惡性腫瘤。在美國發病率佔第一位，年死亡病例超過35,000，僅次於肺癌[Parker SL，Tong T，Bolden S，et al.CancerStatistics.CA Cancer J Clin，1997；475-27]。我國PC的發病率雖遠低於西方國家，但隨著經濟水平的提高，生活方式的改變和人均壽命的延長，男性病人中PC的發病率日益增多，發病年齡也趨向年輕化，已成為威脅我國老年男性生命的重要疾病[馬騰驤.男性生殖系腫瘤.中華泌尿外科雜誌，1999；20(9)521-522]。據統計，我國PC的發病率已由50年代的0.2/10萬人口升至90年代的1.2～3.4/10萬人口，現已排在泌尿系腫瘤的第三位[劉耀庭，李秀霞，程偉.泌尿外科腫瘤發病情況的變化.臨床泌尿外科雜誌，1997；1247]。
東西方國家間PC發病率的差異，已引起醫學家和營養學家的高度重視，紛紛進行涉及面很廣的研究，但至今真正發病機制仍不甚清楚，尚屬探索階段。PC的病因很複雜，年齡、遺傳因素和環境因子均可影響PC的發生。流行病學資料顯示，飲食和環境因素可能比遺傳因素在PC的發生中起更重要的作用[郭應祿主編。前列腺增生及前列腺癌症。北京人民衛生出版社1998；141-143]。在PC發病較低的東方人的食物中含有大量的水果和蔬菜。然而，這種神奇的食物成分至今還沒有確定下來[夏同禮編.前列腺癌的基礎與臨床.北京科學出版社，2000；p331]。目前雖有外科手術、激素、化學治療藥物等多種治療方法，但無一種方法能顯著提高PC患者的存活率，而且一旦診斷明確，大多已失去手術時機。因此尋求天然化學預防劑(尤其是植物化學素)用於膳食幹預，減少或緩慢PC的進展具有重要意義。
流行病學資料和臨床研究發現，番茄製品的消費可以明顯降低PC的危險性。對14,000名男性宗教人士進行了6年隨訪研究，發現每周食用5次以上番茄紅素，則忠PC的危險性明顯下降[Mills PK，Beeson WL，Phillips RL，et al.Cohortstudy of diet，life style and prostate cancer in Adventist men.Cancer，1989；64598-604]。哈佛公共衛生學院營養研究室[Giovannucci EL，Ascherio A，Rimm EB，et al.Intake of carotenoids and retinol in relationship to risk of prostate cancer.J NatlCancer Inst，1995；871767-1776]在1986～1992年間對美國48,000名醫務人員進行的隨訪研究也證實，攝入大量富含番茄紅素的製品與PC危險性呈負相關。
中醫學將前列腺疾病歸入「淋濁」、「白濁」、「勞淋」、「隆閉」等範疇。中醫臨床辯證分型論治溼熱久蘊者，治宜清熱解毒，利溼通淋；陰虛火旺者，治宜滋陰清熱，利溼導濁；腎氣不足者，治宜補腎固精，佐以利溼導濁；氣滯血瘀者，治以活血化瘀，行氣導滯[陳武山編著.前列腺與精囊疾病.科學技術文獻出版社200176]。中醫各家對前列腺疾病的辯證分型各不相同，因而用藥也無雷同，目前的研究大多缺乏隨機對照、嚴謹的臨床觀察和療效評價，限制了中醫藥在治療前列腺疾病中的應用。
由於前列腺組織的特殊解剖結構，腺管狹長，尿道病原菌進入後，不易隨分泌物排除和清除。前列腺～血液之間的屏障作用，藥物不易透過前列腺上皮脂膜進入腺體，在腺體中難以達到有效濃度。延誤治療和對抗菌素的耐藥導致慢性炎症，而慢性炎性病變又使官腔狹窄，纖維組織增生，細菌長期滯留在前列腺組織內，形成慢性病灶，以至治癒率極低，復發率極高。另一方面，目前對慢性PS的病因及發病機制的認識不夠，臨床表現易與前列腺增生和前列腺癌的症狀重疊，造成臨床診斷的困難和不確定性，慢性PS至今缺乏合理有效的治療方法和藥物。2000年10月的NIH-IPCN會議建議對慢性PS治療，以抗生素、α-受體阻滯劑、抗炎藥物為第一線治療，理療(包括微波)、植物製劑為第二線治療，保列治、聚硫酸酯戊糖酸為第三線治療[唐孝達.慢性前列腺炎診斷與治療進展.中國男科學雜誌2002；16(3)193-196]。
衛生部制定的中藥新藥臨床指導原則將慢性PS分為溼熱下注、氣滯血瘀、肝腎陰虛、腎陽虛症等4個主要症型。中成藥前列腺丸、茴香橘核丸、六味地黃丸、腎氣丸、野菊花栓等均可不同程度地緩解前PS症狀。現代研究證實，丹參、牛膝、王不留行等活血化瘀藥能消除病灶部位水腫，解除炎性梗阻，暢通前列腺管，使纖維組織軟化，局部血行增加，從而使藥物易達病灶，提高有效藥物濃度；敗醬草、生薏苡仁等化溼解毒藥具有抗菌、清除炎性病灶、促進炎性分泌物排除、提高免疫功能、促進組織修復的作用。中西藥的聯合使用可起到事半功倍的效果[賈金銘等.前列腺炎的治療.中國中西醫結合雜誌2002；22(3)217-220]。
根據PC的發病年齡多在50歲以上，及前列腺解剖位置的特殊性，中醫認為，PC的發生主要是正氣不足，溼熱邪毒侵襲，日積月累，引起機體陰陽失調、臟腑功能障礙、氣血運行障礙，而致瘀血、痰濁、邪毒等相互交結，形成腫瘤[陳武山編著.前列腺與精囊疾病.北京科學技術出版社，2001，pp180-182，74-75]。根據PC的病機轉變及症情的虛實變化，早期邪毒蘊積，治以清熱解毒為主；中期痰瘀互結，治以化痰軟堅、祛瘀散結為法；晚期正氣消殘，氣血陰陽皆虛，治以補益氣血、滋陰和陽為要。根據臨床實際，常用的內治法主要有清熱、祛溼、活血化瘀、補益、瀉下、理氣、化飲祛痰和固澀法[李衛真主編.前列腺病中醫診療學.北京北京科學技術出版社1996.pp181，186]。
(淡)竹葉是常用方劑中的一味清熱、解毒、利尿藥，如《濟生方》中的小薊飲子等。據《中藥大辭典》記載，淡竹葉功用主治清熱除煩，生津利尿；治熱病煩渴，小兒驚癇，咳逆吐血，面赤，小便短赤，口糜舌瘡等。1998年(淡)竹葉被列入了「藥食兩用」的天然物名單。近年來的研究表明，以淡竹[Phyllostachys nigra var.hnonis(Bean)Stepf ex Rendle]為代表的剛竹屬的竹葉中含有大量的黃酮、內酯、酚酸、蒽醌、多糖、特種胺基酸、芳香成分和錳、鋅、硒等微量元素，具有多重生理和藥理活性。
我國素有「竹子王國」之稱，擁有十分豐富的竹類資源和源遠流長的竹文化。境內有竹類40多屬400餘種，竹林面積約400萬ha。據不完全統計，我國有1億多人口全部或部分從竹林和竹林產品加工中獲取生活費用。竹類植物作為森林資源的重要組成部分，不僅有著較高的經濟價值，而且具有廣泛的生態與社會效益。竹子以其獨特的生物學、生態學及多用途等特點，日益受到人們的重視，在中國可持續發展戰略中正發揮著越來越重要的作用。
我國在竹子有效成分的研究和開發方面處於國際領先水平。竹葉提取物是張英等於20世紀90年代開發的一種植物類黃酮製劑，其發明專利「一種添加竹葉黃酮提取物的保健啤酒(ZL 98 1 04563.4)」和「從竹葉中提取黃酮類化合物浸膏或粉劑的生產方法(ZL 98 1 04564.2)」分別於2000年和2001年獲得國家專利局的授權。大量的研究表明，竹葉黃酮具有優良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保護心腦血管、防治老年退行性疾病等生物學功效。並以其豐富的原料來源、明確的功能因子、令人信服的安全性、高效穩定的製劑品質和清新甜香的竹子風味，近年來在功能性食品和醫藥保健品領域嶄露頭角[張英，天然功能性添加劑——竹葉提取物，精細與專用化學品，2002，10(7)20～22]。
竹葉總黃酮的功能因子主要是C-糖苷黃酮，四種主要的竹葉碳苷黃酮分別是葒草苷(Orientin)、異葒草苷(Homoorientin)、牡荊苷(Vitexin)和異牡荊苷(Isovitexin)。碳苷黃酮與氧苷黃酮相比，具有以下幾方面的突出優點(1)結構穩定，不易被降解；(2)能深入病灶部位，直接發揮療效；(3)親水性增強，有利於藥品、食品、化妝品的開發。國際學術界從90年代起開始關注碳苷黃酮，此領域屬最新的研究前沿。
黃酮類化合物(Flavonoids)廣泛分布於瓜果、蔬菜、茶葉、大豆及其製品中，且足許多中草藥的有效成分。天然來源的生物黃酮，分子量小，能被人體迅速吸收，能透過血腦屏障。目前對其生理作用的研究主要集中在抗自由基活性，抗氧化活性，與癌症的相關性，與內分泌的關係，抗菌、抗病毒作用，類雌激素活性等。但迄今為止，罕見有關黃酮類化合物與前列腺病理直接相關的公開報導，尤其是無任何有關竹葉黃酮對前列腺的生理和藥理活性的研究報告。

發明內容
本發明的目的是提供一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用。
竹葉總黃酮應用於防治前列腺疾病的藥物及保健食品產品中。
本發明的優點是提供了一種來源廣闊、安全有效、經濟適用的植物提取物——竹葉總黃酮(EOB-f)，對其與前列腺病理相關的特性進行了系統研究，表明其具有顯著的抗菌、抗炎、抗前列腺增生、抗血小板聚集、抗腫瘤和免疫促進等作用；先前的大量研究已表明，其具有優良的抗自由基、抗氧化、抗輻射、保護心腦血管等生理和藥理活性，安全、無毒，長期使用無副作用；且性能穩定，風味清香，可以製成各種不同的劑型，並可與多種藥品和食品體系複合，使用方便，尤為適合於前列腺疾病這類多靶點的老年慢性退行性疾病的防治。


圖1是竹葉總黃酮(EOB-f01)的HPLC譜圖(示4種主要的碳苷黃酮)；圖2是竹葉總黃酮(EOB-f01)的紅外譜圖(經溴化鉀壓片)；圖3是竹葉總黃酮(EOB-f01)的紫外譜圖(溶於光譜純的甲醇)；圖4是正常大鼠前列腺組織病理學切片圖；圖5EOB-f01劑量為400mg/kg時大鼠的前列腺炎組織病理學切片圖；圖6EOB-f01劑量為200mg/kg時大鼠的前列腺炎組織病理學切片圖；圖7模型組(角叉菜膠)大鼠前列腺炎組織病理學切片圖。
具體實施方法張英及其合作者在先前研究的基礎上，近年來又對竹葉總黃酮(EOB-f)與前列腺藥理相關的功能進行了系統研究，歸納如下。
1抑菌作用1.1菌株來源糞腸球菌(E.faecalis)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、普通變形桿菌(P.vulgaris)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)來自浙江省人民醫院臨床泌尿生殖道標本中，實驗前3個月內分離所得。標準菌種金黃色葡萄球菌S.aureus(ATCC25923)、大腸埃希菌E.coli(ATCC25922)由浙江省臨床檢驗中心提供。
1.2竹葉總黃酮試樣產品代碼EOB-f01，標準總黃酮糖苷含量≥50％，實測值為56.7％，為凍幹的棕褐色結晶樣粉末，由杭州浙大力夫生物科技有限公司提供。置乾燥器內儲存，臨用時以蒸餾水配製，超聲波助溶。
1.3實驗方法參照《中華人民共和國衛生部醫政司全國臨床檢驗操作規程》第二版有關內容進行。
1.4結果一般認為感染因素在急、慢性細菌性前列腺炎的發病中佔主導地位，但隨著病因學研究的深入，表明慢性非細菌性前列腺炎也與細菌感染有關。目前已證明細菌性前列腺炎的革蘭氏陰性致病菌以大腸桿菌為主，還有變形桿菌、綠濃桿菌、克雷伯氏菌等，革蘭氏陽性致病菌以金黃色葡萄球菌為主，另有表皮葡萄球菌、化膿性鏈球菌、淋球菌等。申請者選用了七種常見泌尿系統致病菌進行體外抑菌試驗，結果表明，EOB-f01對上述細菌均有不同程度的抑制作用，見表1。
表1 EOB-f01對常見泌尿系統致病菌的抑制作用

2抗炎作用2.1對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響小鼠按體重隨機分成5組，每組12隻，設置如下①空白對照組等體積生理鹽水，0.8mL/20g；②陽性對照組消炎痛10mg/kg；③高劑量組10mg/mL的EOB-f01，劑量為400mg/kg；④中劑量組5mg/mL的EOB-f01，劑量200mg/kg；⑤低劑量組2.5mg/mL的EOB-f01，劑量100mg/kg。動物每天ip給藥1次，連續7d(消炎痛僅給藥1次)，末次給藥後1h，小鼠右耳塗2％巴豆油0.02mL/只、致炎，4h後處死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm環鑽衝下左右耳片，稱重，以左右耳片重量之差值作為腫脹率。
實驗結果表明，小鼠灌胃給予200mg/kg和400mg/kg劑量的EOB-f01連續7d後，對巴豆油所致的耳廓腫脹具有顯著(p＜0.05)和極顯著(p＜0.01)的抑制作用，並呈明顯的劑量依賴關係(表2)。
表2 EOB-f01對小鼠巴豆油所致耳廓腫脹的影響(X±SD)

*p＜0.05，**p＜0.01，與對照組相比。
2.2對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響小鼠按體重隨機分成5組，每組10隻，設置同2.1。動物每天ig給藥1次，連續7d(消炎痛僅給藥1次)，末次給藥後30min，小鼠右耳塗二甲苯0.05mL/只、致炎，15min後處死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm環鑽衝下左右耳片，稱重，以左右耳片重量之差值作為腫脹率。並與對照組比較，判斷療效。
表3 EOB-f01對小鼠二甲苯所致耳廓腫脹的影響(X±SD)


*p＜0.05，**p＜0.01，與對照組相比。
表3顯示，小鼠灌胃給予400mg/kg劑量的EOB-f01連續7天後，對二甲苯所致耳廓腫脹具有顯著(p＜0.05)的抑制作用，中、低劑量時作用不明顯。
2.3對角叉菜膠所致大鼠前列腺炎的影響SD雄性大鼠，體重204～252g，按體重隨機分成7組，每組10隻(1)對照組1mL/100g的等體積生理鹽水；(2)模型組1mL/100g的等體積水；(3)吲哚美辛組12mg/kg(1.2mg/mL)；(4)高劑量組EOB-f01 400mg/kg(40mg/mL)；(5)中劑量組EOB-f01 200mg/kg(20mg/mL)；(6)低劑量組EOB-f01 100mg/kg(10mg/mL)。大鼠每天ig給藥1次，連續7d(吲哚美辛僅手術前給藥1次)，末次給藥後0.5h，開始手術。
大鼠用乙醚麻醉後，仰位固定，腹部剪毛，用碘酊和乙醇消毒，在無菌條件下，腹部正中切開約1.5cm，暴露前列腺腹葉，以4.5號針頭向(2)～(6)組大鼠的前列腺腹葉注射1％角叉菜膠生理鹽水溶液0.02mL/只，立即將前列腺回納腹腔，在腹腔內加1滴青黴素後，即刻雙層縫合腹腔。對照組(1)以生理鹽水0.02mL/只代替角叉菜膠，進行假手術處理。手術後4h，處死大鼠，解剖分離前列腺各葉，稱取溼重，比較給藥組與模型組之間前列腺腫脹的程度。取大鼠前列腺腹葉，以10％福馬林固定，常規脫水，石蠟包埋切片，HE染色，在電子顯微鏡下觀察病理變化。
各組大鼠前列腺組織病理觀察標準①間質水腫或血管充血程度評分間質無水腫或血管充血為0分，間質輕度水腫或血管充血為1分，間質中度水腫或血管充血為2分，間質嚴重水腫或血管充血為3分；②炎症細胞浸潤程度評分間質無炎症細胞浸潤為0分，間質少量炎症細胞浸潤為1分，間質中量炎症細胞浸潤為2分，間質多量炎症細胞浸潤為3分，間質瀰漫性炎症細胞浸潤為4分。
實驗顯示，角叉菜膠致炎4h後，大鼠前列腺發生嚴重水腫，炎症明顯。經統計分析，模型組與對照組相比，前列腺腹葉的重量增加極其顯著(p＜0.001)，對前列腺背葉和側葉重量的影響無統計學意義(p＞0.05)。EOB-f01高、中、低劑量組和吲哚美辛組與模型組相比，明顯抑制了前列腺腹葉重量的增加(p＜0.001、(p＜0.01、p＜0.05、p＜0.01)，並呈顯著的劑量依賴關係；而對背葉和側葉的影響無統計學意義(p＞0.05)，見表4。
表4 EOB-f01對角叉菜膠所致大鼠前列腺重量的影響(X±SD)

###p＜0.001，與空白對照相比；***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，與模型組相比。
大鼠前列腺腹葉病理組織學研究顯示，對照組前列腺組織正常，呈分葉狀，腺上皮大多單層柱狀，有刷狀緣，部分腺上皮呈乳頭狀增生；部分腺體內見淺紅色分泌物，腺體之間少量間質，間質內均未見炎症改變和纖維增生；模型組、EOB-f01各試驗組、吲哚美辛組腹葉組織結構類似與對照相比，腺上皮略增高，呈復層狀；腺體稍增生，或部分腺上皮乳頭狀增生；間質血管擴張或水腫，伴中性粒細胞瀰漫性或多量到少量浸潤，間質內未見纖維增生，顯示為無菌性間質炎症。其中EOB-f01各試驗組與對照相比，炎症程度顯著減輕。組織病理學觀察數據的評分統計結果見表5，相應的病理切片見附圖4～7。
表5 EOB-f01對角叉菜膠所致大鼠前列腺腹葉炎症的組織病理學觀察(X±SD)

###p＜0.001，與空白相比；**p＜0.01，*p＜0.05，與模型組相比。
3抗前列腺增生作用ICR小鼠，雄性，體重18-21g，按體重隨機分成7組，每組10-11隻①對照組0.8mL/20g的等體積水ig；②模型組0.8mL/20g的等體積水ig；③雌二醇組0.5mg/kg的雌二醇sc，每3天1次，共5次；④高劑量組EOB-f01 400mg/kgig；⑤中劑量組EOB-f01 200mg/kg ig；⑥低劑量組EOB-f01 100mg/kg ig。每天給藥1次，連續14d。除對照組①外，②～⑥各組5mg/mL的丙酸睪丸素每日sc，連續14d。第15天，處死小鼠，解剖，稱取前列腺腹、側、背各葉的重量，評價EOB-f01抗前列腺增生的作用。
結果顯示，模型組小鼠給予丙酸睪丸素後前列腺腹、側、背葉重量增加，增生明顯，與對照組相比有顯著的統計學意義。EOB-f01各給藥組與模型組比較，高、中劑量組對小鼠前列腺腹葉增生有明顯抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)，但對其他各葉的影響無統計學意義(p＞0.05)；而雌二醇對小鼠前列腺各部位的增生均有顯著的抑制((p＜0.001，p＜0.01)，見表6。
表6 EOB-f01對丙酸睪丸素所致小鼠前列腺增生的影響(X±SD)組別劑量 n前列腺重量(mg_(mg/kg) (只) 腹葉 側葉 背葉空白對照-- 107.6±2.1 14.1±5.2 5.8±1.6模型組 51011.3±2.8##23.6±6.2##7.8±1.8#雌二醇組5+0.5107.0±1.7***15.1±2.7*** 5.1±1.6**高劑量組5+400118.1±2.1** 22.7±4.9 6.5±1.5中劑量組5+200108.5±1.9* 23.9±6.28 6.2±2.1低劑量組5+100109.1±1.5 22.4±6.0 6.8±2.0##p＜0.01，#p＜0.05，與空白對照相比；***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，與模型組相比。
前列腺增生是老年男性的常見病，流行病學研究已證明前列腺增生僅發生於有正常睪丸功能的老年期，其發病機制尚未完全闡明。大多數學者認為，性激素平衡失調或有關激素分泌失調是其病變的主要基礎。雄激素的存在是前列腺生長發育的基礎，也是其增生的重要原因；而雌激素低劑量時促進前列腺基質細胞的增殖、高劑量則抑制其增殖。EOB-f01在高、中劑量時對幼年小鼠前列腺腹葉的生長有明顯的抑制作用，但不影響幼年小鼠儲精囊、提肛肌和睪丸的生長，提示EOB-f01可能對前列腺有直接作用。同時，EOB-f01對丙酸睪丸素所致小鼠前列腺腹葉增生的抑制作用，顯示其對性激素引起的前列腺增生也有作用。
4對幼年小鼠前列腺及附性器官生長的影響ICR幼年雄性小鼠，體重10～12g，按體重隨機分組，每組10～11隻①對照組0.8mL/20g的等體積水ig；②雌二醇組0.5mg/kg的雌二醇sc，每3天1次，共5次；③高劑量組EOB-f01 400mg/kg ig；④中劑量組EOB-f01 200mg/kgig；⑤低劑量組EOB-f01 100mg/kg ig。小鼠每天給藥1次，連續14d。第15天，處死小鼠，解剖並稱取前列腺腹、側、背各葉及儲精囊、睪丸、提肛肌的重量。結果顯示，EOB-f01高、中劑量組對幼鼠前列腺腹葉的生長有明顯的抑制作用(p＜0.05)，但對側葉和背葉的影響不明顯(p＞0.05)；而雌二醇對幼鼠前列腺各葉的生長均有明顯的影響(p＜0.001)，見表7。
表7 EOB-f01對幼年小鼠前列腺生長的影響(X±SD)

***p＜0.001，*p＜0.05，與空白對照組相比。
除EOB-f01高劑量組使幼鼠儲精囊重量顯著減輕外(p＜0.01)，其他各組對幼鼠儲精囊、睪丸、提肛肌的重量無明顯影響(p＞0.05)；而雌二醇對幼鼠儲精囊、睪丸、提肛肌的生長均有顯著的抑制作用(p＜0.01)，見表8。
表8 EOB-f01對幼鼠儲精囊、睪丸、提肛肌生長的影響(X±SD)組別 劑量 n 睪丸 儲精囊 提肛肌(mg/kg) (只)(mg) (mg) (mg)空白對照 11 151.3±28.234.1±11.3 42.5±10.6雌二醇組0.510 58.0±12.8*** 7.3±2.5*** 14.1±3.3***高劑量組40010 140.0±30.920.5±8.8** 35.6±8.3中劑量組20011 158.9±14.133.5±12.0 47.1±12.8低劑量組10010 141.4±14.833.9±10.8 43.4±11.5
***p＜0.001，*p＜0.01，與空白對照組相比。
5抗血小板聚集作用2001年，申請者又委託瀋陽藥科大學對EOB-f01抗血小板聚集作用進行了試驗。由表9及表10可以看出無論是體內還是體外，EOB-f01均具有明顯的抗家兔血小板聚集的作用，與陰性對照組比較差異顯著，其中在體內抗血小板聚集實驗中，中劑量及高劑量組的抗血小板聚集作用強於複方丹參片組。
表9 EOB-f01對家兔體外血小板聚集的影響(X±SD，n＝8)組別 劑量(mg/kg) 動物數 血小板聚集率(％)抑制率(％)對照組 --836.36±6.65 --高劑量組10810.97±4.70**69.82中劑量組5 817.13±3.25* 52.88低劑最組2.5 821.91±2.05* 39.74**p＜0.01，*p＜0.05，與對照組比較，表10 EOB-f01對家兔半體內血小板聚集的影響(X±SD，n＝8)組別 劑量(g/kg) 動物數血小板聚集率(％)抑制率(％)對照組 -- 851.17±4.96--高劑量組0.4827.27±4.85***46.57中劑量組0.2831.66±2.64***38.13低劑量組0.1838.63±2.65** 24.51複方丹參組 0.1835.67±6.67** 30.30***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，與對照組比較.。
6免疫促進作用竹葉總黃酮試樣產品EOB-f03，標準總黃酮糖苷含量≥10％，實測值為13.6％，棕黃色粉末，由杭州浙大力夫生物科技有限公司提供。雄性昆明種小鼠，體重18～22g，由南京鐵道醫學院實驗中心提供，隨機分為陰性對照組及低、中、高三個劑量組，分別相當於人體推薦攝入量的5、10和30倍。試驗按照衛生部監督司《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》中免疫調節功能所規定的方法進行。
6.1對小鼠血清溶血素抗體形成的影響小鼠血清溶血素抗體含量以樣品半數溶血值(HC50)表示，實驗顯示(表11)，中劑量組與對照相比有顯著差異(p＜0.05)，高劑量組有顯著差異(p＜0.01)，表明EOB-f03可以促進小鼠體內抗體的產生，提高體液免疫功能。
表11EOB-f03對小鼠血清溶血素的影響(X±SD)組別 劑量(mg/kg) n(只)半數溶血值(HC50)對照組 -- 10132.06±24.77高劑量組90010155.21±3.79**中劑量組30010152.04±4.51*低劑量組15010150.42±15.02*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較。
6.2對小鼠碳粒廓清速率的影響表12 EOB-f03對小鼠碳粒廓清速率的影響(X±SD)組別劑量(mg/kg)n(只) 吞噬指數(a)對照組 -- 102.33±0.96高劑量組900103.71±1.14**中劑量組300103.2±0.69*低劑量組150102.77±1.12*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較。
對表12中各組的吞噬指數進行單因素方差分析，F＝3.491，P＜0.01，可以判斷不同劑量組的吞噬指數的均數差異有高度顯著性；兩兩比較結果表明，EOB-f03 300mg/kg以上劑量組與對照組相比差異顯著。表明EOB-f03能明顯增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能。
6.3對DNFB誘導的小鼠遲發性變態反應的影響表13 EOB-f03對小鼠遲發性變態反應(DTH)的影響(X±SD)組別 劑量(mg/kg) n(只)耳殼重量差值(mg)對照組 -- 107.10±2.69高劑量組900109.30±1.70*中劑量組300109.20±1.32*低劑量組150107.20±2.49*P＜0.05，與對照組比較。
對小鼠左右耳片重量差進行單因素方差分析，F＝3.004，P＜0.05，可以判斷為不同劑量組的左右耳片重量有顯著性差異；各劑量組左右耳片重量差與對照組比較，中、高劑量組的差異有顯著意義(P＜0.05)。表明EOB-f03能促進小鼠的細胞免疫功能。
7抗腫瘤活性2002年起，申請者又在EOB-f01的基礎上，進一步採用高速逆流色譜(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)分離技術，得到了葒草苷和異葒草苷含量之和在95％以上的二種竹葉碳苷黃酮的混合物[徐維婭，色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究，浙江大學碩士學位論文，2002.6]，並進行了體外抗腫瘤活性的篩選，顯示其對DU145(人前列腺癌細胞株)、P388(小鼠白血病)、A549(人肺腺癌)、A375(人黑色素瘤)、L929(小鼠肺上皮癌)、Hela(人宮頸癌)、THP-1(人巨噬組織瘤)等癌細胞的增殖均有不同程度的抑制作用，且其抑制率具有時間和劑量的依賴性。
8臨床觀察在竹康寧膠囊(衛食健字 第0564號；核准的保健功能為調節血脂和增強免疫力；以EOB-f03為內容物，250mg/粒，總黃酮糖苷含量≥10％；)的消費過程中，發現對多例消費者經久不愈的前列腺增生和前列腺炎症收到了意外的療效。舉例如下幹××，男性，73歲，浙江寧波人，離休幹部，有家族性高血壓史，血脂偏高。20多年來，長期服用心痛定、複方卡託普利以及複方降壓片、複方羅布麻片、開博痛等降壓藥和魚油降脂丸、血脂清、多烯康等降脂藥，並輔以地奧心血康、銀杏葉片、天保寧等。但效果仍不理想。血壓最高達到220/120mmHg，通常為180/90mmHg；血甘油三酯和血膽固醇均高出正常範圍。自1998年7月7日起，在堅持服用心痛定的同時，停用魚油降脂丸和銀杏葉片，改服竹康寧膠囊，每日2次，每次3粒，連續2個月。停用一周後，於9月14日去醫院複查，測得血壓為170/85mmHg，血脂各項指標均轉為正常(其中TG從1.83下降至0.90mmol/L，TC從5.90下降至4.82mmol/L，載脂蛋白A從1.26升高到1.67g/L，載脂蛋白B從1.14下降到1.00g/L)。在服用1個多月時，無意中發現，原先每晚平均需小便3～4次，現每晚起夜1次即可，效果顯著。
候×，男，74歲，湖南長沙人，離休幹部。於1986年患了一場重感冒，一個多月身體不適，後發現小便異常，經醫院檢查患了前列腺炎，主要症狀是早晨首次如廁時，尿道燒灼感十分強烈；平時小便常不能一次解完，尿流斷續呈線，解時尿道有疼痛感。10多年來曾四處求醫，郵購藥品，花錢很多，效果全無，病情逐漸加重，痛苦不堪。自1999年6月開始服用竹康寧膠囊，堅持了半年左右，感到上述症狀顯著減輕，生活質量大幅度提高。
結論由於前列腺疾病的發病機理目前尚無定論，根據它的病理特點及可能的發病機理，選用了以上實驗體系，結合起來闡述了竹葉總黃酮(EOB-f)對前列腺炎、前列腺增生以及前列腺癌症可能的防治效果，表明其具有作為前列腺疾病的二線治療藥物和/或保健食品開發的潛力。
本發明所指的竹葉總黃酮(EOB-f)是從禾本科(Graminae)、竹亞科(Bambusoideae)、剛竹屬(Phyllostachys Sieb.et Zucc)品種的葉子中得到的不同精度的黃酮製劑，其生產工藝在張英以前的二項發明專利(專利號分別為ZL 981 04564.2和ZL 98 1 04563.4)中已有涉及。需要指出的是，本專利所指的竹葉總黃酮既可以是採用上述專利工藝得到的產品，也可以是在此基礎上進一步運用吸附～解吸、柱層析、膜分離、重結晶、色譜分離等技術及其組合方法精製得到的竹葉黃酮製品。
竹葉總黃酮(EOB-f)的外觀為黃色或棕黃色粉末(也可以浸膏形式存在)，總黃酮糖苷含量(硝酸鋁～亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為標準品，以幹基計)可以變化在10～90％之間，四種主要的碳苷黃酮是葒草苷(orientin)、異葒草苷(homoorientin)、牡荊苷(vitexin)和異牡荊素(isovitexin)，見附圖1。經溴化鉀壓片後的紅外光譜圖顯示，竹葉總黃酮在3408、2934、1652、1610、1118、1078cm-1等處有特徵性吸收(附圖2)；將其溶於光譜純甲醇後，在200～600nm的波長範圍內進行掃描，譜圖顯示在240～280nm之間有一強吸收峰，在340～380nm之間有一次強吸收峰，符合黃酮類化合物的典型特徵(附圖3)。
竹葉總黃酮(EOB-f)的化學試劑鑑別取試樣0.5g溶於100mL95％的乙醇中，①取上述溶液1mL，加1％FeCl3-乙醇溶液2～3滴，應顯深藍色或蘭紫色。②取上述溶液1mL，加1％AlCl3-乙醇溶液2～3滴，應呈鮮黃色。③取試樣0.5g，加入10mL乙醚，超聲波輔助萃取30s，過濾。取濾液1mL，置70～90℃的水浴中揮幹乙醚後，依次加入2％的間二硝基苯溶液(用95％乙醇配製)和2.5mol/L的KOH水溶液各1mL，應立即出現微紅色，放入上述熱水浴中，迅速變成深紫紅色。
本發明所涉的最新研究表明，竹葉總黃酮對七種常見泌尿系統致病菌均有一定的抑制作用；對小鼠巴豆油和二甲苯耳炎模型有明顯的抑制作用；對大鼠角叉菜膠前列腺炎模型有明顯抑制作用；對幼年小鼠前列腺生長有一定的抑制作用，但對睪丸、儲精囊和提肛肌的生長無明顯影響；對丙酸睪丸素所致小鼠前列腺增生有明顯抑制作用；在體內外均具有明顯的抗家兔血小板聚集的作用；能顯著促進小鼠的體液免疫、細胞免疫和巨噬細胞吞噬功能；並對多種腫瘤細胞株的增殖具有抑制作用，具有作為前列腺疾病防治的天然藥物或保健食品開發的潛力。
本發明所指的防治前列腺疾病的天然藥物或保健食品中，既可單獨以竹葉總黃酮作為藥效成分或功能因子，也可與通常用於前列腺藥物的其他中、西原料藥或植物提取物適量配合，這些其他的組分可以包括各種抗生素、α-受體阻滯劑、抗炎藥物和他種植物提取物(如植物多糖、植物黃酮、植物甾醇、花粉提取物、番茄紅素等)。
作為防治前列腺疾病的活性成分，竹葉總黃酮(EOB-f)的用量(以總黃酮糖苷含量計)為成年人每日10～1000mg，優選50～600mg，每日服用1～2次。
本發明的產品可以製成各種劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、預乳劑、微乳劑、混懸劑、糖漿劑、各種腸溶製劑、注射劑、噴霧劑、軟膏劑、栓劑等直腸給藥製劑，等等。
本發明的藥品和/或保健品具有預防和治療前列腺炎症(細菌性及非細菌性炎症)、前列腺增生、以及前列腺腫瘤等相關的泌尿系統疾患。
本發明將通過下列非限制性實施例進行舉例說明。
實施例175mg(按總黃酮糖苷計)薄膜衣片活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)賦型劑內填充輔料微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鎂。薄膜衣組成玉米朊、乙基纖維素、增塑劑、藥用色素、二氧化鈦等。
根據需要製成普通片或異型片。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～2次，每次1～4片。
實施例250mg(按總黃酮糖苷計)腸溶衣片活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)賦型劑內填充輔料微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖酸酯、硬脂酸鎂。腸溶衣組成聚丙烯酸II及/或III號樹脂、吐溫80、苯二甲酸二乙酯、蓖麻油、藥用色素等。
根據需要製成普通片或異型片。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～2次，每次1～4片。
實施例3
100mg(按總黃酮糖苷計)膠囊劑活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)賦型劑內填充輔料乳糖、羧甲基纖維素(CMC)、十二烷基硫酸鈉、滑石粉。膠囊外殼組成明膠、藥用色素、二氧化鈦等。
根據需要製成普通膠囊或異型膠囊。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～2次，每次1～3粒。
實施例450mg/mL(按總黃酮糖苷計)預微乳劑活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)賦型劑內填充輔料非離子型表面活性劑、助溶劑、脂溶性乳化劑、植物油、抗氧劑。
根據需要製成口服液或軟膠囊。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～2次，每次1～4mL(或粒)。
實施例52mg/mL(按總黃酮糖苷計)注射劑活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)賦型劑吐溫-80、氯化鈉、注射用水。
根據需要製成2mL/支、5mL/支、10mL/支、。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用。
實施例620mg/g(按總黃酮糖苷計)栓劑活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)賦型劑內填充輔料Witepsol H15、Witepsol W45、十二烷基硫酸鈉等。
根據需要製成2g/栓。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～4次。
實施例750mg(按總黃酮糖苷計)與2mg非那雄胺複方薄膜衣片活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)及非那雄胺(化學合成藥物)賦型劑內填充輔料微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鎂。薄膜衣組成玉米朊、乙基纖維素、增塑劑、藥用色素、二氧化鈦等。
根據需要製成普通片或異型片。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～2次，每次1片。
實施例840mg(按總黃酮糖苷計)與8mg蕃茄紅素油樹脂複方膠囊劑活性成分竹葉總黃酮(EOB-f01粉末，總黃酮糖苷含量≥50％)及蕃茄紅素油樹脂(含蕃茄紅素8％)賦型劑內填充輔料乳糖、羧甲基纖維素(CMC)、十二烷基硫酸鈉、滑石粉。膠囊外殼組成明膠、藥用色素、二氧化鈦等。
根據需要製成普通膠囊或異型膠囊。結合症狀，遵醫囑或按說明書使用，每日1～2次，每次1～3粒。
權利要求
1.一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於竹葉總黃酮應用於防治前列腺疾病的藥物及保健食品產品中。
2.根據權利要求1所述的一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於所說產品中的有效成分為單獨含有竹葉總黃酮，或者竹葉總黃酮與用於前列腺藥物的其它中、西原料藥或植物提取物的組合。
3.根據權利要求2所述的一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於所說的用於前列腺藥物的其它中、西原料藥或植物提取物為各種抗生素、α-受體阻滯劑、抗炎藥物和植物多糖、植物黃酮、植物甾醇、花粉提取物、番茄紅素。
4.根據權利要求1所述的一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於所說的產品形態可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、預乳劑、微乳劑、混懸劑、糖漿劑、各種腸溶製劑、注射劑、噴霧劑、軟膏劑、栓劑等直腸給藥製劑。
5.根據權利要求1或4所述的一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於所說的竹葉總黃酮的用量(總黃酮糖苷含量，以蘆丁計)為成年人每日10～1000mg，每日服用1～2次。
6.根據權利要求1或4所述的一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於所說的竹葉總黃酮用量(總黃酮糖苷含量，以蘆丁計)為成年人每日50～600mg，每日服用1～2次。
7.根據權利要求1所述的一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，其特徵在於所說的前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。
全文摘要
本發明公開了一種竹葉總黃酮在前列腺疾病防治藥物及其保健食品中的應用，竹葉總黃酮應用於防治前列腺疾病的藥物及保健食品產品中。本發明提供了一種來源廣闊、安全有效、經濟適用的植物提取物——竹葉總黃酮，對其與前列腺病理相關的特性進行了系統研究，表明其具有顯著的抗菌、抗炎、抗前列腺增生、抗血小板聚集、抗腫瘤和免疫促進等作用；先前的大量研究已表明，其具有優良的抗自由基、抗氧化、抗輻射、保護心腦血管等生理和藥理活性，安全、無毒，長期使用無副作用；且性能穩定，風味清香，可以製成各種不同的劑型，並可與多種藥品和食品體系複合，使用方便，尤為適合於前列腺疾病這類多靶點的老年慢性退行性疾病的防治。
文檔編號A61P13/08GK1513447SQ03128889
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月25日 優先權日2003年5月25日
發明者張英, 吳曉琴, 張泳華, 蔡華芳, 陸柏益, 英 張 申請人:杭州浙大力夫生物科技有限公司