肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF及其製備方法
2023-07-13 16:57:06 3
肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和 Nikkoxin F及其製備方法，屬於生物醫藥領域。本發明通過將尼可黴素的生物合成基因簇進行突變後導入到多氧黴素工業菌株中進行異源表達。經過質譜和核磁共振檢測，確定產生了兩種氧黴素與尼可黴素雜合的核苷類抗生素。這兩種雜合抗生素對人類或植物病原真菌具有更加顯著的抗菌活性。
【專利說明】肽基核苷類雜合抗生素 Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制 備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及肽基核苷類雜合抗生素 Nikkoxin E和Nikkoxin F及其製備方法,屬 於生物醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 多氧黴素與尼可黴素是核苷類抗生素的典型代表，其作用機理在於能夠特異性地 抑制幾丁質合成酶的活性，從而破壞真菌細胞壁的合成，實現抑制真菌的作用。多氧黴素與 尼可黴素不僅具有廣譜的抗真菌活性，並且對動植物毒性較低。但由於體外活性很難轉化 為體內活性，這兩個抗生素未能在臨床上得到廣泛應用。
[0003] 深部真菌感染又稱為侵襲性真菌感染，近年來隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮 質激素和免疫抑制劑的應用，器官移植和導管介入等新型治療手段大規模普及，惡性腫瘤、 愛滋病等臨床嚴重疾病的發生率持續上升，導致念珠菌血症之類的深部真菌感染的發病率 不斷增多。然而臨床抗真菌藥物的長期運用使得真菌耐藥性也越來越嚴重，這給深部真菌 感染的預防和治療造成巨大困難，因此目前亟待需要研發出新型的抗真菌藥物來應對日益 嚴重的深部真菌感染問題。
【權利要求】
1. 兩種肽基核苷類雜合抗生素的Nikkoxin E和Nikkoxin F，其結構如下所示：
2.權利要求1所述肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF的製備方法，包 括以下步驟： 1) 重組菌株LSY4的構建 將質粒PJTU5701/AnikOAnikQ通過接合轉移導入多氧黴素工業菌株的polOP和polF基因突變株Li3,通過apramycin抗性篩選和PCR驗證，得到重組菌株LSY4 ;所述質粒 PJTU5701/AnikOAnikQ是以同框缺失方式將尼克黴素的核苷骨架的生物合成關鍵基因 nikO和4-甲醯-4-咪唑-2-酮生物合成關鍵基因nikQ都敲除得到的，所述突變株Li3是 以同源重組的方式在多氧黴素工業菌株中氨甲醯多聚草氨酸生物合成關鍵基因polOP和 聚肟酸生物合成關鍵基因PolF中插入硫連絲菌素抗性基因而得到的雙突變菌株； 2)重組菌株LSY4發酵和肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF提取和純 化 重組菌株LSY4直接進行發酵培養，用草酸將發酵液的pH值調節至3. 0,離心過濾後 將濾液用陽離子交換樹脂吸附Dowex50Wx8H+，用0.IM氨水洗脫，選擇性收集組分並旋轉 蒸發濃縮；用分析型HPLC進行檢測，再經製備型HPLC獲得雜合抗生素純品NikkoxinE和 NikkoxinF0
3.權利要求1所述肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF的製備方法，包 括以下步驟： 1)重組菌株LSY4的構建 將質粒PJTU5701/AnikO AnikQ通過接合轉移導入多氧黴素工業菌株的polOP和 polF基因突變株Li3,通過apramycin抗性篩選和PCR驗證，得到重組菌株LSY4 ;所述質粒 PJTU5701/AnikO A nikQ是以同框缺失方式將尼克黴素的核苷骨架的生物合成關鍵基因 nikO和4-甲醯-4-咪唑-2-酮生物合成關鍵基因nikQ都敲除得到的，所述突變株Li3是 以同源重組的方式在多氧黴素工業菌株中氨甲醯多聚草氨酸生物合成關鍵基因polOP和 聚肟酸生物合成關鍵基因PolF中依次插入硫連絲菌素抗性基因而得到的雙突變菌株； 2) 高產菌株QL4的構建 將nikS通過NdeI和EcoRI酶切位點克隆到載體pJTU968上，再通過MfeI和EcoRI進 行雙酶切獲得含有紅黴素啟動子的nikS片段，然後再將該片段通過EcoRI酶切位點載體 PPM927上獲得質粒pPM927/nikS，以接合轉移方式將質粒pPM927/nikS轉入重組菌株LSY4， 通過streptomycin抗性篩選和PCR驗證，得到高產菌株QL4 ; 3) 高產菌株QL4發酵和肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和純化 高產菌株QL4直接進行發酵培養，用草酸將發酵液的pH值調節至3. 0,離心過濾後將 濾液用陽離子交換樹脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0. IM氨水洗脫，選擇性收集組分並旋轉蒸 發濃縮；用分析型HPLC進行檢測，再經製備型HPLC獲得雜合抗生素純品Nikkoxin E和 Nikkoxin F0
4.權利要求1所述的肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F在製備抗真菌 藥物中的應用。
【文檔編號】C12R1/465GK104497104SQ201510033114
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月22日 優先權日:2015年1月22日
【發明者】陳文青, 祁建釗, 鄧子新, 劉進 申請人:武漢大學