一種3,5-二糖類花色苷的製備方法
2023-07-17 02:41:21 1
一種3,5-二糖類花色苷的製備方法
【專利摘要】本發明涉及天然色素製備【技術領域】，尤其涉及一種3,5-二糖類花色苷的製備方法。該方法包括超聲輔助提取、萃取、純化的步驟。該方法以超聲輔助提取減少了提取劑的使用、縮短提取時間、提高了提取效率。採用凝膠柱與大孔樹脂相結合的方法，去除雜質、分離花色苷單體，從而避免了製備或半製備高效液相色譜的使用，簡化了操作；並且，凝膠柱和大孔樹脂填料可反覆使用，能夠節約資源。實驗證明：本發明提供的方法提取3,5-二糖類花色苷，每g山葡萄皮乾粉能夠得到7.36mg的3,5-二糖類花色苷，提取效率和純度皆較高。
【專利說明】—種3, 5- 二糖類花色苷的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及天然色素製備【技術領域】，尤其涉及一種3，5- 二糖類花色苷的製備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著食品藥品安全問題的日益嚴重，天然色素的開發與應用己成為各行業科技工作者普遍關注的課題。近年來，天然色素在國際市場上的增長率一直都保持在10%以上。天然色素大多來源於天然植物的根、莖、葉、花、果實等，因此，採用這些天然色素更加安全，也更能得到消費者的青睞。花色苷類色素作為天然色素的一大類，因其豐富豔麗的色澤和抗氧化活性，目前在食品、醫藥等領域已有廣泛應用。
[0003]花色苷(anthocyanin)是一類羥基和甲基化的2_苯基-苯並吡喃烊離子(花色素，anthocyanidin)與糖分子通過糖苷鍵結合而成的多酹類化合物。花色素屬於類黃酮，是一種酚類物質，因苯環取代基、羥基和甲氧基數量與位置的不同，花色素單體主要包括以下六類:花翠素、甲基花翠素、二甲基花翠素、花青素、甲基花青素、花葵素。這些花色素單體中，花翠素最不穩定，二甲花翠素最為穩定。而根據成苷糖基位置和數量的不同可將主要的花色苷分為四類，分別是3-單糖類花色苷，3-雙糖類花色苷，3，5- 二糖類花色苷和3，7- 二糖類花色苷等。這四種類型的花色苷中，雙糖苷類色素因分子中含有雙糖分子，其穩定性明顯高於相應的單糖類物質。因此，雙糖花色苷作為天然色素，在食品藥品行業中具有很高的研究價值和應用前景。但是，由於缺乏低成本的製備工藝導致在我國花色苷類作為天然食用色素的生產很少，且價格十分昂貴，很難應用於工業化生產。
[0004] 花色苷廣泛存在於紫甘薯、葡萄、血橙、紅球甘藍、藍莓、茄子皮、櫻桃、紅橙、紅莓、草莓、桑葚、山楂皮、紫蘇、黑(紅)米、牽牛花等植物的組織中。其中以葡萄中的含量較為豐富。近年來的研究結果表明，歐亞種葡萄(VitisamurensisL.)中僅含有單糖類花色苷，而山葡萄(VitisamurensisRupr.)中雙糖花色苷的含量十分豐富。且山葡萄在我國分布面積廣闊，利用山葡萄作為材料提取雙糖類花色苷具有良好的應用前景。目前雖然對花色苷的提取方法已有多方報導，但是，將這些現有的方法應用於雙糖花色苷的提取卻往往存在提取率低、純度不足等問題，因此，探究雙糖類花色苷的提取純化分離方法具有重要意義。
【發明內容】
[0005]有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供一種3，5-二糖類花色苷的製備方法。該方法提取率高，所得3.5- 二糖類花色苷純度較高；且無需藉助製備型或半製備型高效液相色譜，操作簡單；該方法所用試劑毒性較低，對環境友好。
[0006]本發明提供的3，5- 二糖類花色苷的製備方法，包括以下步驟:
[0007]步驟1:以乙醇溶液超聲提取山葡萄皮粉，提取液去除乙醇，製得第一提取液；
[0008]步驟2:以乙酸乙酯萃取第一提取液，取水層，去除乙酸乙酯製得第二提取液；
[0009]步驟3:將第二提取液上樣於XAD-7大孔樹脂柱，以蒸餾水衝洗後，以乙醇溶液洗脫，獲得第一洗脫液，經乾燥，製得粗提物；
[0010]步驟4:將粗提物以甲醇溶液溶解，過濾後上樣於S印hadex LH-20凝膠柱，以甲醇溶液洗脫，獲得第二洗脫液，經乾燥，即得；
[0011]其中，乙醇溶液中各組分的體積分數為:乙醇60%，甲酸2%，水38% ;
[0012]甲醇溶液中各組分的體積分數為:甲醇20%，甲酸2%，水78% ;
[0013]山葡萄皮粉與乙醇溶液的質量體積比為:lg:1OmL ；
[00 14]超聲提取的溫度為53.5°C，時間為20min，次數為3次。
[0015]本發明提供的方法，以超聲輔助提取葡萄皮中的的花色苷，利用超聲波在溶液中形成氣穴效應，使更多溶劑滲透到樣品基質，增加固液相之間的接觸面積，將溶質儘快的溶解到溶劑，從而減少了提取劑的使用、縮短提取時間、提高了提取效率。
[0016]經超聲提取的第一提取液中仍含有糖、蛋白以及其他非花色苷酚類物質，本發明通過採用凝膠柱與大孔樹脂相結合的方法，去除雜質、分離花色苷單體，從而避免了製備或半製備高效液相色譜的使用，簡化了操作；並且，凝膠柱和大孔樹脂填料可反覆使用，能夠節約資源。
[0017]本發明所採用的山葡萄皮粉的製備方法為:取山葡萄果實剝離果皮，果皮經液氮速凍、勻漿機磨粉、凍幹機24h冷凍乾燥，即得。
[0018]本發明通過經實驗證明:
[0019]乙醇溶液中醇的體積分數會影響提取效果，花色苷的提取率隨著醇體積分數的增加，花色苷提取量增加，然而當醇體積分數在60%之後時，花色苷含量增加幅度趨於平緩；
[0020]山葡萄皮粉與乙醇溶液的質量體積比會影響提取效果:提取率隨液料比的增大而增加，當增加到10:1時上升不再增加。
[0021]超聲提取的溫度對提取效果造成影響:對於提取溫度的影響，經響應面分析結果表明，提取效率在53.5°C時達最高值。
[0022]超聲提取的時間對提取效果造成影響:在20min內，隨提取時間延長提取量逐漸增加，此後提取量略微下降，可能是由於長時間高溫提取，導致花色苷受熱分解。
[0023]提取次數對提取效果造成影響:隨著提取次數的增加，花色苷提取率增加，第三次提取時，花色苷提取率達到98.6%，但再增加提取次數對提取率影響不大。
[0024]對XAD-7、XAD-2、NKA-9、AB-80和D151樹脂對花色苷的吸附性能和解吸性能進行評價，結果表明，XAD-7具有較高的吸附性能，其次是XAD-2，而NKA_9、AB_80和D151這三種樹脂的效果均不理想。利用60%乙醇進行解析，XAD-7，AB-8都具有較高的解吸率，但後者吸附量較低。
[0025]溶劑對XAD-7大孔吸附樹脂柱的洗脫效果有影響:對乙醇溶液而言，隨著乙醇溶液中醇的體積分數的增加，樹脂中花色苷解吸率呈上升趨勢，且當體積分數達到60%時，達到較大程度的解吸(解吸率為88% )。甲醇溶液的洗脫效果與此相似，本發明採用低毒的乙醇溶液作為洗脫液。
[0026]作為優選，超聲提取的頻率為59kHz，功率為500W。
[0027]作為優選，步驟I中去除乙醇具體為:取提取液經離心、真空旋轉蒸發。
[0028]作為優選，乙酸乙酯與第一提取液的體積比為1:1。
[0029]作為優選，步驟2中去除乙酸乙酯為取水層真空旋轉蒸發。
[0030]作為優選，步驟2中萃取的次數為3次。
[0031]作為優選，XAD-7大孔樹脂柱的規格為1.6cmX40cm。
[0032]作為優選，蒸餾水的量為5倍柱體積。
[0033]作為優選，步驟3中乾燥具體為:第一洗脫液經旋轉蒸發後，真空冷凍乾燥24h ;其中，旋轉蒸發的溫度不超過40°C。
[0034]作為優選，步驟3具體為:第二提取液上樣與XAD-7大孔樹脂柱後，保持lh，以5倍柱體積的蒸餾水衝洗後，柱中加入乙醇溶液保持Ih後洗脫，獲得第一洗脫液，旋轉蒸發、真空冷凍24h。
[0035]作為優選，Sephadex LH-20凝膠柱的規格為1.6cmX60cm。
[0036]作為優選，步驟4中洗脫的流速為I滴/秒。
[0037]作為優選，步驟4中，溶解於上樣之間還包括以0.45 μ m微孔濾膜過濾的步驟。
[0038]作為優選，步驟4中乾燥具體為:第二洗脫液經旋轉蒸發後，真空冷凍乾燥24h ;其中，旋轉蒸發的溫度不超過40°C。
[0039]本發明還提供了以本發明提供的製備方法製得的3，5- 二糖類花色苷。
[0040]作為優選，以本發明提供的製備方法製得的3，5_ 二糖類花色苷為二甲花翠素_3，5-0-雙匍萄糖昔。
[0041]本發明還提供了本發明提供方法製備的3，5- 二糖類花色苷在製備食品或藥品中的應用。
[0042]本發明提供的3，5-二糖類花色苷的製備方法，包括超聲輔助提取、萃取、純化的步驟。以超聲輔助提取減少了提取劑的使用、縮短提取時間、提高了提取效率。採用凝膠柱與大孔樹脂相結合的方法，去除雜質、分離花色苷單體，從而避免了製備或半製備高效液相色譜的使用，簡化了操作；並且，凝膠柱和大孔樹脂填料可反覆使用，能夠節約資源。實驗證明:乙醇溶液和甲醇溶液中純的體積分數、超聲提取的溫度和時間是影響提取效果的關鍵因素，改變這些條件中的任一種都會顯著降低提取效率。而步驟2~4的純化過程中，大孔吸附樹脂的種類、洗脫條件是提高純化效果的關鍵因素。採用本發明提供的方法提取每g山葡萄皮乾粉能夠得到7.36mg 二甲花翠素-3，5-0-雙葡萄糖苷，佔所提取花色苷的98.7%，另外，還包括0.324%的花翠素-3，5-0-雙葡萄糖苷和0.841%的甲基花翠素3，5-0-雙葡萄糖苷。檢測過程未見其他物質峰，表明本發明提供方法提取的3，5-二糖類花色苷純度接近100%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]圖1示固定乙醇濃度(60% )，超聲處理溫度和提取劑體積對花色苷提取效果的影響；
[0044]圖2示固定超聲處理溫度(50V )，乙醇濃度和提取劑體積影響花色苷提取效果的影響；
[0045]圖3示乙醇濃度和提取劑體積對花色苷含量的交互影響；
[0046]圖4示HPLC檢測結果；其中，圖4_a示本發明實施例3製備的粗提物的色譜圖；圖4-b示本發明實施例4製備的3，5- 二糖類花色苷的色譜圖。
【具體實施方式】
[0047]本發明提供了一種3，5-二糖類花色苷的製備方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0048]本發明採用的儀器皆為普通市售品，皆可於市場購得。
[0049]其中，山葡萄成熟果實樣品2011年取自中國農業大學上莊試驗站。
[0050]山葡萄皮粉的製備具體為:室溫下將果皮剝離且不帶果肉，於液氮中速凍，經攪拌器打粉，於_40°C條件下保存。每g新鮮山葡萄果皮約製備0.3g山葡萄皮乾粉。
[0051]下面結合實施例，進一步闡述本發明:
[0052]實施例1山葡萄皮中花色苷的超聲提取條件篩選
[0053]分別研究提取液種類、體積分數、料液比、超聲提取條件對山葡萄皮中總花色苷提取量的影響。花色苷含量的定量分析採用高效液相色譜。
[0054]1、提取溶劑種類和體積分數對山葡萄皮總花色苷提取量的影響
[0055]準確稱取0.5g山葡萄皮粉，按液料比10:1 (mL/g)加入2%甲酸甲醇溶液或2%甲酸乙醇溶液，50°C超聲振蕩溫度，超聲提取20min。提取溶劑體積分數分別為60%、70%、80%、90%、100%。各組實驗設三次重複，以花色苷提取量(mg/g，乾粉)為考察指標，研究提取溶劑種類和體積分數對山葡萄皮粉中總花色苷提取率的影響，選取最適溶劑種類和體積分數，結果如表1所示:
[0056]表1提取試劑種類和體積分數對山葡萄皮總花色苷提取量的影響
[0057]
【權利要求】
1.一種3，5- 二糖類花色苷的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟1:以乙醇溶液超聲提取山葡萄皮粉，提取液去除乙醇，製得第一提取液； 步驟2:以乙酸乙酯萃取所述第一提取液，取水層，去除乙酸乙酯製得第二提取液；步驟3:將所述第二提取液上樣於XAD-7大孔樹脂柱，以蒸餾水衝洗後，以乙醇溶液洗脫，獲得第一洗脫液，經乾燥，製得粗提物； 步驟4:將所述粗提物以甲醇溶液溶解，上樣於S^hadex LH-20凝膠柱，以甲醇溶液洗脫，獲得第二洗脫液，經乾燥，即得； 其中，所述乙醇溶液中各組分的體積分數為:乙醇60%，甲酸2%，水38% ； 所述甲醇溶液中各組分的體積分數為:甲醇20%，甲酸2%，水78% ； 所述山葡萄皮粉與所述乙醇溶液的質量體積比為:lg:10mL ； 所述超聲提取的溫度為53.5°C，時間為20min，次數為3次。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述超聲提取的頻率為59kHz，功率為 500W。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述乙酸乙酯與所述第一提取液的體積比為1:1。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述XAD-7大孔樹脂柱的規格為1.6cmX40cm。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述SephadexLH-20凝膠柱的規格為 1.6cmX60cm。
6.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟3中所述乾燥具體為:第一洗脫液經旋轉蒸發後，真空冷凍乾燥24h ;其中，旋轉蒸發的溫度不超過40°C。
7.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟4中所述洗脫的流速為I滴/秒。
8.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟4中所述乾燥具體為:第二洗脫液經旋轉蒸發後，真空冷凍乾燥24h;其中，旋轉蒸發的溫度不超過40°C。
9.以權利要求1~9任一項所述製備方法製得的3，5-二糖類花色苷。
10.以權利要求1~9任一項所述製備方法製得的3，5-二糖類花色苷在製備食品或藥品中的應用。
【文檔編號】C07H1/08GK104177460SQ201410341208
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月17日 優先權日:2014年7月17日
【發明者】段長青, 張波, 何非, 吳廣楓, 李美儀 申請人:中國農業大學