一種檢測馬鈴薯青枯病菌的引物及其PCR檢測方法與流程
2023-07-16 22:08:21
本發明涉及一種檢測引物及其PCR檢測方法。
背景技術：
馬鈴薯青枯病(Potato bacterial wilt)，又名細菌性枯萎病。從發生地域或危害性來說，青枯病是馬鈴薯病害中僅次於晚疫病的一種常見病和多發病，為世界性重大細菌性病害。青枯病分布範圍極廣，主要分布在溫暖潮溼、雨量充沛的熱帶和亞熱帶地區。由於青枯病較難控制，既無免疫抗原，又可經土壤傳染，一旦發生青枯病，發病田塊大幅度減產，發病重的產量損失達80％左右。
此病是由一種稱為青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的細菌侵染引起的。此菌是一種維管束寄生的植物病原細菌，病菌侵入維管束後迅速繁殖，並堵塞導管，妨礙水分運輸，最後導致植株萎蔫。此種細菌的寄主範圍很廣，可侵染33科100餘種植物，除茄科蔬菜如番茄、茄子、辣椒等外還侵染菸草、芝麻、花生、大豆、蘿蔔等多種農作物，病菌生長發育最適溫度為30-37攝氏度，是一種要求高溫的細菌，對溼度的要求也較高。該菌主要隨病殘體留在田間或馬鈴薯塊上越冬，無寄主時，病菌可在土中營腐生生活長達14個月～6年，是一種頑固的兼性腐生菌。
青枯病是危害嚴重的病害。一般幼苗期較少顯症，多在現蕾開花後表現急性顯症，染病植株比健株稍矮縮，葉色較淺，在晴天的午間一般是上部個別小葉或複葉出現萎蔫，晚間及清晨尚可恢復，以後逐漸加重，致全株葉片萎垂不能再恢復，全株莖葉萎蔫死亡，但仍保持青綠顏色，葉片亦不脫落，隨後葉脈逐漸變褐，莖部亦出現褐色條紋。病株所結薯塊如染病輕，外表無明顯症狀，染病重的臍部變灰褐色溼潤狀，切開病薯，維管束環變褐，稍擠壓亦溢出汙白色細菌膿液，嚴重的塊莖外皮龜裂，髓部軟腐潰爛。此病對馬鈴薯有潛伏侵染，外表雖無明顯症狀，但因細菌已侵入並潛伏薯塊內，在貯運銷售期間，若條件合適就會繼續發展及致引起塊莖大量腐爛。
常用的馬鈴薯青枯病菌鑑定檢測方法如革蘭氏染色法和血清學方法。革蘭氏染色法需要加上對菌體形態特徵進行觀察，對生理生化反應特性進行測定，才能最終判定，這種檢測方法需要對病原菌進行分離和純化，試驗的結果因培養溫度、培養時間長短、培養基成分和確定陰性陽性的標準不同而變化，穩定性差，且費時費力，不便於生產上的應用。血清學方法儘管靈敏度有所提高，但仍然存在缺點，在與其它相近病菌的交叉反應或製備的抗血清不能和所有的待檢測的某一種病菌的所有菌株雜交。隨著分子生物學技術在許多領域的發展和應用，尤其是利用各種生物所特有的基因組鹼基序列，而發展起來的特異性聚合酶鏈反應(PCR)技術的應用，但是這種技術對檢測過程需要嚴格的要求，引物方面也是關鍵，不同的引物對檢測結果影響較大，對檢測範圍，檢測的靈敏度，特異性等均有很大的影響。
技術實現要素：
本發明的目的是為了解決現有方法對馬鈴薯青枯病的病原菌檢測範圍窄，特異性差，靈敏度差，檢測效率低的問題。而提供了一種檢測馬鈴薯青枯病菌的引物及其PCR檢測方法。
本發明的一種檢測馬鈴薯青枯病菌的引物，該引物對如下：
QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'
QK3-1：5'-GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'。
本發明的一種檢測馬鈴薯青枯病菌的PCR方法，它是按照以下步驟進行的：
一、提取待檢測樣本的基因組DNA；
二、以權利要求1的引物作為檢測引物，步驟一提取的DNA作為模板，進行PCR擴增反應；
三、PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳；
四、對擴增片進行分析：在591bp位置有擴增條帶，表示樣品為陽性，待檢測樣品中含有鈴薯青枯病菌。
本發明包含以下有益效果：
本發明的馬鈴薯青枯病菌PCR檢測引物，該引物可以對引起馬鈴薯青枯病的病原菌Ralstonia solanacearum四種生化型(BV Ⅱ～BV Ⅴ)的菌株進行擴增檢測，檢測範圍廣泛。檢測特異性好，可以避免其它馬鈴薯細菌病原物產生的非特異性擴增。檢測靈敏度可以達到1pg的模板DNA。檢測效率高，檢測樣品可以是馬鈴薯植株DNA、塊莖DNA，甚至可以直接以菌液作為模板進行PCR檢測。
本發明的檢測引物，檢測特異性強，定性檢測效果好。在常見的馬鈴薯病害環腐病、黑脛病、軟腐病和晚疫病等病原菌內均無擴增條帶出現，僅有青枯病菌能夠獲得目的片段。(避免了陳永芳等2005年利用RAPD法建立的PCR檢測法中環腐病和黑脛病有擴增條帶，只是帶型不同的問題)。
附圖說明
圖1為實施例1中DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-6泳道分別為：RS1～6的青枯病菌；
圖2為實施例1中退火溫度優化的電泳圖；
圖3為實施例1中馬鈴薯青枯病菌PCR擴增電泳圖；其中，M為DL2000；1：陰性對照；2～13：RS1～12的DNA電泳圖；
圖4為實施例1中PCR檢測的特異性鑑定電泳圖；其中，M：DL2000；1：陰性對照；2～4：RS1～4的DNA電泳圖；6～8：馬鈴薯黑脛病菌DNA電泳圖；9～11：馬鈴薯環腐病菌DNA電泳圖；12～14：馬鈴薯晚疫病菌DNA電泳圖；
圖5為實施例1中PCR檢測的靈敏性鑑定電泳圖；其中，M為DL2000；1：陰性對照；2～7表示：1ng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg的樣品電泳圖；
圖6為實施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴增電泳圖第一批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、水對照、陰性對照、1-1～6、2-2～4、3-1～12；
圖7為實施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴增電泳圖第二批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、3-13～16、5-1～4；
圖8為實施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴增電泳(引物RS32和RS37)第一批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、水對照、陰性對照、1-1～6、2-2～4、3-1～12；
圖9為實施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴增電泳(引物RS32和RS37)第二批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、3-13～16、5-1～4；
圖10為實施例2的內蒙古的四個樣品和標準菌株同時進行兩對引物的擴增電泳結果圖；其中A為本發明的引物擴增後電泳圖，B為檢疫標準推薦引物擴增後電泳圖。
具體實施方式
具體實施方式一：本實施方式的一種檢測馬鈴薯青枯病菌的引物，該引物對如下：
QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'
QK3-1：5'-GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'。
具體實施方式二：本實施方式的一種檢測馬鈴薯青枯病菌的PCR方法，它是按照以下步驟進行的：
一、提取待檢測樣本的基因組DNA；
二、以權利要求1的引物作為檢測引物，步驟一提取的DNA作為模板，進行PCR擴增反應；
三、PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳；
四、對擴增片進行分析：在591bp位置有擴增條帶，表示樣品為陽性，待檢測樣品中含有鈴薯青枯病菌。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是：PCR擴增的PCR體系如下：
PCR擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，50～63℃退火40s，72℃延伸100s，35個循環，72℃延伸10min，4℃保存。其它與具體實施方式二相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式二不同的是：步驟一中提取基因組DNA，是從馬鈴薯植株或馬鈴薯塊莖提取。其它與具體實施方式二相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式二不同的是：基因組DNA提取步驟如下：
一、取馬鈴薯塊莖或馬鈴薯植株0.1g放入勻漿管中，再加入2mL勻漿緩衝液，將材料立即破碎後將液體抽出，放在5mL離心管中後，加入20μL巰基乙醇，立即在65℃水浴中過夜；
二、將上一步的離心管從水浴鍋中取出後，加入等體積飽和酚，蓋緊離心管，來回顛倒離心管在20min內混勻；
三、在10000rpm轉速下離心10min，用移液管小心取出上清液，放另一離心管中，棄下層有機相；
四、向步驟三取的上清中加入等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇後來回顛倒離心管，混合10min後，在10000rpm轉速下離心10min，重複此步驟1-2次，直至取出的水相加入有機溶劑時無白色雲霧狀物；
五、取上步驟四離心後的上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混合10min，在10000rpm轉速下離心10min；
六、取上一步離心後的上清，加入2倍體積的凍存後的無水乙醇，水平旋轉50～100轉後，在-20℃冰箱中放置30min以上，沉澱DNA；
七、將上一步放置於-20℃的離心管取出，在10000rpm轉速下離心10min後，收集沉澱，得DNA；
八、向上一步得到的DNA中加入1mL體積百分含量為75％的乙醇，來回顛倒數次離心管，在8000rpm轉速下離心4～5min，倒掉乙醇，將管倒置在乾淨的吸水紙上，乾燥DNA沉澱；
九、向上一步乾燥後的DNA中加入100-200μL滅菌的去離子水，在55℃水浴中溶解DNA；
十、向上一步的提取液中加入1μL的RNase，在常溫下放置30min，然後用0.1％的凝膠進行電泳檢測，-20℃冰箱中保存。其它與具體實施方式二相同。
本發明內容不僅限於上述各實施方式的內容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現發明的目的。
通過以下實施例驗證本發明有益效果：
實施例1
1、試驗材料
本實施例所採用的馬鈴薯青枯病菌菌株如表1所示，菌株RS1～4由國際馬鈴薯中心(簡稱CIP)提供用於科學研究，其餘菌株均為本課題組通過TZC分離培養基對馬鈴薯青枯病感病植株進行分離純化後，製成水溶液置於4℃冰箱保存備用。
表1供試菌株名稱和來源
2、試驗方法
2.1、試驗所用細菌的基因組DNA提取
DNA提取方法參見商品化試劑盒的說明書。
2.2、馬鈴薯塊莖的DNA提取
1、取馬鈴薯塊莖0.1g放入勻漿管中，再加入2mL勻漿緩衝液，將材料迅速破碎後將液體抽出，放在5mL離心管中後，加入20μL巰基乙醇，迅速在65℃水浴中過夜；
2、將離心管從水浴鍋中取出後，加入等體積飽和酚，蓋緊離心管。緩慢來回顛倒離心管至少20min以混勻。不要過於劇烈，以防將DNA打斷；
3、10000rpm離心10min。含DNA的水相在上層，含蛋白質和細胞碎片的有機相在下層；
4、用移液管小心取出上清液，放另一離心管中，棄下層有機相；
5、加入等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇後緩慢來回顛倒離心管，混合10min後10000rpm離心10min。重複此步驟1-2次，直至取出的水相加入有機溶劑時看不到白色雲霧狀物；
6、取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混合10min，10000rpm離心10min。
7、取上清，加入2倍體積的、冰冷的無水乙醇，水平旋轉50～100轉後放在-20℃冰箱中30min以上，沉澱DNA；
8、將離心管取出，10000rpm離心10min後，可見管的下方有沉澱，即DNA；
9、小心地倒掉液體，加入1mL 75％的乙醇，來回顛倒數次離心管，以移去沉澱塊中可能有的異物，8000rpm離心4-5min，小心倒掉乙醇，將管倒置在乾淨的吸水紙上，讓乙醇流盡，乾燥DNA沉澱；
10、根據沉澱塊的大小加入100-200μL滅菌的去離子水，在55℃水浴中溶解DNA；
11、為了去除提取到的RNA，在提取液中加入1μL RNase，在常溫下放置30min，然後用0.1％的凝膠進行電泳檢測。-20℃冰箱中保存。
上述步驟提取DNA的方式，也可以從植株體中提取DNA。
2.3、PCR特異性引物的設計
根據Genebank中的登錄號為DQ924957的Ralstonia solanacearum strain TW56 16S rRNA序列，使用Primers5.0軟體設計馬鈴薯青枯病菌的特異性擴增引物，引物由上海生工生物公司合成，引物序列如下：
QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'
QK3-1：5'–GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'；
目的片段長度為591bp。
2.4、PCR擴增
PCR的反應體系均為25mL。PCR反應條件確定主要是對擴增程序的最適退火溫度。
2.4.1.PCR反應體系
2.4.2.PCR反應條件的優化
對PCR反應條件中退火溫度進行優化：
2.4.5.PCR檢測體系的特異性驗證
用設計合成的特異性引物對所供試病菌DNA進行PCR擴增，分別以馬鈴薯青枯病菌(RS1～4)、馬鈴薯黑脛病菌(BYH2、GSH1、NMH1)DNA、馬鈴薯環腐病菌(by06-6、hc-42、p06-4)DNA、馬鈴薯晚疫病菌(ch10、ch11、ncppb)DNA為模板，檢測PCR檢測體系的特異性。
2.4.6.PCR檢測體系的靈敏度驗證
為鑑定所設計引物及PCR反應體系所能測定的DNA最小濃度，將提取的DNA依次稀釋成1ng，100Pg，10Pg，1Pg，100fg，10fg的6個不同濃度，用設計的引物進行PCR擴增，根據凝膠電泳結果測定引物的靈敏度。擴增產物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3、試驗結果
3.1青枯病菌基因組DNA提取
將所提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。從圖中可看出，獲得的DNA完整，質量較好，沒有降解，能夠滿足PCR分離基因的要求，可以用於進一步的試驗。
4、PCR的擴增
4.1退火溫度的篩選
對馬鈴薯青枯病菌常規PCR反應條件進行優化，優化的條件為退火溫度。篩選結果如圖2所示。結果顯示：59℃為最適退火溫度。
4.2PCR擴增
用馬鈴薯青枯病菌特異性引物對供試12個青枯病菌菌株進行PCR擴增，結果見圖3。
4.3PCR檢測的特異性鑑定
用馬鈴薯青枯病菌特異性引物對供試菌株的DNA進行PCR擴增，結果如圖4。由圖可以看出，所用的青枯病菌都能擴增出大小為591bp的條帶，而其他參考病原菌及對照均未擴增出條帶，說明設計的引物對青枯病菌具有高度的特異性。
4.4PCR檢測的靈敏性鑑定
採用馬鈴薯青枯病菌特異性引物對稀釋成1ng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg的共6個不同濃度的青枯病菌基因組DNA進行PCR擴增，結果如圖5所示。由結果可以看出檢測到最低濃度為1pg的模板DNA。
4.5目的片段測序
將經過鑑定的陽性菌液送到上海生物工程技術服務有限公司進行測序，序列如下(下劃線部分為引物)。
AAATCGGTCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAGCGTCAGTGTTATCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACACACTCTAGCCGTGCAGTCACCAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATCGGTCTTGCACAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGGACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTCCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCGACCCCAGGTATTAACCAGAGCCATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCAGACATCGGCCGCTCCTATAGCATGAGGCCTTGCGGTCCCCCACTTTCACCCTCAGGTCGTATGCGGTATTAGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAGGCGGTAATACGGTATCCACAGATCAGGGGATACGCAGAAAGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAGGCCAGGACCGTAAAAGGCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGG。
實施例2
本實施例應用本發明的PCR引物和檢疫標準推薦PCR檢測引物，對採自我國廣西省、廣東省、福建省、內蒙古等省份的35份感染細菌病害的樣品進行比較試驗。
1材料與方法
1.1樣品
健康馬鈴薯植株(陰性對照)由黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所提供。
馬鈴薯青枯病標準菌株Ralstonia solanacearum購買自中國科學院微生物保藏中心。
待測樣品：從我國廣西省、廣東省、福建省、內蒙古等地區馬鈴薯產區採集，見表2。
表2樣品信息
1.2試劑
TaqDNA聚合酶、dNTP、購自TaKaRa(大連)公司，引物合成委託生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.3植物基因組DNA提取
按照天根新型植物基因組DNA提取試劑盒說明書推薦方法提取塊莖DNA。
1.4 PCR擴增
供試引物序列見表3。本發明的引物QK5-1和QK3-1的退火溫度為59℃，而檢疫標準推薦的引物RS32和RS37的退火溫度為60℃。擴增產物經凝膠成像系統觀察。
表3引物序列
2結果分析
2.1本發明引物的擴增結果
供試樣品經引物QK5-1和QK3-1擴增後結果見圖6和圖7，從圖中可知，廣西省檢出4份青枯病樣品；廣東省16份樣品均檢出青枯病菌；福建省4份樣品的青枯病菌檢測呈現弱陽性。
2.2檢疫標準推薦引物的擴增結果
供試樣品經已知檢疫標準中推薦的引物擴增結果見圖8和圖9，從圖中可知，廣西省的樣品(1-1～6、2-2～4)均為陰性；廣東省16份樣品均檢出青枯病菌；福建省4份樣品的青枯病菌檢測呈現弱陽性。
2.3兩對引物的擴增效率比較
以內蒙古的四個樣品和標準菌株同時進行兩對引物的擴增，電泳結果見圖10。從圖中可知，標準菌株的DNA濃度為20ng/μL，自行設計的引物QK5-1和QK3-1擴增獲得目的產物，而RS32和RS37則未獲得目的產物。待測樣品的擴增效率方面，自行設計的引物QK5-1和QK3-1優於推薦引物RS32和RS37。
上述結果表明本發明所建立的PCR檢測體系，準確率比推薦的檢測方法更高，擴增效率也更高。