用於檢測分子相互作用的裝置和方法

2023-07-16 21:54:41

專利名稱：用於檢測分子相互作用的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及用於檢測靶和探針分子之間的特異性相互作用的裝置和方法。
背景技術：
生物醫學測試通常是基於對以已知量和位置存在的分子(分子探針)和被檢測的 未知分子(分子靶分子)之間的相互作用的檢測。在現代的測試中，探針是以支持物上的 物質文庫、即所謂的微陣列或晶片的形式排布，以便可以以平行的方式同時用各種不同的 探針對樣品進行分析(參見例如J. Lockhart，E. A. Winzeler，基因組學、基因表達和DNA陣 列；Nature 2000，405，827-836)。這裡所說的探針通常固定化在適合的基體上，例如在WO 00/12575中描述的那樣(參見例如US 5，412，087和WO 98/36827)，或者以預定的方式合 成生產(參見例如US 5，143，854)用於微陣列的製備。基團標記的DNA或RNA分子形式的靶分子與微陣列的核酸探針之間那樣的結合， 其先決條件是靶分子和探針分子都以單鏈核酸的形式存在。有效的、特異性的雜交只可 能發生在這樣的分子之間。單鏈核酸靶分子和核酸探針分子一般可以通過熱變性，並優 化選擇參數例如溫度、離子強度和螺旋去穩定化分子的濃度的方式獲得。因此，確信的是 只有事實上完全互補即彼此對應的序列的探針才能保持與靶序列的配對(A.A.Leitch， Τ. Schwarzacher, D. Jackson, I. J.Leitch,1994, In vitro Hybridisierung，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg/Berlin/Oxford) 0在生物學測試方法中使用微陣列的一個典型例子是在生物醫學診斷中檢測樣品 中的微生物。在此是利用了這樣一個事實，即核糖體RNA(rRNA)的基因是廣泛分布的，並 具有對相應的種來說是特徵性的序列部分。這些種特徵性的序列被施加在單鏈DNA寡核苷 酸形式的微陣列上。首先從被檢測的樣品中分離出被檢測的靶分子，並用標記物例如螢光 標記物標記。然後將標記的靶DNA分子與固定在微陣列上的探針在溶液中保溫，通過相應 的清洗步驟除去非特異性發生的相互作用，並利用螢光光學評估的方式檢測特異性相互作 用。通過這種方式，可能通過一個單一測試在一個樣品中同時檢測例如幾個微生物。在這 種測試方法中，可以檢測到的微生物的數量理論上只依賴於已經施加在微陣列上的特異性 探針的數量。在分別在固相表面上的微陣列和探針陣列的幫助下檢測分子相互作用的各種方 法和技術體系已經被描述，其中有些是可以商購的。用於檢測分子相互作用的經典系統是基於螢光團標記的光譜激發的靶分子的熒 光強度的比較。螢光是特定分子當受到特定波長的光激發時發射出它們自己的光的能力。 此時，相繼發生了特徵性的吸收和發射行為。在分析中，螢光信號增加的比率被假定為官能 化表面上標記的分子密度由於例如增加了靶和探針分子之間的分子相互作用的效率而增加。具體來說，螢光信號的定量檢測是通過修改的螢光顯微鏡方法來進行的。在這種 情況下，通過濾光片或堇青石將具有吸收波長的光和具有發射波長的光分離開來，通過光 學元件例如物鏡和透鏡將測量到的信號成像在適當的檢測器，例如二維CCD陣列上。一般 來說，分析是通過數字成像方法來進行的。目前為止，公知的技術解決方案根據它們所用的光學機構和元件而不同。問題和 限制因素可能來自於信號噪音(背景)，它基本上是由例如所用染料的去色和淬滅效應，介 質、裝配元件和光學元件自身螢光，以及光學機構中的散射、反射和二級光源所決定的。這導致了對發展高靈敏度的、用於探針陣列的定性和定量比較的螢光檢測器的極 大的技術努力。具體而言，對於中或高通量篩選來說，需要表現出某種程度自動化的特別適 合的檢測系統。對於用於讀出分子陣列的最適化標準^5Pifluorescence機構來說，已知的有基於 CXD的檢測器，它在暗視野中通過入射光或透射光來執行螢光團的激發，以鑑別例如散射和 反射這樣的光學效應(參見例如C. E. Hooper等，在生命科學中使用增強式CCD相機進行定 量光子成像，Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990)，p. 337-344)。 在這裡，陣列的成像或者通過曝光或者通過使用較高解析度的光學器件進行光柵化來完 成。多譜光源的使用允許相對容易地獲得不同的螢光團，這可以通過使用不同的激發濾光 片(組合)來進行。但是，缺點是陣列的自身螢光和例如照明均勻性這樣的與系統相關的 光學效應要求複雜的照明光學裝置和濾鏡系統。另外的定量檢測螢光信號的方法是基於螢光共聚焦顯微鏡。例如在US 5，304，810 中描述的共聚焦掃描系統是基於通過兩個針孔沿著光軸選擇螢光信號。這就要求對樣品進 行大量的調整嘗試，或建立起有效的自動聚焦系統。這樣的系統在技術方案層面上是高度 複雜的。所需的元件例如雷射器、針孔、任選冷卻的檢測器如PMT、雪崩二極體、或CCD、複雜 並高度精確的機械平移元件和光學裝置必須通過大量的努力來進行最適化和整合(參見 例如US 5，459，325 ；US 5，192，980 ；US5, 834，758)。小型化的程度和價格受到元件的多樣 性和功能性的限制。目前，基於探針陣列的分析通常讀出的是螢光數值(參見例如A. Marshall和 J. Hodgson, DNA 晶片可能性的排列，Nature Biotechnology, 16，1998，27-31 ；G. Ramsay, DNA晶片技術狀態，Nature Biotechnology, 16, Jan. 1998，40-44)。然而，上述檢測裝置和 方法的缺點是高的信號背景導致的有限的精確性，有時相當多的技術嘗試，以及與檢測方 法相關的高花費。具體來說，已知有多種共聚焦系統，適合於檢測以陣列形式安裝在流體室中 的小規模集成物質文庫(參見例如US 5, 324,633, US 6，027，880、US 5，585，639、WO 00/12759)。然而，上述的方法和系統只能以非常有限的方式被改造用於檢測特別是安裝在流 體系統中的大規模集成分子陣列，特別是由於其中發生的散射、反射和光學象差。此外，在 這樣的大規模集成陣列中，對空間解析度有極大的要求，但是到目前為止，這在技術上還不 能實現。因此，存在著對高度集成的陣列的需求，其中探針和靶之間的相互作用可以以極
5高的精確性並用相對而言很小的技術努力來定性和/或定量地檢測。替代元件的選擇性和獲得性的增加促進了替代成像技術的建立，例如螢光偏振和 時間分辨的螢光用於與固體結合的分析。通過以偏振的方式激發的螢光團扭曲偏振軸的效 應被用於以微量滴定形式定量。此外，也有方法建立了廉價的具有高通量的系統(HTS系 統)，使用了相應修飾的聚合物箔作為偏振濾光片(參見I. Gryczcynski等.，可目測的偏 振感測，Anal. Chem. 1999，71，1241-1251)。最近的進展使用了無機材料的螢光，例如鑭系元素(M. Kwiatowski等，螯合物 標記的寡核苷酸的固相合成在三色連接酶介導的基因分析中的應用，Nucleic Acids Research, 1994，22，13)和量子點(Μ. P. Bruchez等，半導體納米晶體作為螢光生物標記物， Science 1998，281，2013)。表現出長的發射時間、範圍在微秒級的染料，象鑭系元素螯合 物，需要將染料轉化到流動相中，所以原位分辨檢測是不可能的。在國際專利申請WO 00/72018中描述了用於檢測用金珠標記的樣品的光學機構 以及通過銀放大效應使它們可視化的機構。然而這裡描述的機構只適合於靜態測量中的檢 測。在靜態測量中，將靶與布置在探針陣列上的探針相互作用，在反應開始後，在那些發生 了相互作用的陣列元件上形成了沉澱，然後記錄下圖象，並根據沉澱形成的程度指派測量 的灰度值濃度。在WO 02/02810中提供了通過探針和靶在探針陣列上的分子相互作用在樣品中 定性和/或定量檢測靶的方法，其中陣列元件上沉澱形成的時間依賴性行為以信號強度的 形式被檢測，即執行動力學測量。在描述沉澱的形成作為時間的函數的曲線的基礎上，給每 個陣列元件指派定量陣列元件上探針和靶之間相互作用的值，從而也就是結合的靶的量。這樣的動力學測量需要在例如特定的溫度條件下或在過程的特定階段中記錄圖 象系列，例如在記錄的時間中在存在特定溶液的情況下。這需要高度集成的陣列中每個元 件的複雜的合作，特別是在基因分型領域中應用時。此外，在許多生物醫學診斷測試中存在這樣的問題，即最初存在的靶分子的量不 足以被檢測到，因此通常在實際測試步驟開始之前，首先必須從樣品中擴增靶分子。一般來 說，DNA分子的擴增是通過聚合酶鏈反應(PCR)來進行的。對於RNA的擴增來說，必須通過 反轉錄將RNA分子轉化為相應的互補DNA(cDNA)。然後也可以通過PCR擴增該cDNA。PCR 是標準的實驗室方法(例如在Sambrook等(2001)分子克隆實驗室指南，第三版，Cold Spring Harbor，N. Y.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中)0通過PCR擴增DNA相對較快，通過微型化方法在小體積中允許高樣品通量，並且能 有效地進行自動化操作。但是，只通過擴增來表徵核酸是不可能的。在擴增之後對PCR產物進行表徵還需 要使用一些分析方法，例如核酸序列測定、雜交、和/或電泳分離和分離方法。一般來說，用於擴增和檢測核酸的裝置和方法應該被設計成需要儘可能少的實驗 人員的介入。允許對核酸進行擴增和檢測，並且在該過程中實驗人員只需要最少介入的方 法的優點是顯而易見的。一方面，可以避免汙染。另一方面，這種方法的可重複性相當高， 因為它們可以達到自動化。考慮到診斷方法的合法性，這也是極端重要的。目前，有多種方法可以擴增和檢測核酸，其中首先通過PCR擴增靶物質，然後通過 與探針陣列進行雜交確定靶序列的身份或遺傳狀態。一般來說，在雜交範圍內，為了獲得足夠用於定性和定量檢測所需的處理量，被檢測的核酸分子或靶分子的擴增是必需的。核酸的PCR擴增和它們的雜交檢測都受幾個基本性問題的影響。這也同樣適用於 將核酸的PCR擴增和它們的雜交檢測相結合的方法。在將PCR擴增和它的雜交檢測相結合的方法中，如果在被檢測的核酸或被檢測的 靶分子中插入可檢測的標記物，例如以螢光標記的引物的形式，通常在實際檢測前要執行 清洗步驟。這樣的清洗步驟用於除去未轉化的引物，與擴增的產物相比這些未轉化的引物 的量大得多，以及用於除去帶有螢光標記物的這些核苷酸，它們不參加檢測反應或不與陣 列上的核酸探針特異性雜交。通過這種方式，預計可以減少這些分子引起的高水平信號背 景。但是，這樣一個額外步驟顯著地減慢了檢測方法。此外，那些與微陣列上的核酸探針特 異性雜交的被檢測的核酸的檢測信號也顯著地降低了。後者主要是由於這樣的事實，即通 過雜交結合的靶和溶解的靶之間的平衡在清洗步驟之後不再存在。已經與陣列上的核酸探 針雜交的核酸通過清洗而從結合位點上解離開來，因而與溶解的分子一起被洗掉。即便溶 解的分子的清洗或漂洗步驟被執行得比已經雜交的核酸的解離更快，也僅僅留下可檢測 到的信號。因此，存在對高度集成的陣列的需求，其中探針和靶之間的相互作用可以以極高 的精確性和相對而言很小的技術努力來定性和/或定量地檢測。此外，存在著對裝置的需要，該裝置允許在一個反應空間中執行PCR和分析反應， 例如雜交反應。因此，擺在本發明面前的問題是克服上面提到的本技術領域內的問題，特別是由 於分析方法和測試系統之間缺少相容性而引起的問題。具體來說，擺在本發明面前的問題是分別提供方法和裝置，其中探針和靶之間在 探針陣列上的相互作用可以以極高的精確性和高靈敏度以及以易於使用和成本效率高的 方式來定性和/或定量地檢測。擺在本發明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，用於核酸的擴增和定性定 量檢測，其中實驗人員在檢測步驟中的介入可以被最小化。擺在本發明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，用於核酸的定性和定量檢 測，其中不損害靶分子和陣列上的探針分子之間的相互作用就能確保微陣列上相互作用檢 測中的高信噪比。擺在本發明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，通過它們可以在檢測中獲 得高的動力學解析度，即能夠確保在強的信號殘留中檢測弱的探針/靶相互作用。擺在本發明面前的另一個問題是分別提供方法和裝置，它們允許以高通量速度 幾乎同時對核酸進行擴增和表徵。這些以及其它擺在本發明面前的問題通過提供在發明權利要求中描述的實施方 案得到了解決。

發明內容
本發明提供了定性和/或定量檢測探針分子和靶分子之間的分子相互作用的方 法，其中溶液的替換和/或除去，即具體來說是清洗或漂洗步驟可以被省略。具體來說，本發明的這樣的方法包含下列步驟
a)將含有靶分子的樣品放入帶有微陣列的反應室中，其中微陣列含有底材，其上 探針分子被固定在陣列元件上；b)檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用，其中在將含有靶分子的樣品放入反應室之後以及檢測步驟之前或之中不進行反 應室中溶液的替換和/或不從反應室中除去溶液。此外，在本發明的範圍內提供了適合於實行這些方法的裝置。具體來說，在本發明的範圍內提供了用於定性和/或定量檢測探針和靶分子之間 的分子相互作用的裝置，包括a)具有底材的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，其中微陣列被安排在 裝置的第一個表面上；以及b)反應室，它在上面排列了微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成，其中微陣列和第二個表面之間的距離是可變的。具體來說，微陣列與第二個表面之間距離的可變性通常形成了本發明裝置的檢測 平面，允許由不與微陣列的探針分子具有特異親和性，因而不與它們相互作用的標記的靶 分子引起的信號背景得以顯著減小或完全避免。此外，本發明提供了用於定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用 的方法，包括下列步驟a將含有靶分子的樣品溶液放入上述的本發明裝置的反應室中；以及b檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。本發明用於檢測靶分子的方法和裝置的設計方式使得在執行檢測方法和任選靶 分子的擴增過程中，反應室中需要儘可能少的實驗人員的介入。這樣提供的主要優點是避 免了汙染。此外，與常規方法相比，本發明的方法的可重複性也顯著提高了，因為本發明的 方法由於對外部介入進行了最小化從而更便於自動化。根據診斷方法的要求，上述的優點 發揮了重要作用。此外，為了描述本發明，使用了下面的定義在本發明的範圍內，探針或探針分子或分子探針被理解為是指這樣的分子，它們 由於特定的特徵性結合行為或特定的反應性而被用於檢測其它分子。每種能夠與固體表面 結合併具有特異親和性的分子都可以用作布置在陣列上的探針。在優選實施方案中，它們 是生物聚合物，特別是肽、蛋白、抗原、抗體、碳水化合物、核酸等類別的生物聚合物和/或 其類似物，和/或上述生物聚合物的混合聚合物。在特別優選情況下，探針是核酸和/或核 酸類似物。具體來說，具有確定的已知的序列，被用於雜交方法中檢測靶分子的核酸分子被 稱為探針。DNA和RNA分子都可以用作核酸。例如，核酸探針或寡核苷酸探針可以是具有 10到100個鹼基長度的寡核苷酸，優選情況下具有15到50個鹼基長度，更優選情況下具 有20到30個鹼基長度。本發明中，典型情況下探針是單鏈的核酸分子或核酸類似物分子， 優選為具有至少一個與靶分子的序列區域互補的序列區域的單鏈DNA分子或RNA分子。根 據檢測方法和使用的不同，探針可以被固定在固相支持底材上，例如以微陣列的形式。此 外，根據檢測方法的不同，它們可以被放射性或非放射性標記，以便它們可以通過本技術領 域中常規的檢測方法被檢測。
在本發明的範圍內，靶或靶分子被理解為是指通過分子探針被檢測的分子。在本 發明的優選實施方案中，被檢測的靶是核酸。然而，本發明的探針陣列也可以以類似的方式 用於檢測肽/探針相互作用、蛋白/探針相互作用、碳水化合物/探針相互作用、抗體/探 針相互作用等。在本發明的範圍內，如果靶是通過與布置在探針陣列上的探針進行雜交而檢測的 核酸或核酸分子，該靶分子通常含有40到10000個鹼基長度的序列，優選情況下含有60到 2000個鹼基長度的序列，更優選情況下含有60到1000個鹼基長度的序列，特別優選情況下 含有60到500個鹼基長度的序列，最優選情況下含有60到150個鹼基長度的序列。任選 地，它們的序列也可以含有引物的序列以及由引物確定的模板的序列區域。具體來說，靶分 子可以是單鏈的或雙鏈的核酸分子，其一條或兩條鏈被放射性或非放射性標記，以便它們 可以通過本技術領域中常規的檢測方法被檢測。根據本發明，靶序列是指通過與探針雜交而被檢測的靶序列區域。根據本發明，它 也稱作被探針尋址的該區域。在本發明的範圍內，物質文庫被理解為是指大量不同的探針分子，優選至少2到 1000000個不同的分子，特別優選至少10到10000個不同的分子，最優選100到1000個不 同的分子。在具體的實施方案中，物質文庫也可以只包含至少50個或以下或至少30000個 不同的分子。在優選情況下，物質文庫以陣列的形式布置在本發明裝置的反應室內的支持 物上。在本發明的範圍內，探針陣列被理解為是指分子探針或物質文庫在支持物上的 布局，其中每個探針的位置是單獨確定的。優選情況下，陣列包含了被稱為陣列元件的確定 的位點或預定的區域，它們以特定的方式被特別優選地布置，其中每個陣列元件通常只包 含一種探針。這裡，分子或探針在支持物上的布局可以通過共價的或非共價的相互作用而產 生。這裡，探針被布置在支持物朝向反應室的一面上。布局中，即陣列中的位置通常被稱為
點ο在本發明的範圍內，陣列元件、或預定區域、或點、或陣列點被理解為是指表面上 被確定要安置分子探針的區域；所有被佔據的陣列元件的總和構成了探針陣列。在本發明的範圍內，支持元件、或支持物、或物質文庫支持物或底材被理解是指其 上安裝了探針陣列的固體。支持物，通常也被稱為底材或基體，可以是指例如物體支持物、 或晶片或陶瓷材料。在具體的實施方案中，探針也可以直接固定在第一表面上，優選在第一 表面的分區上。布置在底材或檢測表面上的陣列布局中的全體分子、或布置在底材或檢測表面的 陣列布局中和支持物或底材上的全體物質文庫通常被稱為「晶片」、「微陣列」、「DNA晶片」、 「探針陣列」等。在本發明的範圍內，檢測平面被理解為是指本發明的裝置的第二個表面。在優選 情況下，布置在微陣列上的探針在檢測探針和靶的相互作用的過程中基本上位於檢測平面 中，這實際上是由於微陣列和第二表面之間的距離被減小到幾乎為零。在本發明的範圍內，室體被理解為是指形成反應室的固體。物質文庫支持物或芯 片通常是室體的一部分，其中物質文庫支持物可以由與室體的其它部分不同的材料製成。
在本發明的範圍內，反應室或反應空間被理解為是指在微陣列和第二表面或檢測 平面之間形成的空間，在優選情況下被設計為可變的微隙。反應空間的側面被側壁所限制， 這可以通過例如彈性密封墊來進行。固定在微陣列上的探針位於面向反應室內部的一側 上。反應室或反應空間的底部由陣列的第一或第二表面來界定。具體來說，第二表面或檢 測平面與底材或微陣列的表面之間的距離被稱為反應空間或反應室或微隙的厚度。在本發 明範圍內，反應空間通常只有小的厚度，例如厚度最多1cm、優選情況下最多5mm、特別優選 情況下最多3mm、最優選情況下最多1mm。在本發明的範圍內，微陣列和第二表面之間的距離被理解為是指微陣列底材表 面，即微陣列面向反應空間的一面，與面向反應空間的第二表面的面之間的距離。如果微陣 列與第二表面之間的距離幾乎為零，意味著底材表面均勻平坦地放置在第二表面上。在本發明的範圍內，微隙被理解為是指反應空間，它可以被微陣列和第二表面 之間的毛細作用力充滿。一般來說，微隙具有小的厚度，例如最多1mm，優選情況下最多 750 μ m,特別優選情況下最多500 μ m。根據本發明，範圍在10 μ m到300 μ m、15 μ m到 200 μ m和/或25 μ m到150 μ m之間的厚度優選作為微隙的厚度。在具體的實施方案中，微 隙的厚度為50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m或90 μ m。在本發明的範圍內，如果反應空間或反應 室的厚度超過2mm，則反應空間或反應室將不再被稱為微隙。在本發明的範圍內，倉(cartridge)或反應倉被理解為是指具有室體和相應外套 的反應室的單元。在本發明的範圍內，共聚焦螢光檢測系統被理解為是指螢光檢測系統，其中物體 在物鏡的焦距平面上通過點光源照明。這裡的點光源、物體和點光線檢測器準確地位於光 學共軛平面上。共聚焦系統的例子在A.Diaspr0，共聚焦和二維光子顯微術基礎、應用與 進展，Wiley-Liss，2002中有描述。在本發明的範圍內，為整個反應室成像的螢光光學系統被理解為是指非共聚焦的 螢光檢測系統，即螢光檢測系統，其中利用點光源的照明不只限於物體。因此這樣的螢光檢 測系統沒有焦距限制。本發明的範圍內的常規陣列或微陣列在優選例如Imm到4mmXlmm到4mm、優選為 2mmx2mm的方型表面上包含了大約50到10000、優選為150到2000個不同種類的探針分子。 在本發明範圍內的其它實施方案中，微陣列在幾mm2到幾cm2、優選大約Imm2到IOcm2、特別 優選為2mm2到1cm2、最優選大約4mm2到6. 25mm2的表面上包含了大約50到大約80000、優 選大約100到大約65000、特別優選大約1000到大約10000個不同種類的探針分子。例如， 常規的微陣列在2mmX2mm的表面上具有100到65000個不同種類的探針分子。在本發明的範圍內，標記或標記物被理解為是指可檢測的單位，例如螢光團或其 上可以連接可檢測單位的錨定基團。在本發明的範圍內，擴增反應通常包含10到50個或更多的擴增循環，優選大約25 到45個循環，特別優選為大約40個循環。在本發明的範圍內，循環擴增反應優選為聚合酶 鏈反應(PCR)。在本發明的範圍內，擴增循環是指循環擴增反應的單一增加步驟。PCR的增加步驟 也被稱為PCR循環。在本發明的範圍內，擴增產物是指通過循環擴增反應、優選通過PCR擴增的核酸分子的增加或拷貝或擴增而得到的產物。通過PCR方法擴增的核酸分子也被稱為PCR產 物。在本發明的範圍內，變性溫度被理解為是指在擴增循環中雙鏈DNA被分開時的溫 度。通常情況下、特別是在PCR中，變性溫度高於90°C，優選大約95°C。在本發明的範圍內，退火溫度被理解為是指引物與被檢測的核酸雜交時的溫度。 通常情況下、特別是在PCR中，退火溫度在50°C到65°C的範圍內，優選大約60V。在本發明的範圍內，鏈延伸溫度或延伸溫度被理解為是指通過插入單體元件合成 核酸時的溫度。通常情況下、特別是在PCR中，延伸溫度在大約68°C到大約75°C的範圍內， 優選大約72 °C。在本發明的範圍內，寡核苷酸引物或引物是指與被檢測的DNA、也被稱為靶DNA結 合或雜交的寡核苷酸，其中在循環擴增反應中，被檢測的DNA的互補鏈的合成從結合位點 開始。具體來說，引物是指優選具有大約12到30個鹼基的短的DNA或RNA寡核苷酸，它與 較大的DNA或RNA分子的一部分互補，並在其3』-末端具有游離的3-羥基基團。由於該遊 離的3』-羥基基團，引物可以作為任何任選的DNA或RNA聚合酶的底材，該聚合酶在引物上 以5』-3』的方向合成核苷酸。此處，新合成的核苷酸的序列由與引物雜交的模板序列中位 於引物的游離3』 -羥基之後的序列所預先決定。常規長度的引物包含12到50個核苷酸， 優選在15到30個核苷酸之間。作為模板用於合成互補核酸鏈的雙鏈核酸分子或核酸鏈通常被稱為模板或模板 鏈。在本發明的範圍內，分子相互作用或相互作用被理解為是指靶分子和固定化的探 針分子之間特異性的、共價的或非共價的鍵。在本發明的優選實施方案中，探針和靶分子之 間的相互作用是雜交。從互補的單鏈核酸分子形成雙鏈核酸分子或雙鏈體分子被稱為雜交。此時，結 合優選總是發生在A和T或G和C鹼基對之間。在雜交的範圍內，例如DNA-DNA雙鏈體、 DNA-RNA雙鏈體或RNA-RNA雙鏈體可以形成。通過雜交，具有核酸類似物的雙鏈體也可以形 成，例如DNA-PNA雙鏈體、RNA-PNA雙鏈體、DNA-LNA雙鏈體和RNA-LNA雙鏈體。雜交實驗通 常被用於檢測序列互補性，因此可以檢測兩個不同核酸分子的身份。在本發明的範圍內，處理被理解為是指純化、濃縮、標記、擴增、相互作用、雜交和/ 或清洗和漂洗步驟以及其它在利用物質文庫檢測靶的過程中進行的方法步驟。檢測本身不 落入術語處理之下。在本發明的範圍內，樣品或樣品溶液或被分析物或溶液是被分析的液體，具體來 說其中包含了被檢測以及可能需要被擴增的靶分子。此外，除了常規的添加劑例如緩衝液 之外，這種溶液中也可以包含執行擴增反應所需的物質，例如引物。在本發明的範圍內，從反應室中替換反應室中的溶液具體來說是指漂洗或清洗步 驟。替換溶液用來例如除去用可檢測的標記物標記的、不能與微陣列上的探針發生特異性 相互作用的分子，這可以在完成相互作用之後通過用無標記的溶液替換樣品溶液來進行。 不與微陣列上的探針發生特異性相互作用的分子是例如用可檢測的標記物標記的、但在擴 增反應中還沒有被轉化的引物，或者是用可檢測的標記物標記的、但在陣列上不具有互補 探針的靶分子，所述互補探針與所述靶分子發生特異性相互作用。
在本發明的範圍內，從反應室中除去溶液被理解為是指這樣的步驟，通過該步驟 可以將用可檢測的標記物標記的、但不與微陣列上的探針發生特異性相互作用的分子從反 應室中除去。不與微陣列上的探針發生特異性相互作用的分子是例如用可檢測的標記物 標記的、但在擴增反應中還沒有被轉化的引物，或者是用可檢測的標記物標記的、但在陣列 上不具有互補探針的靶分子，所述互補探針與所述靶分子發生特異性相互作用。在本發明的範圍內，如果在將含有靶分子的樣品注入反應室和檢測相互作用之間 不進行反應室中溶液的替換和/或不從反應室中除去溶液，可以想像在這段時期內可以另 外將溶液注入反應室中，而不替換或除去已經存在於反應室中的溶液。因此，本發明的第一個目標包含了定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的相互 作用的方法，具體來說包含下列步驟a)將含有靶分子的樣品注入含有微陣列的反應室中，其中微陣列含有底材，其上 探針分子被固定在陣列元件上；b)檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。其中在將含有靶分子的樣品注入反應室之後和檢測步驟之前或之中不進行反應 室中溶液的替換和/或不從反應室中移出溶液。在本發明的這個方面，本發明的方法的基本特徵是在檢測被檢測的靶分子和固定 在微陣列的底材上的探針分子之間的相互作用的過程中不進行反應室中溶液的替換或不 從反應室中取出溶液。也就是說，在相互作用後不需要漂洗或清洗步驟，以及/或在相互作 用後不從反應室中除去不與微陣列上的探針特異性相互作用的分子，就可以進行靶和探針 之間相互作用的檢測。在本發明的方法中，具體來說這可以通過焦距選擇性檢測方法來保證，例如通過 共聚焦技術或通過樣品底物中、基於深度選擇性照明、由於例如總反射引起的激發光的逐 漸消失解偶聯(TIFR)，或者使用基于波導的方法。在為了增加靈敏度進一步排除由存在於 液體中、即未雜交的螢光分子引起的背景信號的情況下，這樣的焦點選擇性方法將是特別 優選的。使用螢光標記的靶分子，通過使用象總內部反射螢光顯微術(TIRF)或共聚焦螢光 顯微術這樣的方法，可以將特異性相互作用信號與背景螢光區分開來。這種例子是基於CCD的檢測器，它在暗視野中通過入射光或透射光執行熒 光團的激發，以辨別光學效應如散射和反射(參見例如C. E. Hooper等，在生命科 學中使用增強式C⑶相機進行定量光子成像，Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990), p. 337-344)。其它替代的能夠用於本發明的方法的螢光檢 測系統是例如在WO 00/12759、WO 00/25113和WO 96/27025中描述的白燈裝置，例如在 US 5，324，633、US 6，027，880、US 5，585，639 和 WO 00/12759 中描述的共聚焦系統，例如 在US 5，760，950中描述的基於共聚焦成像中的Nipkow盤的共聚焦激發系統，例如在WO 98/57151中描述的基於結構化激發分布的系統，例如在WO 99/27140中描述的使用微型光 學元件的大規模集成螢光檢測系統，以及例如在WO 00/12759中描述的雷射掃描系統。使 用這種常規螢光檢測系統的螢光檢測方法的總的進展在例如US 5，324，633中有描述。在WO 2004/087951中描述的裝置，其中的反應室通過微隙形成，特別適合於 執行本發明的檢測方法，無需替換反應室中的溶液和/或不從反應室中移出溶液。WO 2004/087951的相關內容在此明確地引用。
在本發明的這個方面的另一個實施方案中，反應室中溶液的替換和/或除去的步 驟被避免，這是通過檢測陣列表面上的質量變化來進行檢測的，例如在WO 03/004699中描 述的那樣。WO 03/004699的相關內容在此明確地引用。在本發明的這個方面的另一個實施方案中，反應室中溶液的替換和/或除去 的步驟被避免，這是通過檢測聲學表面波來進行檢測的，例如在Z. Guttenberg等，Lab Chip. 2005 ；5 (3) =308-17 中描述的那樣。在本發明的這個方面的另一個實施方案中，反應室中溶液的替換和/或除去的步 驟被避免，這是通過陣列表面的電極的電化學檢測來進行檢測的，例如通過測量氧化還原 電勢的改變(參見例如 X. Zhu 等，Lab Chip. 2004 ；4(6) :581-7)或 cyclic voltometry (參 見例如 J. Liu 等，Anal Chem. 2005 ；77 (9) :2756-2761 J. Wang, Anal Chem. 2003 ；75(15) 3941-5)。在本發明的這個方面的另一個實施方案中，反應室中溶液的替換和/或除去的步 驟被避免，這是通過陣列表面的電極的電檢測來進行檢測的，例如通過阻抗測量(另外參 B S. M. Radke φ, Biosens Bioelectron. 2005 ；20 (8) :1662-7) 在本發明的這個方面的另一個實施方案中，反應室中溶液的替換和/或除去的步 驟被避免，這是通過使用具有FRET探針(FRET，螢光共振能量轉移)的微陣列來進行的。這 種FRET探針的使用是基於螢光淬滅劑對的形成，從而使只有當靶分子與表面上的互補探 針結合時才產生螢光信號。FRET探針的使用在例如B. Liu等，PNAS 2005，102，3，589-593 ； K. Usui 等，Mol Divers. 2004 ；8 (3) :209-18 J. A. Cruz-Aguado 等，Anal Chem. 2004 ； 76(14) :4182-8 和 J. Szollosi 等，J Biotechnol. 2002 ；82 (3) :251-66 中有描述。在本發明的這個方面的另一個優選實施方案中，反應室中溶液的替換和/或除去 的步驟被避免，這是通過使用下面詳細描述的用於定性和/或定量檢測探針和靶分子之間 分子相互作用的本發明裝置來實現的，其中該裝置包含a)具有底材的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，其中微陣列被安排在 裝置的第一個表面上；以及b)反應室，在上面排列了微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成，其中微陣列和第二個表面之間的距離是可變的。本發明的另一個目標涉及使用上述的FRET探針分子，和/或從下列的組中選擇的 檢測方法上述的總內部反射螢光顯微術(TIRF)，上述的共聚焦螢光顯微術，上述的檢測 質量改變的方法，上述的檢測聲學表面波的方法，上述的電化學和/或電學檢測方法，以避 免在將含有靶分子的樣品注入反應室期間或之後、以及在定性和/或定量檢測探針和靶分 子之間的分子相互作用的方法中檢測之前或期間替換反應室中的溶液和/或從反應室中 除去溶液，具體來說包含下列步驟a)將含有靶分子的樣品溶液注入含有微陣列的反應室中，其中微陣列含有底材， 其上探針分子被固定在陣列元件上；b)檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。本發明的另一個目的具體來說是用於定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的 分子相互作用的裝置，包含a)具有底材的微陣列，其上探針分子被固定在陣列元件上，其中微陣列被安排在裝置的第一個表面上；以及b)反應室，在上面排列了微陣列的第一個表面和第二個表面之間形成，其中微陣列和第二個表面之間的距離是可變的。在探針分子和靶分子之間完成相互作用後，由樣品溶液中存在的、不與探針分子 相互作用的標記的分子引起了不希望的背景。具體來說，在探針和/或靶分子是核酸和/ 或核酸類似物的情況下，該背景是由存在於樣品溶液中不與探針分子雜交的標記的引物和 /或標記的核酸引起的。已知除去幹擾的背景信號的可能性是在相互作用完成之後用未標記的、例如無熒 光的溶液替代樣品溶液。但是，由於溶蝕、溶液的老化以及不滲透性問題，這種改變一般來 說是浪費的並容易受到幹擾。本發明的裝置的基本特徵是微陣列和第二表面之間的距離是可變的。微陣列和第 二表面之間的距離的可變性意味著本發明的裝置的反應室是可壓縮的。具體來說，微陣列 和第二表面之間的距離的變化方式使得微陣列可以均勻地和/或可逆地放置在第二表面 上，或可以將其活性一面、即其上固定了核酸探針的一面壓在該表面上。因此，可壓縮的反應室允許在進行檢測之前通過減小微陣列和檢測平面之間的距 離來替換含有不與探針分子相互作用、因而構成不希望的背景的標記分子的樣品溶液。通 過這種方式，有可能在檢測之前不用非標記的溶液替換樣品溶液，就能夠使用任何光學檢 測系統檢測探針和靶分子之間的相互作用。例如，通過本發明的裝置，不用非標記的溶液替 換樣品溶液，使用DNA晶片的簡單螢光顯微成像技術檢測相互作用信號，特別是弱的螢光 液體，是可能的。具體來說，通過下面描述的本發明的裝置的實施方案，最終可以確保不再需要光 學檢測系統的聚焦。因此，本發明的裝置允許例如使用不具有自動對焦功能的簡單的螢光 顯微鏡裝置作為讀取裝置，用來檢測靶和探針之間的雜交，而不需要液體操作步驟，具體來 說例如清洗步驟來除去不與陣列結合的靶分子，例如未雜交的靶核酸，這與迄今為止用於 檢測核酸的螢光光學檢測系統相反。儘管通過本發明的裝置進行多功能樣品處理和分析是可行的，仍提供了用於檢測 和任選擴增樣品中的靶分子的成本效率非常高的系統。本發明的裝置、特別是與光學檢測 系統相連後，更加耐用，以至於它們也適合於移動使用。通過適當地選擇晶片、處理方案和分析的化合物，本發明的裝置可以被用於大多 數不同類型的基因分析，例如誘因診斷、病菌診斷和分型。因此，在本發明的裝置中，可以 使用很少的設備執行完全的遺傳分析，它也能夠作為一次性倉使用。因此，本發明的裝置允 許執行在位的檢測方法，例如在獻血過程中。測量結果可以快速獲得，優選在0. 5到2小時 之內。所有可以使用本發明的裝置操作的步驟，例如純化、處理、擴增核酸和實際的雜交都 可以自動執行。操作者只需要熟悉樣品的撤回、樣品在本發明的裝置中的注入，以及注意分 析結果。在優選情況下，微陣列和第二表面之間的距離在大約0到大約Imm的範圍內變化。 微陣列和第二表面之間距離的進一步優選的下限是大約0. 1 μ m，大約1 μ m，和大約10 μ m。 微陣列和第二表面之間距離的進一步優選的上限為大約0. 01mm、大約0. 5mm、大約1mm，最 優選的是大約0. 3mm。令人吃驚的是，如果底材表面和第二表面之間的距離大約為零或接近零，探針和陣列表面上的靶之間的相互作用甚至不受影響。在優選情況下，本發明的裝置還含有檢測系統。此時，在優選情況下檢測系統是光 學系統。適合於本發明的範圍的系統的例子是基於螢光、光吸收、共振轉移等的檢測系統。 在優選情況下，光學檢測系統是螢光光學系統。在特別優選的情況下，螢光光學系統是不具 有自動對焦的螢光顯微鏡，例如具有固定焦距的螢光顯微鏡。在另一個實施方案中，檢測系統與至少一個調距橫板相連，它位於第二表面之上， 可以調整檢測系統和第二表面之間的距離。如果微陣列和第二表面之間的距離大約為零， 該調距橫板也確定了晶片表面與檢測裝置的光學系統之間的距離。因此，保持光學檢測裝 置和微陣列表面之間的距離變化在很小的範圍內是可能的。這種變化只包含第二表面，一 般為玻璃表面的厚度變化，第二表面的偏斜，晶片和檢測平面之間或調距橫板和檢測平面 之間的壓制表面上可能的汙染物引起的層的厚度。這使得重新對焦使光學系統進入焦點成 為不必需，極大地簡化了裝置的操作，並/或使得昂貴的自動對焦裝備成為不必需。在另一個實施方案中，為第一和第二表面之間形成的反應空間提供了側面限制的 補償區域，當微陣列和第二表面之間的距離減小時，它能夠保持反應室中的體積基本上恆 定。在優選情況下，在第一和第二表面之間形成的反應空間在側面進一步受到彈性密 封墊的限制。特別優選情況下，彈性密封墊由矽橡膠製成。為了確保探針和靶分子之間相互作用的檢測，具體來說，第二表面由透光的材料， 優選為玻璃製成。在本發明的裝置的另一個實施方案中，第一表面，至少在其位於微陣列之下的區 域中，被開發成能夠相對於第二表面指導微陣列，使得微陣列與第二表面之間的距離是可 變的。此時，第一表面，至少在其位於微陣列之下的區域中，可被開發成能夠朝向第二表 面指導微陣列，以便微陣列和第二表面之間的距離可以被減小，和/或能夠背向第二表面 指導微陣列，以便微陣列和第二表面之間的距離可以被增加。在本實施方案中，在優選情況下第一表面，至少在其位於微陣列之下的區域中，可 以被彈性變形。在特別優選情況下，第一表面由彈性合成材料例如彈性膜製成。另外優選的是第一表面由兩個重疊的層形成，兩個重疊的層的外層至少在位於微 陣列之下的區域具有凹口。在本實施方案中，優選情況下兩個重疊的層的內層由彈性密封 墊或密封膜形成，它們通常也限制了反應空間的側面(參見圖6)。密封膜可以被導向第二 表面。密封膜封閉了外層上的凹口，它通常對應於室體的較低的一面。在反應室進行PCR 的過程中，由於PCR中普遍存在的高溫產生了內部壓力，儘管密封膜相對不穩定，仍然使 反應室產生壓力抗性。因此本實施方案對應於自關閉的閥。為了確保密封膜的彈性，優選 情況下膜被提供有補償褶(參見圖6)。還可以提供裝置，該裝置包含至少一種工具，通過該工具可以相對於第二表面指 導微陣列。在下文中，該工具將被稱為指導第一表面的工具。該指導第一表面的工具優選 選自杆、針、挺杆和螺釘。此時，裝置可以包含至少一種指導第一表面的工具，通過該工具可以將微陣列導 向第二表面，使得微陣列和第二表面之間的距離可以被減小，和/或能夠背向第二表面指導微陣列，使得微陣列和第二表面之間的距離可以被增加。在特別優選的情況下，可以通過在第一表面上由工具施加壓力和/或牽引來相對 於第二表面指導微陣列。此時，上述安置在第二表面上的調距橫板可以用作指導第一平面的工具的支架。在優選情況下，可以通過指導第一表面的工具引起第一表面的震動，特別是以10 到30Hz的頻率震動，特別優選的是以大約20Hz的頻率震動。以這種方式，可以除去晶片上 存在的可能干擾檢測的泡，和/或通過指導第一表面的工具的震動引起的充分混合增加相 互作用的速度，例如雜交速度。在優選情況下，也可以相對於第一表面指導第二表面，使得微陣列和第二表面之 間的距離可變。此時，可以相對於第一表面指導第二表面，使得微陣列和第二表面之間的距離可 以被減小，和/或使得微陣列和第二表面之間的距離可以被增加。具體來說，這可以確保通過調距橫板在第二表面上施加壓力和/或牽引使第二表 面可以相對於第一表面進行引導，使得微陣列和第二表面之間的距離可變。在本發明的裝置的另一個優選實施方案中，第一表面和第二表面都可以被指導， 以便微陣列和第二表面之間的距離可變。在另一個實施方案中，本發明的裝置被開發成已經在原始狀態下的固定在第一表 面上的微陣列在優選情況下均勻地安置在第二表面上以形成檢測平面。可以對第一表面進 行指導以便微陣列和第二表面之間的距離增加。此時，第一表面優選由彈性材料製成。在本發明的裝置的另一個實施方案中，第一表面被開發成圍繞旋轉軸的可旋轉的 方式。旋轉軸將第一表面分成兩面。在本實施方案中，微陣列被安排在第一表面的第一個 側面部分上。在優選情況下，用於旋轉運動的旋轉軸通過第一表面的中心，即在優選情況下 兩個側面部分是相等大小的。在優選情況下第一表面由彈性材料製成。在可旋轉的第一表面的第一個位置，第一表面被排列得基本上平行於第二表面。 在第一位置上，微陣列的表面與第二表面基本上平坦地接觸，即其上固定有探針分子的底 材表面基本上不被樣品溶液弄溼。在該第一位置上，在第一表面的第二個側面部分和第二 表面之間形成了一個空間，它在後面也被稱為處理室。該處理室可以作為處理樣品溶液的 室。在可旋轉的第一表面的第二個位置，第一表面被排列得相對於第二表面成180° 以外的角度。在該第二個位置上，微陣列的表面不與第二表面接觸，即固定在微陣列底材上 的探針分子可以自由接近樣品溶液中存在的靶分子，因此能夠與後者相互作用。在第二個 位置中，處理室被壓縮。可旋轉的第一表面在優選情況下可以通過在第一表面的第一個側面部分上施加 牽引力來旋轉，和/或通過在第一表面的第二個側面部分上施加壓力來旋轉。壓力和/或 牽引力可以通過上述的用於指導第一表面的工具來施加。晶片或底材或第一表面在優選情況下可以由矽、陶瓷材料如氧化鋁陶瓷、浮法硼 矽玻璃(borofloat)、石英玻璃、單晶CaF2、藍寶石、黃玉、PMMA、聚碳酸酯和/或聚苯乙烯構 成。對材料的選擇也依賴於裝置或晶片所使用的目的而進行。如果例如晶片被用於表徵 PCR產物，只有那些能夠抗拒95°C溫度的材料可以使用。
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在優選情況下，晶片通過核酸分子，具體來說通過DNA或RNA分子而官能化。但是， 它們也可以通過肽和/或蛋白例如抗體、受體分子、藥物活性肽和/或激素、碳水化合物和 /或該生物聚合物的混合聚合物而官能化。在另一個優選實施方案中，分子探針通過聚合物接頭例如改性的矽烷層固定在底 材表面上。這樣的聚合物接頭可以用於底材表面的衍生製備，因此可以用於分子探針的固 定化。在探針共價結合的情況下，可以使用已經用反應性官能團例如環氧化物或醛類進行 官能化或改性的聚合物如矽烷。此外，本領域的專業人員也熟悉通過異硫氰酸酯、琥珀醯亞 胺和醯亞胺酯對表面進行活化。最後，通常相應地衍生出氨基官能化的表面。此外，加入偶 聯試劑例如二環己基碳二亞胺能夠確保分子探針相應的固定化。反應室的室體在優選情況下由例如玻璃、合成材料、和/或金屬例如高等級鋼、鋁 和黃銅這樣的材料構成。為了生產室體，可以使用例如適合於注模法的合成材料。尤其是 例如macrolon、尼龍、PMMA和特氟隆這樣的合成材料是可能的。在具體的實施方案中，優選 的是導電的合成材料例如含有5%到30%碳纖維的聚醯胺，含有5%到30%碳纖維的聚碳 酸酯，含有2%到20%不鏽鋼纖維的聚醯胺，以及含有5%到40%、特別是20%到30%碳纖 維的PPS。可以選擇和/或可以加上的是，第一和第二表面之間的反應空間可以通過隔片關 閉，該隔片允許例如利用注射器填充反應空間。在優選實施方案中，室體由透光的材料例如 玻璃、PMMA、聚碳酸酯、聚苯乙烯和/或黃玉構成。此時，材料的選擇將根據裝置的使用目的 進行調整。例如當選擇材料時需要考慮到裝置將要暴露到的溫度。如果，例如裝置將要用 於執行PCR，只有那些在如95°C的溫度下能夠較長時間保持穩定的材料可以使用。具體來說，室體被開發成能夠使微陣列用其活性面，即其上固定有核酸探針的陣 列面均勻地和/或可逆地壓向第二表面。在具體的實施方案中，本發明的裝置含有從下列的組中選擇的模塊優選由合成 材料製成的室體，密封反應室的隔板或密封墊，DNA晶片，和/或第二個透光的表面，優選為 玻璃窗格，其中第二表面也可任選同時用作晶片(參見圖2和圖3)。在本實施方案中，室體 和密封墊被開發成具有彈性，以便DNA晶片可以以其活性面均勻和可逆地壓向玻璃蓋。由 此，位於DNA晶片和檢測表面之間的標記的分析液體被完全置換(參見圖5和圖6)。通過 這種方式可以進行高靈敏度的螢光檢測例如計算機成像的螢光顯微術，而不受樣品溶液的 背景螢光的損害。在優選情況下，室體的第二表面由透明的材料如玻璃和/或透光的合成材料如 PMMA、聚碳酸酯、聚苯乙烯或丙烯酸樹脂構成。在優選情況下，反應室在第二表面和微陣列之間以具有可變厚度的微隙的形式形 成。通過在晶片和檢測平面之間形成微隙，可以利用毛細作用力安全地填充反應室。該毛 細作用力也發生在反應室無壓縮的狀態中；但是它們可以通過壓縮反應室來增加。在特別 優選的情況下，微隙的厚度在大約Om到大約IOOm的範圍內。從能夠壓縮反應空間從而減小微陣列和檢測平面之間的縫隙的寬度的可能性，帶 來了在反應室中操作液體的其它可能性。因此，在本發明的另一個實施方案中，提供了幾個 小室代替一個單一的室，其中該小室之間的分區不達到第二表面的高度，以便在反應室未 壓縮的狀態下小室之間能夠產生流體聯繫。通過壓縮反應室可以將小室分開。因此通過壓 縮，小室之間的分區可以像閥門一樣操作。
該通過閥門分開的小室的具體實施方案是將本發明的裝置的反應空間進一步分 成不同的PCR室。在每個室中呈現單獨的引物。開始時，小室被同時充滿被分析物。然後 將反應空間壓縮。此後，反應空間經歷PCR的溫度循環。因為每個小室充滿不同的引物，在 每個室中發生不同的擴增反應。室之間的交換不會發生。在PCR進行之後發生雜交。此時，每個小室可以含有單獨的晶片區域或單獨的芯 片。但是，也可能通過增加微陣列與第二表面之間的距離促進小室之間的流體聯繫，以便被 擴增的不同物質混合併以這種方式與晶片表面雜交。具有被閥門分開的小室的實施方案的優點是增加了 PCR的多重性，即一個樣品進 行獨立的PCR的數量，在一步反應中由於生物化學的原因受到限制。因此，將PCR的數量調 整到晶片表面上可能的探針數量是可能的。因此，在本發明的另一個實施方案中，反應室包含了至少兩個小室，其中在第一個 未壓縮狀態中小室是有流體聯繫的，在第二個壓縮的狀態中在小室之間沒有流體聯繫。在特別優選情況下，每個小室被指派到微陣列的確定區域。具體來說，小室可以通過用孔洞裝備微陣列和/或第二表面來形成，所述孔洞用 作小室之間的壁。在特別優選情況下，小室之間的壁由彈性密封墊形成。當然，具有用閥門分開的小室的處理單元的實施方案可以任意地與任何前述的壓 縮原理相結合。在本發明的裝置的另一個實施方案中，第一表面由部分可變形的彈性材料例如彈 性膜製成。在只有一部分反應空間可以被壓縮的情況下，可以產生晶片被導向第二表面的 小室、不能彼此分開的小室以及不能被改變的小室。因此，能夠例如在擴增反應結束時將鹽 泵入雜交室的簡單的泵系統可以在反應空間中使用。這對於例如最適化PCR緩衝液的化學 雜交條件來說可能是有利的，其中PCR緩衝液僅僅為了執行PCR而最適化。當將反應室分成幾個小室時，優選使用幾種工具進行攪拌。通常情況下，攪拌的工 具與指導第一表面的工具相同。因此，單獨的室可以被特異性地攪拌。這可能適合於例如 執行分離的擴增空間和/或雜交空間。當然，本發明的裝置的這個具有幾種攪拌工具的實施方案也可以任意地與任何前 述的壓縮原理相結合。上述選自室體、側面限制反應空間的密封墊、微陣列和檢測平面的本發明的裝置 的元件或模塊形成了本發明的裝置的所謂的處理單元。在處理單元中，可以進行PCR、雜交 反應、檢測和/或評估。在探針和靶是例如待檢測的抗體和蛋白的情況下也是同樣，由此不 需要執行PCR。但是，下面的解釋是專門針對使用核酸靶和探針的檢測技術而做的。然而， 對於本領域的專業人員來說，如何對下面描述的單元進行修飾以使它們適合於其它的應用 是很清楚的。在優選情況下，本發明的裝置的處理單元以模塊的方式構建。這意味著處理單元 可以包含模塊的任意組合。在分析過程中也可以交換模塊。在另一個優選實施方案中，本發明的裝置還包含溫度控制和/或調節單元以控制 和/或調節反應室中的溫度。這樣的用於控制和/或調節反應室中的溫度的溫度控制和/ 或調節單元具體來說包含加熱和/或製冷元件或溫度組塊。此時，加熱和/或製冷元件或溫度組塊可以被安排成與第一表面和/或第二表面相接觸。通過與第一和第二表面都接觸， 可以確保特別有效的溫度控制和調節。在本實施方案中，微陣列的底材或第一表面和/或第二表面與加熱和/或製冷元 件或溫度組塊相連接，在優選情況下它們應該由具有良好的導熱性質的材料製成。這種導 熱材料提供了顯著的優點，確保在反應空間的整個表面上有著均勻的溫度分布，從而允許 在整個反應室中均勻地執行溫度依賴性的反應例如PCR，並得到高的產率，並且可以高準確 地控制或調節。因此，在優選實施方案中，微陣列的底材或第一表面或第二表面由具有良好導 熱性的材料製成，其具有的熱傳導率優選在15到SOOWnr1K-1的範圍內，特別優選在50到 SOOWnr1K-1的範圍內，最優選在100到ZOOWnr1K-1的範圍內，其中的材料通常是不透光的。適 合的導熱材料的例子是矽，陶瓷材料如氧化鋁陶瓷，和/或金屬如高級別鋼、鋁、銅或黃銅。如果本發明的裝置的微陣列底材或第一表面或第二表面基本上由陶瓷材料構 成，優選使用氧化鋁陶瓷。這樣的氧化鋁陶瓷的例子是Kyocera公司(Neuss，Germany)生 產的陶瓷 A-473、A-476 和 A-493。在優選情況下，微陣列底材或第一表面或第二表面裝備有任選小型化的溫度傳感 器和/或電極，或者在其背面，即背離反應室的一面具有加熱器裝置，以便可能通過誘導的 電滲透流對樣品液體進行回火和混合。溫度傳感器可以被開發成例如鎳-鉻薄膜阻抗溫度傳感器。電極可以被開發成例如金-鈦電極，特別是四極。加熱和/或製冷元件在優選情況下可以被選擇，以便可能在反應室中對液體進行 快速加熱和冷卻。此時快速加熱和冷卻被理解為是指可以通過加熱和/或製冷元件介導範 圍在0. 2K/s到30K/s之間、優選0. 5K/s到15K/s之間、特別優選2K/s到15K/s之間、最優 選8K/s到ΙΙ/s之間或大約lOK/s的溫度變化。在優選情況下，加熱和/或製冷元件也可 以介導lK/s到lOK/s之間的溫度變化。加熱和/或製冷元件例如阻抗加熱器可以被開發成例如鎳-鉻薄膜阻抗加熱器。對於溫度傳感器、加熱和/或製冷元件或增加溫度的工具和電極的進一步詳細規 格和大小，可以參考國際專利申請WO 01/02094的內容。在優選實施方案中，反應室的回火通過使用由導電材料構成的室體來確保。這樣 的導電材料在優選情況下是導電的合成材料，例如任選含有5%到30%碳纖維的聚醯胺、 任選含有5%到30%碳纖維的聚碳酸酯、和/或任選含有2%到20%不鏽鋼纖維的聚醯胺。 優選情況下，含有5%到40%、特別優選是20%到30%碳纖維的PPS(聚苯硫醚)被用作導 電合成材料。另外在優選情況下室體被開發成具有膨脹和變細的部分。室體中的這種膨 脹和變細的部分允許對反應室或相應的表面進行特定的加熱。此外，使用這種體積的導體 的優點是，即使是使用的材料任選具有較低的導熱性，也可以確保室體或相應的表面被均 勻地回火，因為熱被釋放到每個體積元件中。偶聯和導出熱到反應空間中可以通過不同的方式進行。尤其是可以考慮通過外部 微波輻射、內部或外部阻抗加熱、內部感應線圈或表面、水製冷和加熱、摩擦、光照、特別是 用紅外光照、空氣冷卻和/或加熱、摩擦、溫度發射器和珀耳帖元件帶入熱量。反應空間中溫度的測量可以以不同的方式進行，例如通過集成阻抗傳感器、半導體傳感器、光波指導的傳感器、多色染料、多色液晶、外部高溫計例如所有類型的頂輻射和 /或溫度傳感器，它們被整合在指導微陣列的工具中。反應室中溫度的測量還可以通過下面的方式來進行，通過在室體中整合溫度傳感 器，例如通過在室體的生產加工過程中注入，通過使用高溫計UR傳感器和/或溫差電堆進 行非接觸性測量，通過用例如整合在裝置中的熱傳感器並與室體或室的適當表面或適當體 積相接觸進行接觸測量，通過測量檢測平面的折射指數的溫度依賴性變化，通過測定例如 溶液中、探針陣列上或室密封墊中特定分子的顏色的溫度依賴性變化，和/或通過測量所 用溶液的PH值的溫度依賴性變化，所述pH值的變化可以通過測量pH敏感的指示劑的顏色 變化，例如通過測量其吸收值。此外，由於加熱器電阻的急速增加，可以實現對溫度的自動限制，其中相應的閾值 溫度優選在95°C到110°C的範圍內。當達到閾值溫度時，加熱器的電阻急速增加，從而實際 上沒有電流流過，因而實際上不再有熱放出。具體來說，聚合物例如導電的聚醯胺可以用於 這樣的加熱器，它的電阻在閾值溫度下由於聚合物基體的改變或相的改變而增加。在一個實施方案中，溫度控制和調節單元被集成在第一表面和/或第二表面中。 在該實施方案中，具體來說處理單元裝配有加熱器(參見圖4)，它用於執行PCR和雜交中的 溫度改變。在優選情況下，處理單元具有低的熱容量，以便在低的電力需求下可以實現最大 的溫度改變速度，例如至少漲/s。為了確保處理單元快速冷卻，另一個優選實施方案打算提 供製冷系統，例如空氣冷卻系統。在優選情況下，處理單元的冷卻可以通過持續地將處理單元周圍的空間回火到降 低的溫度、從而被動地冷卻倉來實現。這使得主動地冷卻反應倉成為不必需。在另一個實施方案中，溫度控制和調節單元可以包含溫度組塊，其中每個被預熱 到確定的溫度。在該實施方案中，具體來說處理單元沒有集成加熱器。由於省略了集成加 熱系統，可以提供更合算的處理單元。由於溫度組塊與本發明的裝置的第一表面和/或第二表面接觸，在優選情況下確 保溫度控制和調節單元的溫度組塊之間的熱轉移。在優選情況下，溫度組塊可以被排列成 線型或排列在旋轉盤上，並且以這種方式集成在例如檢測裝置中。圖7顯示了具有幾個溫 度組塊的旋轉盤，每個溫度組塊被調整到確定的溫度。通過交換處理單元下方的溫度組塊， 處理單元被帶到溫度組塊所限定的特定溫度下。在優選情況下，溫度組塊的生產使得它們 比處理單元具有明顯高的熱容量，以便在該實施方案中也可以實現最大的溫度改變速度， 例如至少漲/s。在優選情況下，溫度組塊僅僅是溫度調節型的而不是加熱或製冷型的，以 便在這種情況下對能量的需求也是最小的。在本實施方案中，可以省略對處理單元的製冷 或加熱。在另一個實施方案中，溫度控制和調節單元被集成在用於指導第一表面的工具中 和/或用於攪拌的工具中和/或調距橫板中。在本實施方案中，熱轉移是通過將工具和/ 或調距橫板與第一表面和/或第二表面相接觸來進行的。在優選情況下，裝置另外包含再加工單元，用於樣品溶液的純化和/或再濃縮，和 /或控制反應室中流體的裝載和卸載。在本發明的範圍內，流體被理解為是指液體和氣體。 此外，分析溶液可以在再加工單元中重新緩衝。最後，再加工單元也可以用於提供必需的分
20析化學物質。流體容器與反應室的連接可以按照例如國際專利申請WO 01/02094中的描述 來開發。在本實施方案中，在特別優選情況下，反應室和再加工單元通過兩個套管相連，其 中套管的安排方式使得第一個套管確保流體從再加工單元注入到反應室中，而第二個套管 確保被注入的流體從反應室中趕出的空氣排出。注入到再加工單元中的樣品因此可以通過 套管達到處理單元的反應室中。為此，套管被安排的方式使得它們通過套管導管到達反應室。再加工單元可以被開發成與處理單元分開。在用樣品溶液以及任選其它反應液體 填充反應室後，再加工單元可以與處理單元分開，優選情況下使其脫離，也可以丟棄它。下面將描述用於填充反應室的集成或非集成單元的實施方案，這些單元在下面也 被稱為填充單元或再加工單元。通常，通過適當的工具例如吸管將反應溶液帶入填充單元的特定開口。液體運輸 到裝置中是通過用吸管施加壓力、或通過另外的壓力產生工具例如注射器或自動單元例如 自動處理機的功能元件來進行的。在優選情況下，填充單元被開發成以工效學適合的方式手動操作。此外，在優選情 況下，它在外部具有其它容易接近的開口以補加反應物質。在優選情況下，填充單元還含有適合的流體界面以穿透室體的密封墊。為此使用 了特定的套管，它由例如高級別鋼或聚合物構成，通常具有0. 05mm到2mm的直徑。在優選 情況下，安排了至少一個或以上的套管，特別優選情況下安排兩個，其中一個可以用於填充 反應液體，另一個用於反應空間的通氣並用於取出剩餘的流體。這樣的套管可以以固定或 可互換的方式與填充單元相連，其中在優選情況下進行一個不能被操作者分離開的連接， 用於操作一次性的填充物。填充單元也可以含有覆蓋套管的單元，以便在系統分離後可以避免任何可能的操 作者造成的損傷或環境的汙染。在優選情況下，填充單元還包含了適合的機械界面以與反應倉滑動配合接觸。該 界面可以被開發成例如特定的咬合的形式。以這種方式，可以確保在優選的位點穿過室體 的密封墊。當在相應的自動處理器中處理反應倉時，需要進行適合的機械測量，這允許在裝 置中進行調整和精確定位。具體來說這應用於液體的替換和/或進料的定位，以及為反應 倉的定位，以用於在反應室中進行反應後檢測信號。裝置或填充單元還可以包含集成的廢物容器，用來容納剩餘物或趕出的氣體或液 體介質，例如保護性氣體填充物或緩衝液。廢物容器可以用例如另外的氣體、液體或固體 介質填充，它們可逆或不可逆地結合液體或氣體物質，例如纖維素、過濾材料、矽膠。此外， 廢物容器可以具有通氣口，或可以表現出負壓以改善整個單元的填充行為。此外，廢物容器也可以被開發成分離的模塊。在這種情況下，填充單元被裝備有相 應的流體界面，它們對應於商業標準，例如LuerLock，並且通向外部。這樣的界面可以與連 續系統具有形式或力的聯繫。在第一個具體的實施方案中，填充是通過具有集成的廢物容器的可分離的填充單 元來進行的。具體來說，填充單元用於反應室的非重複填充。填充單元被開發成例如將它插到或暫時連接到倉上，將樣品注入到反應空間中，在填充完成之後，再將填充單元與倉分 離並丟棄。在該第一個具體的實施方案中，填充單元還包含有集成的廢物容器，可以如前所 述被開發成。該實施方案的一個例子被顯示在圖22中。通過模塊式填充單元填充反應倉 的步驟顯示在圖23中。在第二個具體的實施方案中，填充通過集成的填充單元進行。此時，填充單元是反 應倉的一個集成元件，因而不能與後者分開；填充單元和倉的丟棄是同時進行的。此時，在 優選情況下填充單元被用於反應室的非重複填充，並可能用於其它的內部流體處理步驟。 在該實施方案中，優選情況下填充單元還包含技術裝置，用於執行套管在系統中的優選位 置，特別用於防止在將套管插入室體的密封墊的過程中由於疏忽造成的刺穿。然而，也可以 設想套管在該優選位置刺穿室體的密封墊。該技術裝置可以通過例如設置彈簧、彈性元件、 或用於進行捕獲的凹口和隆起處來實現。在本實施方案中，填充元件還包含填充和廢物通 道，其中含有相應的流體界面，所述界面也可以對應於商業標準，例如LuerLock，並通向外 部。這樣的界面可以與連續系統具有主動的或非主動的連鎖，用於注入和/或除去氣體和/ 或液體介質。該實施方案的一個例子顯示在圖M中。具有集成的填充單元的反應倉的填 充步驟顯示在圖25中。在第三個具體的實施方案中，填充通過具有集成的廢物容器的集成的填充單元來 進行。在該實施方案中，填充單元是反應倉的一個集成元件，因此不能與後者分開；填充單 元和倉同時被丟棄。此時，填充單元優選用於反應室的非重複填充，並可能用於其它的內部 流體處理步驟。在本實施方案中，填充單元還優選包含技術裝置，用於執行套管在系統中的 優選位置，優選用於防止在將套管插入室體的密封墊的過程中由於疏忽造成的刺穿。然而， 也可以設想套管在該優選位置刺穿室體的密封墊。該技術裝置可以通過例如設置彈簧、彈 性元件、或用於進行捕獲的凹口和隆起處來實現。在本實施方案中，填充元件還包含集成的 廢物容器，可以按照上面的描述開發。該實施方案的一個例子顯示在圖沈中。具有集成的 填充單元和集成的廢物容器的反應倉的填充步驟可以通過例如在圖23和25中描述的步驟 的組合來進行。下面將描述安排套管以便在壓縮步驟中維持壓力平衡的具體的實施方案。用於反 應倉的填充工具的套管可以被安排成例如這樣的方式，使得在非壓縮狀態下填充和反應空 間壓縮過程中轉移多餘的反應溶液都是可能的。在優選情況下，這可以通過適當改變密封 墊和套管排列的結構來實現，其中套管優選刺穿反應室中的補償區域。如果多餘的體積不 能通過特定的密封墊設計被吸收，這種排列結構是特別適合的。圖27中舉例顯示了一種帶 有未改變形式的密封墊的可能的垂直套管排列結構。本發明的裝置還可以含有與檢測系統相連、用於控制試驗步驟和/或用於處理由 檢測系統記錄的信號的單元。控制和/或處理單元可以是微控制器或工業計算機。這種檢 測單元和處理單元的偶聯，確保了反應結果轉化為分析結果，允許將本發明的裝置作為手 持裝置使用在例如醫學診斷中。此外，在優選情況下，本發明的裝置還具有用於外部計算機的界面。這尤其允許 將數據轉移到外部存儲器中。在另一個優選實施方案中，裝置裝備有編碼，優選為數據矩陣和/或條形碼，包含 了關於物質文庫和/或擴增和/或檢測反應的執行情況的信息。通過這樣的個人識別數字，讀取或檢測裝置可以自動識別哪個試驗已經被進行。為此，在生產本發明的裝置時，含有關 於物質文庫、檢測反應的執行等信息的數據記錄被儲存在資料庫中。因此，具體來說，數據 記錄可以含有關於探針在陣列上布局的信息，以及關於如何以最有利的方式進行評估的信 息。數據記錄或數據矩陣還可以含有關於PCR的溫度-時間模式的信息，該PCR任選用於 擴增靶分子。如此獲得的數據記錄在優選情況下是數字，以數據矩陣的形式連接到支架上。 通過記錄在數據矩陣中的數字，在讀出物質文庫時可以任選地訪問成套的數據記錄。最後， 數據矩陣可以被溫度控制或調節單元和其它控制器，例如用於反應室通過流體容器的填充 和卸載的控制器所讀取，因此可以確保擴增和檢測反應自動地進行。編碼，例如數據矩陣，不必須含有全部的信息。它也可以簡單地含有一個識別或進 入號碼，然後可以通過該號碼從計算機或數據載體中下載必需的信息。本發明的裝置可以非常容易地製造。圖3中顯示了處理單元可以由僅僅4個獨立 的元件構成，它們彼此之間簡單地適合。

圖10和11顯示的實施方案由於本發明的結構也 可以容易地製造，儘管它們由幾個元件組成。對每個元件的大小的幾何耐受性可以是非常 大的，例如1/10到2/10mm，以便例如密封墊和室體的大規模注模可以以非常合算的方式進 行。低耐受性通過將晶片壓向檢測平面而便利化，因此距離檢測顯微鏡的光徑基本上不受 處理單元的元件的影響。僅有的幾個具有低耐受性的幾何數量是晶片的x、y位置和檢測平 面的厚度。但是晶片的ζ位置的變化只發揮次要作用。儘管它們的技術需求低，光學系統 例如螢光檢測顯微鏡的聚焦裝置並不需要。這些性質清楚地表明了本發明的裝置對於移 動在位使用的適合性。在本發明的另一個方面，提供了定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相 互作用的方法，包括下面的步驟a按照前面的描述將含有靶分子的樣品、優選為樣品溶液注入本發明裝置的反應 室中；以及b檢測靶分子和固定在底材上的探針分子之間的相互作用。本發明的方法允許在反應室中定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相 互作用，而不需要在相互作用完成之後和檢測之前替換樣品或反應液體以除去幹擾的背
旦
ο在本發明的範圍內，探針和靶分子之間的相互作用的檢測通常如下進行在將探 針或探針群以預定的方式以微陣列的形式固定到特定的基體上之後或提供微陣列之後，將 靶與探針在溶液中接觸，並在預定的條件下保溫。通過保溫，在探針和靶之間發生了特異性 相互作用或雜交。此時形成的鍵比靶分子與不特異性針對該靶分子的探針形成的鍵明顯穩
定得多。靶及其探針之間的特異性相互作用的檢測可以通過多種方法進行，這一般依賴於 在靶分子與微陣列相互作用之前、之中或之後插入到靶分子中的標記物的類型。一般情 況下，這樣的標記物是螢光基團，以便可以通過螢光光學方法讀出特異性的靶/探針相互 作用，這種方法與其它常規的檢測方法特別是質量敏感的方法相比具有較高的局部分辨 率，並且工作量小(參見例如A.Marshall，J. Hodgson, DNA晶片可能性的陣列，Nature Biotechnology 1998，16，27-31 ；G. Ramsay, DNA 晶片技術狀態，Nature Biotechnology 1998，16,40-44)。
根據固定在微陣列上的物質文庫和靶分子的化學本質，核酸與核酸之間、蛋白 與蛋白之間以及核酸與蛋白之間的相互作用可以通過這種試驗原理來檢測(調查報告 參 見 F. Lottspeich, H. Zorbas,1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany) 0此處，抗體文庫、受體文庫、肽文庫和核酸文庫都被當作物質文庫，可以被固定在 微陣列或晶片上。到目前為止核酸文庫扮演了最重要的角色。它們是微陣列，其上固定了脫氧核糖 核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。在本發明的方法的優選實施方案中，微陣列與第二表面之間的距離保持在這樣一 個位置，它允許在步驟b)的檢測之前進行樣品溶液的處理和/或靶分子與固定在底材上的 探針分子之間的相互作用，例如被檢測的核酸的擴增和/或被檢測的核酸與固定在底材上 的核酸探針之間的雜交。優選情況下步驟b)中微陣列和第二表面之間的距離可以改變，優選減小。即在優 選情況下檢測在微陣列與檢測平面之間距離減小的情況下進行。特別優選情況下，微陣列 與檢測平面之間的距離在檢測過程中大約為零。在一個實施方案中，微陣列被導向第二表面以減小微陣列和第二表面之間的距 離。優選情況下，這是通過利用至少一種指導第一表面的工具施加壓力以推動第一表面來 確保的，所述工具例如挺杆、杆、針和螺釘，其中工具產生的壓力作用點具體來說位於微陣 列下方。將微陣列壓向第二表面或檢測平面可能是容易的，因為第一表面至少在微陣列下 方的區域中是可以彈性變形的。此外，第一表面也可以被開發成具有兩個重疊的層，其中兩 個重疊的層的外層至少在位於微陣列之下的區域具有凹口，而兩個重疊的層的內層由彈性 密封墊形成。然後通過指導第一表面的工具在內層靠近凹口的位置施加壓力。但是，指導第一表面的工具例如針、杆、挺杆和/或螺釘不能僅僅用於對第一表面 施加壓力。在泡將在DNA晶片上形成這種可能干擾檢測的情況下，可以通過指導第一表面 的工具進行攪拌以除去這些泡，例如對第一表面施加大約20Hz的震動頻率，特別是以彈性 膜的形式。此外，常見的一個問題是晶片表面上的相互作用例如雜交花費非常長的時間。除 了其它原因之外，這是由於相互作用或雜交的速度是由擴散作用決定的事實。在優選情況 下，可以通過指導第一表面的工具進行攪拌以增加相互作用或雜交的速度，例如對第一表 面施加大約20Hz的震動頻率，特別是以彈性膜的形式，因為攪拌或震動導致反應室中的混
合 O在另一個實施方案中，第二表面被導向第一表面以減小微陣列與第二表面之間的 距離。具體來說，通過利用調距橫板在第二表面上施加壓力將第二表面導向第一表面，這可 以被確保。在另一個實施方案中，第一表面被導向第二表面，第二表面被導向第一表面，以減 小微陣列與第二表面之間的距離。下面將描述相對第二表面指導第一表面或相對第一表面指導第二表面的其它實 施方案。該實施方案不僅適合於相對第二表面或檢測表面定位第一表面或探針陣列，而且還可以具體來說用於相對於檢測表面移動探針陣列。通過這樣的運動，可以實現例如反應 室中溶液的攪拌。在一個實施方案中，通過磁場將探針陣列相對於檢測表面移動或在室中移動。探 針陣列和/或第二表面可以，例如含有磁性材料或含有其上添加了磁性材料的元件，和/或 固定在完全或部分由磁性材料構成的支架上。在優選情況下還可以通過移動磁體被動地 移動探針陣列和/或第二表面，該磁體安置在相應的表面之下並且例如通過磁場與該表面 相聯。在另一個實施方案中，探針陣列通過重力衝擊相對於檢測平面移動和/或定位。在另一個實施方案中，探針陣列通過反應室中產生的液流相對於檢測平面移動和 /或定位。為此，裝置可以被開發成例如這樣的方式，在探針陣列被液流包圍的情況下，在反 應室的一側產生負壓，而在另一側產生正壓，這樣就導致探針陣列在反應室中運動。這樣的 液流可以例如通過由反應室中局部的溫差引起的熱對流來產生。在另一個實施方案中，探針陣列通過電場衝擊相對於檢測平面移動和/或定位。在另一個實施方案中，通過局部過熱在探針陣列下產生氣泡，由此將晶片在反應 室中移動或導向檢測平面。通過在檢測前減小微陣列與第二表面之間的距離，在優選情況下樣品溶液幾乎完 全從微陣列與檢測平面之間的區域中除去。因此，由不與陣列表面結合的標記的分子，例如 標記的引物和/或標記的靶核酸引起的背景信號被減小了。因此，在步驟b)的檢測中，微陣列與第二表面之間的距離優選通過這樣的方式改 變，使得微陣列與第二表面之間的樣品溶液基本上被除去。然後微陣列基本上位於檢測平 面中，幹擾的背景幾乎被避免了。在另一個替代實施方案中，微陣列平坦地放置在在裝置的原始狀態下已經形成檢 測平面的第二表面上，並且不僅通過將第一表面導向第二表面和/或將第二表面導向第 一表面而被帶入檢測平面。在該實施方案中，在處理步驟中微陣列不被樣品溶液潤溼。為 了進行相互作用反應例如雜交，優選由彈性材料製成的第一表面例如彈性膜被導離檢測表 面。因此晶片表面移離檢測表面並被樣品溶液潤溼。相互作用例如雜交可以發生。為了進 行檢測和進一步處理，例如以彈性膜形式的第一表面被再次釋放，由此跳回至其最初被調 整的位置，這可以通過指導第一表面的工具例如針、杆、螺釘和/或挺杆施加壓力來加速。 因此，微陣列可以被再次壓向檢測平面，檢測可以在沒有背景的情況下進行。在本發明的另一個實施方案中，使用了上述的本發明的裝置，其第一表面被開發 成可以圍繞旋轉軸旋轉的方式。在第一個位置，也被稱為起始位置中，安置在第一個側面部分上的微陣列的表面 基本上均勻地放置在第二表面上，即其上固定有探針分子的底材表面基本上不被樣品溶液 潤溼。優選情況下，在第一個位置，在第一表面的第二個側面部分與第二表面之間形成的空 間，處理室中進行反應溶液的處理，即具體來說是純化、重新濃縮、清洗和漂洗和/或擴增步驟。然後，將可旋轉的第一表面帶到第二個位置，其中第一表面被排列成相對於第二 表面呈180°以外的角度，優選為45°的角度。優選情況下，這通過使用前述的指導第一表 面的工具在第一表面的第一個側面部分上施加牽引力和/或在第一表面的第二個側面部分施加壓力來進行。通過將第一表面導向第二個位置，微陣列被導離第二表面，樣品溶液滲 入微陣列和第二表面之間形成的空洞。固定在微陣列的底材上的探針分子可以讓樣品溶液 中存在的靶分子自由接近，從而使探針和靶分子之間的相互作用可以發生。在本發明的方 法的本實施方案中，在第一表面上施加壓力和/或牽引力的優點在於，通過這種方式可以 移動樣品溶液，從而可以加速相互作用反應。為了進行檢測以及任選其它處理，可旋轉的第一表面被導離第一個位置，這可以 通過例如在第一表面的第一個側面部分施加壓力和/或在第一表面的第二個側面部分施 加牽引力，或在第一表面是彈性設計的情況下，通過釋放第一個側面部分來進行。此時，微 陣列又基本上平坦地放置在第二表面上，以便第二表面和微陣列之間的樣品溶液在該位置 上被基本上替換，可以產生基本上無背景的檢測。被檢測的靶可以存在於任何種類的樣品中，優選在生物樣品中。優選情況下，靶在通過本發明方法檢測和定量之前被分離、純化、複製和/或擴
+曰O本發明的方法還允許在反應室中擴增和定性和/或定量檢測核酸，其中分子相互 作用或雜交的檢測可以在完成不需要替換樣品或反應液體的循環擴增反應之後進行。本發 明的方法也確保了擴增中雜交事件的循環檢測，也就是說即使是在循環擴增反應期間也可 以檢測雜交。最後，在本發明的方法的幫助下，擴增產物可以在擴增反應過程中和擴增反應 完成後被定量。通常擴增是通過常規的PCR方法或通過平行地實行通過PCR對待分析的靶分子進 行擴增並通過上述的靶分子與物質文庫支持物的雜交的方法來進行的。在另一個實施方案中，擴增在兩步方法中(也參見WO 97/45559)以多重PCR的形 式進行。在第一步中，通過使用融合引物進行多重PCR，該引物的3』-末端是基因特異性的， 5』_末端代表通用的區域。後者在用於多重反應的所有正向和反向引物中都是相同的。在 第一個階段中，引物的量是有限的。此時，所有的多重產物可以被擴增直到達到一致的摩爾 量，只要對所有產物來說循環的次數足夠達到引物的限制就行。在第二個階段中，使用了 與融合引物的5』 -區域一致的通用引物。擴增被進行直到獲得所需的DNA量。在本發明的方法的另一個優選實施方案中，檢測在循環擴增反應期間和/或循環 擴增反應完成之後進行。在優選情況下，檢測在擴增反應過程的每個擴增循環中進行。另 外，檢測也可以在每兩個循環中或每三個循環中或任意間隔中進行。在進行線性擴增反應，其中靶的量隨著每一步以某個量增加，或在進行指數擴增 反應，例如PCR，其中DNA靶的量隨著每一步相乘增加時，在處理單元中，晶片可以在每個擴 增步驟之後被壓向檢測平面，從而進行檢測。因此，有可能對擴增反應進行在線監測。具體 來說在非線性擴增反應中，因此可能確定DNA靶量的起始濃度。通過這種方式，擴增步驟的數量也可以被在線最適化。只要DNA靶的量達到特定 的濃度，擴增就可以中止。如果起始靶濃度低，循環步驟的次數就被增加以便能夠確保進行 產物的分析。在需要減少反應時間的陽性對照的情況下，分析處理可以在非常早就中止。執行擴增反應所需的化學物質，例如聚合酶、緩衝液、氯化鎂、標記的引物、具體來 說是螢光標記的引物、dNIPs等，可以被提供到反應室中，例如以冷凍乾燥的形式。優選情況下，循環擴增反應是PCR。在PCR中，通常每個PCR循環使用三個溫度。
26優選情況下，雜交的核酸在最高的溫度即變性溫度下從微陣列上解離。變性溫度的優選值 是95°C。因此可以在該變性溫度下測定雜交信號，作為在相應的PCR循環中被檢測的核酸 的零值或參照值。PCR循環中下一個溫度是退火溫度，為例如大約60°C，在此溫度下，有利於被檢 測的核酸和固定在微陣列的底材上的核酸之間的雜交。因此，在本發明的方法的一個實施 方案中，存在於PCR循環中的靶核酸的檢測在退火溫度下進行。為了增加本發明的方法的靈敏度，將溫度降低到退火溫度以下，以便檢測優選在 低於擴增循環的退火溫度的溫度下進行，可能是有利的。例如，檢測可以在25°C到50°C的 溫度範圍內進行，優選在300C到450C的溫度範圍內。在本發明的方法的另一個替代實施方案中，被檢測的核酸和固定在微陣列底材上 的核酸之間的雜交首先在低溫下進行，以便隨後升高雜交溫度。這樣的實施方案的優點在 於，與在高於50°C的溫度下進行雜交相比雜交時間縮短了，而不損失相互作用中的特異性。如果從等於或低於退火溫度下測定到的測量值中減去在變性溫度下測定到的零 值或對照值，可以獲得無幹擾的測量結果，其中的波動和漂移被消除了。通常被檢測的靶分子帶有可檢測的標記。在本發明的方法中，檢測優選通過用至 少一種在步驟b)中檢測的標記物標記被結合的靶來進行。正如上面已經提到的那樣，與靶或探針偶聯的標記物優選是可檢測的單元或通過 錨定基團與靶或探針偶聯的可檢測單元。對於檢測或標記的可能性，本發明的方法是相當 靈活的。因此，本發明的方法可以與多種物理、化學或生物化學的檢測方法相容。唯一的先 決條件是被檢測的單元或結構可以直接偶聯或經由能夠與寡核苷酸偶聯的錨定基團連接 到探針或靶上，例如寡核苷酸上。標記物的檢測可以基於螢光、磁性、電荷、質量、親和性、酶活性、反應性、金標 記等。因此，標記物可以是例如基於使用螢光團標記的結構或成分。在螢光檢測的情況 下，標記物可以是能夠在分析過程中或之後與靶或探針偶聯的任意染料。例如Cy染料 (Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)、Alexa 染料、德克薩斯紅、焚光素、若 丹明(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)、類鑭族元素釤、鐿和銪(EG&G，Wallac， Freiburg，Germany)。在特別優選情況下，該可檢測的標記物是螢光標記物。正如上面已經提到的那樣， 在本發明的方法中使用本發明的裝置確保了利用不帶自動聚焦的螢光顯微鏡、例如具有固 定焦距的螢光顯微鏡，檢測螢光標記物。除了螢光標記物之外，在本發明的範圍內發光標記物、金屬標記物、酶標記物、放 射性標記物和/或聚合物標記物也可以用作標記和/或檢測單元，與靶或探針偶聯。同樣地，可以通過與標記的報告分子雜交(三明治雜交)來檢測的核酸可以用作 標記物(標籤)。各種分子生物學檢測反應例如引物延伸、連接和RCA被用來檢測標籤。在本發明的方法的替代實施方案中，可檢測的單元通過錨定基團與靶或探針偶 聯。優選使用的錨定基團是生物素、地高辛配基等。在後續的反應中，錨定基團通過特異性 結合成分例如鏈親和素偶聯物或抗體偶聯物被轉換，而這些偶聯物是可以檢測的或能夠觸 發可檢測的反應。通過使用錨定基團，錨定基團被轉化為可檢測的單元可以在加入含有靶 的樣品之前、期間或之後進行，或者也可以在切割探針中可以被選擇性切割的鍵之前、期間或之後進行。這些探針中可以被選擇性切割的鍵是例如在國際專利申請WO 03/018838中 描述的那些，其相關的內容在此被明確地引用。根據本發明，標記也可以通過標記的分子與探針分子的相互作用來進行。例如，標 記可以通過用如上述標記的寡核苷酸與寡核苷酸探針或寡核苷酸靶進行雜交來進行。其它適合於本發明的範圍的標記方法和檢測系統在例如Lottspeich和hrbas， Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany 1998, 23. 3 和23. 4章節中有描述。在本發明的方法的優選實施方案中，使用了檢測方法，其結果產生了含有特定溶 解性產物的加成物，從而導致沉澱。為了進行標記，使用的具體底物或離析物可以被轉化為 幾乎不溶的通常被染色的產物。在這種標記反應中，可以使用催化底物轉化為幾乎不溶的 產物的酶。適合於在陣列元件上產生沉澱的反應以及檢測沉澱的可能反應在例如國際專利 申請WO 00/72018和國際專利申請WO 02/(^810中有描述，其相關的內容在此明確地引用。在本發明的方法的特別優選的實施方案中，被結合的靶配備上標記物，催化可溶 的底物或離析物反應形成陣列元件上幾乎不溶的沉澱，其中探針/靶相互作用已經發生， 或作為晶核將可溶的底物或離析物轉化為陣列元件上幾乎不溶的沉澱，其中探針/靶相互 作用已經發生。通過這種方式，使用本發明的方法允許同時定性和定量分析各種探針/靶相互作 用，其中可以使用單個大小小於等於ΙΟΟΟμπκ優選小於等於ΙΟΟμπκ特別優選小於等於 50 μ m的陣列元件。酶法標記物已經知道被使用在基於微量滴定板的免疫細胞化學和免疫學測試中 (參見 E. Lidell 和 I. Weeks，抗體技術，BIOS Scientific Publishers Limited，1995)。因 此，例如，酶催化底物轉化為幾乎不溶的通常被染色的產物。特別優選情況下，導致沉澱在陣列元件上形成的反應是酶催化的可溶的底物或離 析物轉化為幾乎不溶的產物。在具體的實施方案中，導致沉澱在陣列元件上形成的反應是 由過氧化物酶催化的3，3' ,5,5'-四甲聯苯胺的氧化。優選情況下，辣根過氧化物酶被用於催化3，3' ,5,5'-四甲聯苯胺的氧化。但 是，本領域的專業人員將會知道其它的過氧化物酶也可用於3，3' ,5,5'-四甲聯苯胺的氧化。據信3，3' ,5,5'-四甲聯苯胺在過氧化物酶的催化作用下在第一步反應中 被氧化形成藍色的自由基正離子(參見例如Gallati和Pracht, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985，23，8，454)。這種藍色的自由基正離子通過聚陰離子，例如硫酸葡聚糖以復 合物的形式沉澱。通過過氧化物酶催化3，3' ,5,5'-四甲聯苯胺氧化的沉澱反應在例如 EP 0 456 782中有描述。不求全部，下面的表1提供了可能適合於在靶和探針發生相互作用的陣列上引起 沉澱的幾種反應的調查報告。表權利要求
1.用於定性和/或定量檢測探針分子和樣品溶液中靶分子之間的相互作用的系統，包 含用於接收反應室的部件，其中，反應室由第一表面和第二表面之間形成，探針分子被固 定在微陣列上的陣列元件上，該微陣列被放置在第一表面上；以及該微陣列與第二表面之 間的距離是可變的；檢測部件，它被構建成當微陣列與第二表面之間的距離減少時能夠進 行檢測；一種工具，通過該工具可以相對於第二表面指導該微陣列。
2.根據權利要求1中的系統，其中，通過該工具可以相對於第二表面指導該微陣列，這 樣讓位於微陣列與第二表面之間的樣品溶液被實質移出。
3.根據權利要求1或2中的系統，其中，通過該工具可以相對於第二表面指導該微陣 列，這樣讓該微陣列與第二表面之間的距離在0到Imm的範圍內變化。
4.上述權利要求任何一個中的系統，其中的檢測部件是光學系統，優選為螢光光學系統。
5.上述權利要求任何一個中的系統，其中檢測部件與一個間隔(spacer)連接，當檢測 部件放置在第二表面的時候，該間隔可以調節檢測部件與第二表面之間的距離。
6.上述權利要求任何一個中的系統，其中檢測部件為不是自動聚焦的螢光顯微鏡或有 固定焦距的螢光微鏡。
7.上述權利要求任何一個中的系統，其中用於接收反應室的部件構建成可以用於調節 或配置反應室的位置和精度。
8.上述權利要求任何一個中的系統，其中用於接收反應室的部件構建成用於配置反應 室的位置來從反應室替換溶液或/和給反應室補給溶液。
9.上述權利要求任何一個中的系統，其中用於接收反應室的部件構建成用於配置反應 室的位置來檢測反應室裡的信號。
10.上述權利要求任何一個中的系統，該體統還包括包溫度控制單元和/或溫度調節 單元，用於控制和/或調節反應室中的溫度。
11.上述權利要求任何一個中的系統，其中可以相對於第二表面指導該微陣列的工具 是通過壓縮和/或拉伸作用於第一表面。
12.上述權利要求任何一個中的系統，其中第一表面可以通過該工具設定成振動。
13.權利要求6-12的系統，其中可以相對於第二表面指導該微陣列的工具是通過壓縮 和/或拉伸作用於第一表面，第二表面可以相對與第一表面被移動讓該微陣列與第二表面 之間的距離是可變的。
14.上述權利要求任何一個中的系統，該系統還包括一個填充反應室的補給元件和/ 或用於純化或濃縮樣品溶液的回收元件，和/或控制反應室中流體卸下或卸進的元件。
15.權利要求14的系統，填充元件具有一個連接反應室的流體截面(afluidic interface)0
16.上述權利要求任何一個中的系統，其中系統還包括讀取編碼的系統，其中編碼為矩 陣和/或條形編碼。
17.上述權利要求任何一個中的系統，該系統包括該反應室。
18.上述權利要求任何一個中的系統，其中為第一和第二表面之間形成的反應室提供 側面限制補償區，該補償區在該微陣列與第二表面之間的空間減小時，使反應室中的體積 保持基本恆定。
19.權利要求17或18的系統，其中的第一表面由透明材料製成，優選的為透明塑料製成。
20.權利要求17-19的系統，其中，第一表面至少在該微陣列下方的區域中被構建成可 以相對於第二表面指導該微陣列，以便可以改變該微陣列與第二表面之間的距離，其中第 一表面至少在該微陣列下方的區域為彈性變形的，例如由彈性塑料製成。
21.上述權利要求任何一個中的系統，其中探針分子和/或靶分子是從下面的組中選 擇的生物聚合物核酸、肽、蛋白、抗原、抗體、碳水化合物和/或其類似物，和/或上述生物 聚合物的共聚物。
22.定性和/或定量檢測探針和靶分子之間的分子相互作用的方法，包括下面的步驟 a)將含有靶分子的探針溶液導入到放置了的微陣列的第一表面與第二表面之間形成的反 應室中；探針分子被固定在該微陣列的陣列元件上，該微陣列被放置在裝置的第一表面上； 其中微陣列與第二表面之間的距離可變；b)將反應室導入到一個如權利要求1-21中的系統；c)檢測靶分子和固定在該底材上的探針分子之間的相互作用
23.權利要求22的方法，微陣列與第二表面之間的距離被保持在一個位置，這樣來促 使被固定在該微陣列的陣列元件上的探針分子與靶分子中的探針的作用。
24.權利要求22或23的方法中，在步驟C中，讓微陣列與第二表面之間的距離可變，優 選為減少。
25.權利要求M的方法中，在步驟C中，讓微陣列與第二表面之間的距離可變來讓位於 微陣列與第二表面之間的樣品溶液被實質移出。
26.權利要求22-25的方法中，靶分子被提供一種可檢測的標記物質，優選的為螢光標 記物質。
27.權利要求沈的方法中，螢光標記物質被不帶有自動聚焦的螢光顯微鏡影響或者帶 有固定焦距的螢光顯微鏡影響。
28.權利要求22-27的方法中，其中靶分子和或探針分子為核算或核算的類似物質，該 靶分子在反應室中通過循環擴增反應來擴增，其中在一個或幾個循環之後和/或循環擴增 反應完成之後進行的檢測。
29.權利要求1到23任何一個中的裝置的應用，用於進行基於微陣列的測試。
全文摘要
本發明用於定性和/或定量檢測探針分子和樣品溶液中靶分子之間的相互作用的系統，包含用於接收反應室的部件，其中，反應室由第一表面和第二表面之間形成，探針分子被固定在微陣列上的陣列元件上，該微陣列被放置在第一表面上；以及該微陣列與第二表面之間的距離是可變的；檢測部件，它被構建成當微陣列與第二表面之間的距離減少時能夠進行檢測；一種工具，通過該工具可以相對於第二表面指導該微陣列。
文檔編號B01L7/00GK102121054SQ20101058555
公開日2011年7月13日 申請日期2005年5月6日 優先權日2004年5月6日
發明者亞力山大·德沃拉克, 尤金·埃曼特勞特, 託爾斯泰·舒爾茨, 託馬斯·烏爾裡希, 託馬斯·凱澤, 託馬斯·艾林格爾 申請人:科隆迪亞戈晶片技術有限公司