以野生型幽門螺旋桿菌23SrRNA基因為模板的陽性質控品的製作方法
2023-07-16 22:54:26 2
本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種以野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因為模板的陽性質控品，該陽性質控品用於驗證幽門螺旋桿菌耐藥基因檢測試劑盒在應用於樣本檢測時樣本是否為陽性的輔助判斷。
背景技術：
質控品是指用於體外診斷的質量控制物質，其具有已知濃度含量的目標檢測物，為使人們確信某一產品或服務質量能滿足規定的質量要求所必須的產品。質控品的使用目的是為了驗證整個PCR反應過程具有準確性、有效性和特異性，並監控檢測系統的狀態。儀器在正式投入使用後，應定期對其校準，避免由於儀器原因導致的實驗偏差。再次，在收到每批新試劑後，應首先對其進行預實驗，確證新試劑質量後，再用於對臨床標本的檢測。
但是據申請人了解，目前在檢測野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因質量控制方面沒有陽性質控品。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種以野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因為模板的陽性質控品，用於驗證被檢樣本中是否含有野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因這一檢測結果是否準確，解決了幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的質量檢測問題。
為達到上述目的，本發明採用的技術方案是：一種以野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因為模板的陽性質控品，該陽性質控品是一種以鹼基序列為主要成分的試劑，該鹼基序列包含野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因片段，所述野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因片段為5』-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3』 ，其中，帶有下劃線的鹼基位點從左到右分別是野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的2142和2143位點，所述2142或/和2143位點用於表徵野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因可突變為變異型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的位點。
上述技術方案中的有關內容解釋如下：
1、上述方案中，所述陽性質控品中還含有緩衝試劑，該緩衝試劑選自pH 為7.6的Tris-HCl緩衝液、純化水以及pH 為8.0的TE緩衝液中的任意一種。
2、上述方案中，所述陽性質控品中含有的野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因序列是構建到質粒載體上保存，根據現有技術即可得到，質粒構建過程如下：
引物設計——pcr擴增——割膠回收DNA片段——構建載體——轉化培養——陽性克隆鑑定——37℃搖床培養——質粒抽提——測序確認鹼基序列。
抽提後的質粒再配製成所述陽性質控品，配製方法如下：
（1）配製稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入Tris-HCl緩衝液（pH7.6）→加入剩餘的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀釋液；
（2）HP野生型質粒預稀釋：加入50%配方量的所述稀釋液→加入HP野生型質粒溶液→加入剩餘的所述稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到X拷貝/微升HP野生型質粒溶液（X代表質粒濃度具體數值）；
（3）得到陽性質控品：加入50%配方量的稀釋液→加入X拷貝/微升HP野生型質粒溶液→加入剩餘的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到陽性質控品。
本發明的特點以及有益效果是：所述陽性質控品實質是事先設計好的、當做已知濃度及鹼基序列的樣本，和其他被檢樣本（例如胃黏膜組織、胃液或牙菌斑）一起利用相關的幽門螺旋桿菌23S rRNA基因檢測試劑盒進行檢測，從而驗證被檢樣本檢測結果的準確性。也就是說，在利用幽門螺旋桿菌23S rRNA基因檢測試劑盒檢測被檢樣本時，本發明的陽性質控品相當於是一種已知濃度的陽性樣本，用於驗證幽門螺旋桿菌23S rRNA基因檢測試劑盒的檢測結果是否真實、有效，解決了幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的質量檢測問題。
附圖說明
附圖1為幽門螺旋桿菌菌群陽性及23S rRNA基因2142和2143位點無突變時的螢光定量PCR擴增熔解曲線圖；
附圖2為幽門螺旋桿菌菌群陽性及23S rRNA基因2142位點有突變時的螢光定量PCR擴增熔解曲線圖；
附圖3為幽門螺旋桿菌菌群陽性及23S rRNA基因2143位點有突變時的螢光定量PCR擴增熔解曲線圖；
附圖4為幽門螺旋桿菌菌群陰性時的螢光定量PCR擴增熔解曲線圖；
附圖5為內部質控品的螢光定量PCR擴增熔解曲線圖。
具體實施方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述：
實施例：一種以野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因為模板的陽性質控品
陽性質控品1是一種以鹼基序列為主要成分的試劑，該鹼基序列包含野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因片段，所述野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因片段為5』-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3』（如SEQ NO:4所示），其中，帶有下劃線的鹼基位點從左到右分別是野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的2142和2143位點，所述2142或/和2143位點用於表徵野生型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因可突變為變異型幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的位點。所述陽性質控品1中還含有緩衝試劑，該緩衝試劑為pH 為7.6的Tris-HCl緩衝液。
陽性質控品2是一種以鹼基序列為主要成分的試劑，該鹼基序列包含幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因2142位點有突變的基因片段，該基因片段為5』-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3』（如SEQ NO:5所示），其中，帶有下劃線的鹼基位點是幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的2142位點，用於表徵2142變異型的幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的位點。所述陽性質控品2中還含有緩衝試劑，該緩衝試劑為pH 為7.6的Tris-HCl緩衝液。
陽性質控品3是一種以鹼基序列為主要成分的試劑，該鹼基序列包含幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因2143位點有突變的基因片段，該基因片段為5』-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3』（如SEQ NO:6所示），其中，帶有下劃線的鹼基位點是幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的2143位點，用於表徵2143變異型的幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因的位點。所述陽性質控品3中還含有緩衝試劑，該緩衝試劑為pH 為7.6的Tris-HCl緩衝液。
所述陽性質控品1、陽性質控品2、陽性質控品3作為幽門螺旋桿菌23S rRNA基因檢測試劑盒中的一部分。
在本實施例中，幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變檢測試劑盒包括KOD DNA 聚合酶、引物HPC-F、引物HPC-R、特異性靶向螢光探針、所述陽性質控品1、陽性質控品2以及陽性質控品3；
所述引物HPC-F為針對幽門螺旋桿菌23S rRNA基因設計的正向引物，該正向引物的序列為5』-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3』（如SEQ NO:1所示）；
所述引物HPC-R為針對幽門螺旋桿菌23S rRNA基因設計的反向引物，該反向引物的序列為5』-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3』（如SEQ NO:2所示）；
所述特異性靶向螢光探針是以幽門螺旋桿菌23S rRNA野生型基因組為模板設計的探針，其鹼基序列為5』- CAAGACGGAAAGACCC -3』 （如SEQ NO:3所示），螢光染料為氟硼二吡咯；
所述試劑盒還包括內部質控引物IC-F、內部質控引物IC-R、內部質控探針以及內部質控模板；
所述內部質控引物IC-F是針對Lagarosiphon madagascariensis的matK基因設計的正向引物，該正向引物的序列為5』-CCCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTC-3』 （如SEQ NO:7所示）；
所述內部質控引物IC-R是針對Lagarosiphon madagascariensis的matK基因設計的反向引物，該反向引物的序列為5』-CCCCATCCAGGATTGTAGAATTTGAATCAAG-3』（如SEQ NO:8所示）；
所述內部質控探針是以Lagarosiphon madagascariensis的matK基因為模板而設計的探針，該探針的序列為5』-GATCTATTCATTCGATATTCC-3』（如SEQ NO:9所示）；
所述內部質控模板為Lagarosiphon madagascariensis的matK基因的一個片段，內部質控模板的序列為5』-GCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTCCATTTTTTCTTGAAGAAAAAAAAGAAATACCAAAATATCAAAATTTACGATCTATTCATTCGATATTCCCTTTTTTAGAGGACAAATTTTTACATTTAAATTATGTGTCTGATATAGTAATACCTTATCCTATTCATCTCGAAATCTTGATTCAAATTCTACAATCCTGGAT-3』（如SEQ NO:10所示）。
所述內部質控引物IC-F、內部質控引物IC-R、內部質控探針以及內部質控模板用於驗證所述試劑盒在檢測幽門螺旋桿菌耐藥基因突變時是否真實、有效，參見附圖5所示。
在實際生產中，所述幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變檢測試劑盒可以做成包含下列組分的試劑盒：
（1）聚合酶試劑 [ KOD Mix ]：由KOD DNA 聚合酶和dNTP組成，規格為140μＬ×1支、140μＬ×2支、140μＬ×3支或140μＬ×6支；
（2）引物・探針試劑 [ HPC Mix ]：即由引物HPC-F、引物HPC-R以及特異性靶向螢光探針組成的混合試劑，規格為140μＬ×1支、140μＬ×2支、140μＬ×3支或140μＬ×6支；
（3）陽性質控品1 [ HPC PC1 ]：規格為300μＬ×1支；
（4）陽性質控品2 [ HPC PC2 ]：規格為300μＬ×1支；
（5）陽性質控品3[ HPC PC2 ]：規格為300μＬ×1支；
（6）陰性質控品[ HPC NC ]：即為不含有DNA的緩衝液，規格為300μＬ×1支；
陽性質控品1、陽性質控品2、陽性質控品3中含有的基因序列均是構建到載體質粒上保存。質粒構建過程如下：
引物設計——pcr擴增——割膠回收DNA片段——構建載體——轉化培養——陽性克隆鑑定——37℃搖床培養——質粒抽提——測序確認鹼基序列。
抽提後的質粒再配製成所述陽性質控品1，配製方法如下：
（1）配製稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入Tris-HCl緩衝液（pH7.6）→加入剩餘的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀釋液；
（2）HP野生型質粒預稀釋：加入50%配方量的所述稀釋液→加入HP野生型質粒溶液→加入剩餘的所述稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到X拷貝/微升HP野生型質粒溶液（X代表什麼）；
（3）得到陽性質控品1：加入50%配方量的稀釋液→加入X拷貝/微升HP野生型質粒溶液→加入剩餘的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到陽性質控品1。
抽提後的質粒再配製成所述陽性質控品2，配製方法如下：
（1）配製稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入Tris-HCl緩衝液（pH7.6）→加入剩餘的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀釋液；
（2）HP質粒（2142位點突變）預稀釋：加入50%配方量的稀釋液→加入HP質粒（2142位點突變）溶液→加入剩餘的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到X拷貝/微升HP質粒（2142位點突變）溶液；
（3）得到陽性質控品2：加入50%配方量的稀釋液→加入X拷貝/微升HP質粒（2142位點突變）溶液→加入剩餘的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到陽性質控品2。
抽提後的質粒再配製成所述陽性質控品3，配製方法如下：
（1）配製稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入Tris-HCl緩衝液（pH7.6）→加入剩餘的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀釋液；
（2）HP質粒（2143位點突變）預稀釋：加入50%配方量的稀釋液→加入HP質粒（2143位點突變）溶液→加入剩餘的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到X拷貝/微升HP質粒（2143位點突變）溶液；
（3）得到陽性質控品3：加入50%配方量的稀釋液→加入X拷貝/微升HP質粒（2143位點突變）溶液→加入剩餘的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到陽性質控品3。
檢測方法包括以下步驟：
第一步，準備目標物，以目標物作為檢測的對象，目標物為不經任何處理的被檢樣本或者為從被檢樣本中提取的幽門螺旋桿菌核酸，所述被檢樣本為人的胃黏膜組織，被檢樣本可直接上機進行檢測。直接使用胃黏膜組織時，避免使用含血多的樣本。如果使用血液成分含量多，或者肝素含量多的樣本，請注意充分去除血液以及肝素成分。血液成分或肝素殘存的情況下，會對PCR擴增反應有影響，不能正常檢測。需要保存樣本時，請保存在-80℃以下。使用長期凍存的樣本時，務必恢復到室溫後再使用。
第二步，以所述被檢樣本為模板基因鏈，利用所述試劑盒進行螢光定量PCR擴增反應，螢光定量PCR擴增反應的13.2μＬ反應體系為：
引物HPC-F 0.1umol/L，0.52μl；
引物HPC-R 0.1umol/L，0.52μl；
特異性靶向螢光探針 0.1umol/L，0.4μl；
內部質控引物IC-F 0.1umol/L，0.52μl；
內部質控引物IC-R 0.1umol/L，0.52μl；
內部質控探針 0.1umol/L，0.4μl；
內部質控模板 4ng/ul，1.8μl；
MgCl2*6H2O 0.35g/L，0.52μL；
dNTPs 0.02mM，0.4μL；
KOD DNA 聚合酶 0.02U/ul，0.4μl；
KOD buffer 3.2μl；
模板 4μl；
所述螢光定量PCR擴增反應的反應過程包括：
（1）94.0℃預變性30.0秒，
（2）97.0℃變性1.0秒，
（3）60.0 ℃退火3.0秒，
（4）63.0 ℃延伸 5.0秒，其中，步驟（2）~（4）循環50次。
第三步，用高解析度熔解曲線法進行檢出，檢出條件依次為：
（1）94.0 ℃，30.0秒，
（2）39.0 ℃，30.0秒，
（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；
整個螢光定量PCR擴增反應直接在全自動基因分析儀GENECUBE（生產商為TOYOBO）上進行。具體步驟為：將被檢樣本4μL、聚合酶試劑[KOD Mix]4μL、引物・探針試劑[HPC Mix]5.2μL混合後，調製成反應液。專用吸管吸取反應液到專用塑料毛細管中。進行擴增反應。進行檢出，測定波長為510nm~550nm以及573nm~613nm的螢光值。測定的螢光值由專用分析軟體解析，轉換成表示螢光變化量的螢光微分值。解析螢光微分值，在顯示屏上顯示測定結果。
第四步，檢出結果通過陽性判斷值來判斷，陽性判斷值的三種結果的判斷依據為：
（1）幽門螺旋桿菌菌群陽性及23S rRNA基因2142和2143位點無突變：螢光微分值≥10，並且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在50℃~60℃之間，參見附圖1所示；
（2）幽門螺旋桿菌菌群陽性及23S rRNA基因2142或2143位點有突變：螢光微分值≥10，並且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~50℃之間，參見附圖2和附圖3所示；
（3）幽門螺旋桿菌菌群陰性：無螢光微分值，內部質控螢光微分值≥1.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~68℃之間，參見附圖4所示；
所述螢光微分值是指對檢測到的目標物的螢光強度隨溫度變化的值做微分求導，得到螢光微分值。
只有當附圖5的熔解曲線中內部質控螢光微分值≥1.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~68℃之間時，表明整個檢測系統是正常、有效的，特別對於判斷結果為陰性時尤其重要。
上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
SEQUENCE LISTING
踏石生物科技（蘇州）有限公司
幽門螺旋桿菌耐藥基因突變檢測試劑盒及其檢測方法
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