染色體核型分析骨髓g帶製備方法

2023-07-16 12:24:31 1

染色體核型分析骨髓g帶製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種醫學檢驗領域中用於染色體核型分析骨髓G帶製備方法，包括在終止培養時，將溴化乙錠和秋水仙胺加入到培養基中。在終止細胞培養時加入一定量的溴化乙錠（EB）可以使分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰，具有省時、省力的優勢，且準確性更高，在醫學檢驗領域具有更廣泛的應用前景。
【專利說明】染色體核型分析骨髓G帶製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，特別涉及一種醫學檢驗領域中用於染色體核型分析骨髓G帶製備的方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]G顯帶因為染色體主要是被Giemsa染料染色後而顯帶，故稱之為G顯帶技術，其所顯示的帶紋分布在整個染色體上。人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標本後，使每條染色體上出現明暗相間，或深淺不同帶紋的技術稱為顯帶技術(bandingtechnique)。本世紀70年代以來，顯帶技術得到了很大發展，且在眾多的顯帶技術中(Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶)，G帶是目前被廣泛應用的一種帶型。
[0004]研究發現，人染色體標本經胰蛋白酶、NaOH、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理後，再用Giemsa染色,可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋,這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恆定的帶紋特徵，所以G顯帶後，可以較為準確的識別每條染色體，並可發現染色體上較細微的結構畸變。
[0005]近年來，隨著分子生物學與細胞遺傳學的發展，骨髓染色體核型分析在血液系統疾病的診斷、治療和預後中發揮了越來越重要的作用。骨髓染色體的製備因骨髓中有大量脂肪顆粒的幹擾，骨髓中各種細胞系的細胞周期不固定，不統一，難以區別對待而使得骨髓染色體分裂指數低，染色體短粗，分散度差，且成本較高。
[0006]因此，建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特徵的骨髓G帶製作方法尤為重要。
[0007]

【發明內容】

[0008]為了克服現有技術中的存在的問題，本發明提供了一種染色體核型分析骨髓G帶製備方法，包括步驟:
(A)接種:將骨髓細胞接種到骨髓細胞培養基中；
(B)終止培養:將溴化乙錠和秋水仙胺加入到步驟(A)所述的培養基中；
(C)收取骨髓細胞培養物，用於染色體製片；
(D)染色體標本製片:利用染料染色後獲得具有G顯帶的染色體標本。
[0009]進 一步地，溴化乙錠的濃度為1.5~5.5mg/ml，秋水仙胺的濃度為8~15μ g/ml。
[0010]進一步地，以培養基用量為5ml計，加入50 μ I的溴化乙錠和25 μ I的秋水仙胺。
[0011]進一步地，以培養基用量為5ml計，加入將50 μ I濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為12 μ g/ml的秋水仙胺。
[0012]進一步地，終止培養時，將溴化乙錠和秋水仙胺加入培養基，搖晃均勻後37°C，5.0%C02培養箱孵育1小時。[0013]進一步地，收取骨髓細胞培養物的方法包括:
(1)離心獲得骨髓細胞；
(2)將步驟(1)中的骨髓細胞進行低滲處理；
(3)將步驟(2)中的骨髓細胞用固定液進行預固定；
(4)將步驟(3)中的骨髓細胞用固定液固定；
(5 )將固定後的骨髓細胞製成濃度適中的懸液用於G帶製片。
[0014]進一步地，染色體製片的方法包括:
a.玻片的準備；
b.滴片；
c.烤片老化；
d.配製消化液；
e.配製染色液；
進一步地，所述 的染料為Giemsa。
[0015]進一步地,所述的Giemsa染料與pH6.8的磷酸緩衝液按照1:20混合使用。
[0016]進一步地，將骨髓細胞以I~3X IO6個/ml的密度接種到骨髓細胞培養基中，放入37°C，5.0%C02培養箱培養24小時。
[0017]本發明的有益效果是:在終止細胞培養時加入一定量的溴化乙錠(EB)可以使染色體長度增加，使分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰，具有省時、省力的優勢，且準確性更高，在醫學檢驗領域具有更廣泛的應用前景。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是利用實驗組I所得染色體標本鏡檢結果。
[0020]圖2是利用實驗組2所得染色體標本鏡檢結果。
[0021 ] 圖3是利用實驗組3所得染色體標本鏡檢結果。
[0022]圖4是利用對照組所得染色體標本鏡檢結果。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0024]實施例1配製骨髓細胞培養終止液
骨髓細胞培養終止液包括1.5~5.5mg/ml的溴化乙錠和8~15 μ g/ml的秋水仙胺。
[0025]其中所述溴化乙錠和秋水仙胺的配製方法可以採用本實施例所述的方法，也可以採用本領域其它的方法配製。
[0026]A配製溴化乙錠
a.配製儲藏液(濃度為9mg/ml)
在100ml蒸餾水中加入0.9g溴化乙錠，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，然後用鋁箔包裹容器或轉移至棕色瓶中，保存於室溫。
[0027]b.配製工作液(濃度為3mg/ml)
儲藏液以1:2 (EBiddH2O)的比例稀釋成濃度為3mg/ml的工作液。[0028]B配製秋水仙胺
a.配製儲藏液(濃度為120 μ g/ml)
稱取12 mg秋水仙胺，加入8.5g/L NaCl溶液lOOmL，待完全溶解後，經5.516 X IO4Pa(81bf/in2) 15min高壓蒸汽滅菌後避光保存於4°C冰箱中。
[0029]b.配製工作液(濃度為12 μ g /ml)
取120μ g/ml秋水仙胺溶液ImL加入8.5g/L NaCl溶液9mL即為12Pg/mL的秋水仙胺。
[0030]實施例2製備骨髓染色體標本
本實施例按如下方法製備骨髓細胞染色體標本。包括以下步驟:
(A)接種:將骨髓細胞接種到骨髓細胞培養基中；
(B)終止培養:將實施例1中所述的終止液加入到步驟(A)培養基中；
(C)收取骨髓細胞培養物，用於染色體製片；
(D)染色體標本製片:利用染料染色後獲得具有G顯帶的染色體標本。
[0031]在本實施例中以培養基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為1.5~5.5mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為8~15 μ g/ml的秋水仙胺。
[0032]在本實施例中 終止培養時，將溴化乙錠和秋水仙胺加入培養基，搖晃均勻後37°C，5.0%C02培養箱孵育I小時。
[0033]其中將骨髓細胞以I~3X IO6個/ml的密度接種到骨髓培養基中，放入37°C，
5.0%C02培養箱培養24小時。所得骨髓培養物可用於骨髓染色體製片。
[0034]其中，收取骨髓細胞培養物可按如下方法收集，也可按本領域常用的其它方法收集。
[0035](I)溫和的搖晃培養瓶，並將培養物轉入相應的15ml離心管中。抒緊培養瓶蓋，並確保樣品沒有相混。1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml渦旋混勻。
[0036](2)低滲:加入IOml 37°C溫箱預熱的0.075M KCl溶液。渦旋或反覆顛倒幾次使其與樣品混勻，37°C水浴孵育20~30min，期間將離心管左右搖晃三次以使細胞低滲均勻。
[0037](3)預固定:低滲結束後加入Iml的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，擰緊蓋子並反覆顛倒三次。I, 000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml。
[0038](4)將沉澱物渦旋混勻後，逐滴加入8ml新鮮固定液。
[0039](5)潤旋混勻後1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml。
[0040](6)混勻細胞沉澱後加入8ml新鮮固定液。
[0041](7)同 5 和 6。
[0042](8)潤旋混勻後1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留適量固定液,並加入數滴冰醋酸以製成濃度合適的細胞懸液，靜置15min後製片。
[0043]其中本實施例中的染色體標本製片方法如下:
a.玻片的準備:提前將玻片用1% HCl浸泡過夜，用大量的清水進行衝洗後浸於95%乙醇中備用。使用前將浸泡的玻片取出，用大量清水清洗後放置於2-8°C冰箱中待用。
[0044]b.滴片:吸取細胞懸液後，將滴管置於一定的高度，滴4-5滴細胞懸液於玻片上，使細胞向玻片標記端遠側流動。適當過火，幫助染色體分散。一般一個病人滴片1-2張。
[0045]c.烤片老化:置於60°C烤箱中烘烤過夜或80°C烘烤I小時。[0046]d.配製胰酶:新鮮配製50ml 0.3%胰蛋白酶(用HANKS緩衝液稀釋)溶液置於染片缸中，37°C水浴箱中預熱半小時以上。胰蛋白酶和HANKS緩衝液均購自Invitrogen公司。
[0047]e.配製Giemsa染液:臨用時將Gimesa原液與pH6.8的磷酸緩衝液按照1:20混合使用。具體的配製方法可以按下列步驟的a和b，也可按本領域常用的其它方法配製。
[0048]a.製備貯備液
Giemsa 粉Ig
純甘油66ml
甲醇66ml
先將Giemsa粉置於研缽中加少量甘油，充分研磨，呈無顆粒的糊狀，再將全部甘油加入，放入56°C溫箱中2小時，然後加入甲醇，保存於棕色瓶中；一般兩周後使用為好；
b.製備工作液
臨用時將a步驟中的貯備液與pH6.8的磷酸緩衝液按照1:20混合。
[0049]f.用胰酶消化染色後用於染色體核型分析。
[0050]實施例3對比實 驗
取同一樣本經培養後的骨髓細胞，進行對比實驗。採用實施例1和實施例2的方法設立實驗組1、實驗組2和實驗組3，三組實驗組分別採用不同濃度的細胞培養終止液，其中:實驗組I的終止液配方為:
溴化乙錠1.5mg/ml
秋水仙胺8 μ g/ml
實驗組2的終止液配方為:
溴化乙錠5.5mg/ml
秋水仙胺15 μ g/ml
實驗組3的終止液配方為:
溴化乙錠3mg/ml
秋水仙胺12 μ g/ml
設立對照組，其中:
對照組的終止液配方為:
秋水仙胺12 μ g/ml
對照組製備骨髓細胞染色體標本的步驟包括:(A)接種:將骨髓細胞接種到骨髓細胞培養基中；(B)終止培養:將終止液加入到步驟(A)培養基中，以培養基用量為5ml計，加入25 μ I的秋水仙胺；(C)收取骨髓細胞培養物，用於染色體製片；(D)染色體標本製片:利用染料染色後獲得具有G顯帶的染色體標本。
[0051]在鏡下觀察製片結果。使用的顯微鏡型號為:Leica DM2500。圖1至圖4分別是實驗組1、實驗組2、實驗組3和對照組的鏡檢結果圖。從圖1至3的鏡檢照片中很清晰地看到，使用本發明方法進行G帶顯色，分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰，因而診斷時，更加省時省力，診斷結果更加準確。
【權利要求】
1.一種染色體核型分析骨髓G帶製備方法，包括步驟: (A)接種:將骨髓細胞接種到骨髓細胞培養基中； (B)終止培養:將溴化乙錠和秋水仙胺加入到步驟(A)所述的培養基中； (C)收取骨髓細胞培養物，用於染色體製片； (D)染色體標本製片:利用染料染色後獲得具有G顯帶的染色體標本。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，溴化乙錠的濃度為1.5~5.5mg/ml,秋水仙胺的濃度為8~15 μ g/mlo
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，以培養基用量為5ml計，加入50μ I的溴化乙錠和25 μ I的秋水仙胺。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，以培養基用量為5ml計，加入將50 μ I濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為12 μ g/ml的秋水仙胺。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，終止培養時，將溴化乙錠和秋水仙胺加入培養基，搖晃均勻後37°C，5.0%C02培養箱孵育I小時。
6.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，收取骨髓細胞培養物的方法包括:
(1)離心獲得骨髓細胞；
(2)將步驟(1)中的骨髓細胞進行低滲處理； (3)將步驟(2)中的骨髓細胞用固定液進行預固定；
(4)將步驟(3)中的骨髓細胞用固定液固定； (5 )將固定後的骨髓細胞製成濃度適中的懸液用於G帶製片。
7.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，染色體製片的方法包括:
a.玻片的準備；
b.滴片；
c.烤片老化；
d.配製消化液； e.配製染色液；
f.製片。
8.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的染料為Giemsa。
9.根據權利要求8所述的製備方法,其特徵在於，所述的Giemsa染料與pH6.8的磷酸緩衝液按照1:20混合使用。
10.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，將骨髓細胞以I~3X106個/ml的密度接種到骨髓細胞培養基中，放入37°C，5.0%C02培養箱培養24小時。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740811SQ201310592287
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】程建兵, 夏成青, 陳紅梅, 郭福曉, 生帥 申請人:南京艾迪康醫學檢驗所有限公司