一種人結直腸癌腫瘤細胞系及其製備方法和應用的製作方法
2023-07-13 19:37:31 3
專利名稱：一種人結直腸癌腫瘤細胞系及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞系，尤其涉及一種人結直腸癌腫瘤細胞系，該細胞系表達正常幹細胞自我更新相關因子，具有高克隆形成能力和體內成瘤能力，具有腫瘤幹細胞特徵，及其可應用於腫瘤幹細胞的研究、藥物開發和相關領域。
背景技術：
癌症是嚴重威脅人類生存和健康的疾病。近幾十年來，隨著科學的發展，人們對於癌症的認識有了顯著的深入。但是傳統的治療方式並不能徹底治癒癌症，復發和轉移往往是導致癌症病人死亡的原因。研究發現腫瘤組織無論是原發腫瘤還是轉移癌中都包含有不同特徵和功能的癌細胞:高度分化的癌細胞增殖能力較弱；而具有低分化表型的癌細胞卻具有很強的增殖能力，移植到免疫缺陷小鼠體內能夠產生和原發腫瘤表型類似的腫瘤，有此功能的這部分細胞被稱為腫瘤幹細胞(Al-Hajj and Clarke，2004)。
近年來，支持腫瘤幹細胞學說的研究不斷湧現，目前從腦瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌等癌組織中分離和鑑定出腫瘤幹細胞，研究發現腫瘤幹細胞具有與正常幹細胞相似的生物學特性(Spillane and Henderson, 2007 ；Sagar et al., 2007),包括自我更新、分化、死亡耐受、膜轉運活躍、侵襲和轉移等。目前通過對腫瘤幹細胞的研究認識到，癌症的發生和生長是由一小部分腫瘤幹細胞群決定的，腫瘤幹細胞有著不同於普通癌細胞和正常細胞的生物學特徵，目前已經發現腫瘤幹細胞的特徵包括I)在腫瘤中存在比例很低，僅有數很少的一群癌細胞具有無限增殖能力；2)具有腫瘤形成能力，通過流式細胞技術或其他免疫分選技術根據表面特異分子分離出來的細胞接種到動物體內能夠形成新的腫瘤。
腫瘤幹細胞一般在腫瘤中所佔比例低，它們通常處於細胞周期的GO期，具有較高的耐藥性，對射線不敏感性。常規的化療或放療只能殺死快速分裂的普通癌細胞，而對這一小群腫瘤幹細胞作用甚微。逃脫藥物和射線殺傷作用的腫瘤幹細胞成為癌症復發和轉移的根源。腫瘤幹細胞能夠啟動腫瘤發生,並且這一小群細胞能夠維持腫瘤生長,腫瘤幹細胞的特徵為開發新型高效的診斷和治療手段提供了新思路。按照腫瘤幹細胞的理論模型，常規的治療方式不能有效地清除腫瘤幹細胞，殺死普通癌細胞只能暫時緩解癌症，癌症的轉移和復發在所難免。儘管目前臨床上有多種非常成功的治療腫瘤的藥物，可以有效緩解腫瘤，但是這種藥物並沒有治癒疾病，相當大比例的患者會發生癌症復發。原因是傳統抗腫瘤藥物的篩選是根據短期臨床治療效果評估的，因此那些能迅速殺死大量普通癌細胞的藥物往往被篩選出來，能夠殺傷腫瘤幹細胞的藥物反而因為作用時間長、短期療效不明顯而被剔除。而針對腫瘤幹細胞的藥物雖然`在短期內效果不太明顯，但是由於遏制癌症發展的源頭，長期效果更加顯著。腫瘤幹細胞模型為設計高效徹底治癒癌症的治療方法提供了思路:通過傳統治療殺死普通癌細胞，針對腫瘤幹細胞特異性靶點來抑制腫瘤幹細胞功能或清除腫瘤幹細胞，可能會達到既療效顯著又能徹底治癒的效果。更精確地靶向腫瘤幹細胞的藥物療效將會更加持久，副作用更小，可能達到完全治癒的目的。
腫瘤幹細胞的概念為癌症的發生、發展、轉移和復發提供了新的思路，這方面的深入研究有可能為腫瘤的治療和早期診斷帶來新的契機。尋找腫瘤幹細胞特異標誌及信號通路，找到能有效殺傷腫瘤幹細胞的方法和手段，將為癌症的治療提供新的思路。然而制約腫瘤幹細胞研究的主要困難在於腫瘤幹細胞數目稀少，且在體外培養容易分化為普通癌細胞。
目前國內外尚無腫瘤幹細胞系的報導，腫瘤幹細胞主要來源於運用流式細胞分選技術從臨床樣本中獲得特定表面蛋白(如⑶44，⑶133，⑶24等)標記的原代癌細胞，這就導致了腫瘤幹細胞活力低和樣本之間差異大的問題。由於原代腫瘤幹細胞在普通體外培養條件下極易分化程普通癌細胞，極大制約了腫瘤幹細胞的深入研究。發明內容
因此，本發明的目的是針對現有條件的不足，提供一種具有腫瘤幹細胞特徵的細胞系，從而能夠更為有效地進行殺傷腫瘤幹細胞的藥物開發，從根本上治療腫瘤。
本發明的另一目的是提供一種腫瘤幹細胞的建系方法，其用於分離、鑑定腫瘤幹細胞特徵，還提供一種長期培養腫瘤幹細胞系的技術，用於在標準培養體系內獲得穩定和充足的腫瘤幹細胞來源。
針對上述目的，本發明的技術方案如下:
一方面，本發明提供一種表達CD44膜蛋白的人結直腸癌腫瘤幹細胞系，所述細胞係為保藏號為CGMCC N0.5558的人結直腸癌腫瘤幹細胞系P6C (該細胞系的分類命名為人結腸癌幹細胞，並於2011年12月08日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；郵編:100101)。
另一方面，本發明提供一種人結直腸癌腫瘤幹細胞系P6C的指示細胞系，所述細胞系通過將0tc3/4啟動子連接EGFP基因的質粒轉染於本發明所述的細胞系而得。
優選地，所述細胞系能夠形成腫瘤。
優選地，所述細胞系形成的腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤。
優選地，所述形成的腫瘤能夠發生轉移。
更優選地，所述形 成的腫瘤能夠轉移到肝臟。
再一方面，本發明提供一種高表達CD44膜蛋白的人結直腸癌腫瘤幹細胞系的製備方法，包括以下步驟:
I)分離原代結腸癌幹細胞:取結腸癌組織剪碎後，消化獲得單細胞懸液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647單抗和小鼠抗人⑶44FITC單抗孵育；再用無菌流式細胞分選技術分離出原代結腸癌細胞；
2)原代結腸癌幹細胞的體外培養:稀釋步驟I)獲得的原代細胞，接種於96孔板中進行培養；
3)結腸癌幹細胞的培養及鑑定:當原代細胞形成的懸浮球狀克隆直徑達到0.5毫米左右時，離心去上清，再將其消化後，以1: 5的比例重新接種到新鮮細胞培養液中，篩選體內成瘤能力和體外克隆形成能力的P6C細胞；
4)將步驟3)獲得的結腸癌幹細胞再次按與步驟I)、2)和3)相同的方法分離、培養篩選表達⑶44膜蛋白的腫瘤幹細胞系P6C，即得。
優選地，還包括將0tc3/4啟動子連接於EGFP基因的質粒轉染於步驟4)獲得的腫瘤幹細胞系。
又一方面，本發明提供一種上述所述的細胞系或所述的方法製得的細胞系在製備用於誘導腫瘤形成的藥物中的應用。
另一方面，本發明提供一種上述所述的細胞系或所述的方法製得的細胞系在製備用於轉移腫瘤的藥物中的應用。
再一方面，本發明提供一種上述所述的細胞系或所述的方法製得的細胞系在製備篩選抗腫瘤藥物中的應用。
本發明的腫瘤幹細胞系表達腫瘤幹細胞表面標誌蛋白，具有極高的克隆形成你能力和體內成瘤能力，並對多種臨床抗腫瘤藥物具有極強的耐藥性，能夠在體外穩定培養，從而細胞系材料應用於腫瘤和腫瘤幹細胞的藥物開發。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
圖1表明流式細胞儀分選EpCAM+CD44+的原代結腸癌細胞的試驗結果圖，其中，圖1A為流式細胞儀分選EpCAM+原代結腸癌細胞的點樣分布圖，圖中I為不表達EpCAM的細胞，2為表達EpCAM的細胞；圖1B為流式細胞儀分選EpCAM+CD44+原代結腸癌細胞的試驗結果圖2表明EpCAM+⑶44+原代結腸癌幹細胞的克隆形成能力；
圖3表明EGFP指示本發明所述腫瘤幹細胞系P6C的指示細胞系的0ct3/4啟動子的激活狀態；
圖4表明流式細胞技術分析本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C膜蛋白表達的試驗結果，其中，圖4A為本發明所述腫瘤幹細胞系P6C的膜蛋白表達的流式細胞分析圖，其中Ml表示不表達該膜蛋白，即陰性；M2表示表達該膜蛋白，即陽性；圖48為本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C膜蛋白相對表達量柱狀圖5表明本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C表達幹細胞因子0ct3/4，其中，圖5A為細胞系P6C表達的內源性0ct3/4免疫螢光結果，圖5B為細胞系P6C的DAPI染核結果，圖5C為A與B螢光疊加結果；
圖6表明本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C具有很高的克隆形成能力，其中，圖6A為發明所述的腫瘤幹細胞系P6 C、HCTl 16和SW480的克隆結果圖，圖6B為本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C、HCT116和SW480克隆數量統計圖7表明本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C的皮下成瘤能力；
圖8表明本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C能夠在原位形成腫瘤，並能夠轉移到肝臟。
圖9表明本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C對喜樹鹼(camptothecin)具有很高的耐藥性，其中，圖9A為喜樹鹼處理本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C、HCT116和SW480的細胞形態圖，其中的對照為未經藥物處理的細胞形態，圖9B為喜樹鹼處理本發明所述的腫瘤幹細胞系P6C、HCTl 16和SW480存活細胞統計本發明的生物材料的保藏信息:
保藏號為CGMCC N0.5558的人結直腸癌腫瘤幹細胞系P6C，該細胞系的分類命名為人結腸癌幹細胞，並於2011年12月08日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；郵編:100101ο具體實施方式
除非特別指明，以下實施例中所用的裸鼠品種均為BALB/c nude，購自中國醫學科學院動物所；結腸癌組織，取自北京腫瘤醫院；結腸癌細胞系HCT116和SW480均購自ATCC。
除非特別指明，以下實施例中所用的細胞培養液均為:2%胎牛血清(購自Hyclone公司)，8%血清替代物(購自Gibco), IX非必須胺基酸(購自Gibco), 100U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素的DMEM培養液(購自Gibco)。
除非特別指明，以下實施例所用的DAPI染核方法參見:Karen G.Porter andYvette S.Feig,The Use of DAPI for Identifying and Counting Aquatic Microflora,Limnology and oceanography，1980 年，25 (5)期(卷)，943-948 頁。
實施例1分離、鑑定原代結腸癌幹細胞
a)分離原代結腸癌幹細胞:取結腸癌病人新鮮結腸癌組織(取自北京腫瘤醫院)，在含有300單位/毫升(U/mL)青黴素和300U/mL鏈黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS)中漂洗3次；用無菌眼科剪將其剪碎；加入I毫克/毫升(mg/mL)膠原酶(購自Sigma公司)和lmg/mL透明質酸酶(購自Sigma公司)消化液,於37°C消化30分鐘(min);離心去上清,PBS重懸後用40微米細胞篩過濾獲得單細胞懸液。將細胞與小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647單抗(I: 50，購自Cell Signaling公司)，小鼠抗人CD44FITC單抗(I: 50，購自BD公司)一起4°C孵育15分鐘；然後用無菌流式細胞分選技術(FACS)分離出EpCAM+CD44+的原代結腸癌細胞。圖1A中紅色點即2為表達EpCAM的細胞，即EpCAM+ ;圖1B細胞均為圖1A中紅色點細胞(圖1中的2)，即EpCAM+，其中P2為表達EpCAM，表達⑶44的細胞，即EpCAM+⑶44+，P3為表達EpCAM，不表達CD44的細胞，即EpCAM+CD44_。
b)原代結腸癌幹細胞的體外培養:稀釋原代細胞，以平均0.5個細胞/孔的密度接種在96孔板中，培養條件為2%胎牛血清(購自Hyclone公司)，8%血清替代物(購自Gibco)，I X非必須 胺基酸(購自Gibco)，100U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素的DMEM培養液(購自Gibco),於37°C、5% 二氧化碳、95%空氣的恆溫培養箱(購自Sanyo公司)中進行培養。三天換細胞培養液一次，取單細胞來源的克隆。
c)結腸癌幹細胞的培養及鑑定:當原代細胞形成的懸浮球狀克隆直徑達到0.5毫米左右時，300g離心5分鐘，去上清；加入0.25%胰蛋白酶(購自Sigma公司)，37°C消化10分鐘；輕輕將細胞球吹散後以1: 5的比例重新接種到新鮮細胞培養液中。體內成瘤能力和體外克隆形成能力是鑑定腫瘤幹細胞特徵的兩個金標準。上述低粘附板中的球狀克隆長至0.5_直徑時，用玻璃管小心吸出單個克隆球，接種到裸鼠(BALB/c nude，購自中國醫學科學院動物所)皮下，觀察腫瘤生長情況，記錄腫瘤大小，計算體積。當皮下腫瘤長軸達到5mm或40天時，處死裸鼠，剝取皮下腫瘤。部分腫瘤繼續接種到裸鼠皮下，檢測次級皮下腫瘤的發生；部分腫瘤固定在10%中性福馬林溶液中，石蠟包埋切片，免疫組化方式檢測CD44等腫瘤幹細胞表面蛋白的表達，蘇木素/伊紅(H&E)染色觀察皮下腫瘤的組織形態；還有部分腫瘤用膠原酶/透明質酸酶消化成單細胞懸液，流式細胞技術分析CD44等腫瘤幹細胞相關蛋白的表達。除體內成瘤實驗以外，傳代中的單細胞懸液經過計數以後接種1000個到0.35%軟瓊脂中，21天以後用結晶紫染色，所有克隆均可以被染上藍紫色(圖2)。只統計直徑大於等於0.5mm的克隆的數目，計算克隆形成能力(=克隆數目/1000X 100%)o
實施例2建立具有腫瘤幹細胞特徵的細胞系
a)表達CD44膜蛋白的腫瘤幹細胞系的建立:用上述方法分離、培養獲得的結腸癌細胞具有腫瘤幹細胞的特徵，具有極高的腫瘤形成能力和克隆形成能力，命名為P6C。P6C能在體外穩定傳代，目前已經傳代到第120代。P6C在低粘附培養條件下形成懸浮的克隆球，在粘附條件下能貼壁形成幹細胞樣克隆(holoclone)。
b)0ct3/4啟動子激活指示細胞系的建立:0ct3/4啟動子被調控激活狀態下EGFP表達發出綠色螢光，以此指示幹細胞因子0ct3/4的活化狀態。轉染細胞系P6C的前一天，將細胞系P6C從克隆球中用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，預鋪於鋪有明膠的六孔板中(2X IO5個細胞/孔)。0ct3/4promoter EGFP質粒(該質粒為0ct3/4啟動子克隆到EGFP基因上遊的質粒)，購自上海交通大學醫學院，取2 μ g該質粒與6 μ L脂質體lipo2000 (購自Invitrogen公司)的混合物；6小時後吸去質粒_脂質體，加入細胞培養液，隔天換細胞培養液(與前述細胞培養液一致)。第三天收集所有細胞，通過流式細胞儀分選表達EGFP的細胞，於新鮮細胞培養液中貼壁培養；1周以後再次收集細胞，流式分選表達EGFP的細胞；重複分選I次，把分選到的細胞以平均0.5個細胞/孔的密度接種到96孔板中，得到EGFP綠色突光指示0ct3/4啟動子激活狀態的P6C指示細胞,如圖3所示。
實施例3腫瘤幹細胞系P6C的分化特性檢測
a)將貼壁培養的細胞系P6C用0.2%胰蛋白酶37°C消化成單細胞懸液，計數，加入PH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)至終濃度為IO6個細胞/毫升。
b)分別加入螢光標記的小鼠抗人單克隆抗體ant1-⑶24 (I: 50，購自Biolegend) ;anti_CD44(l: 50,購自 BD pharmingen) ;anti_CD133 (1: 50,購自Miltenyi) ;ant1-CD45_FITC(I: 50，購自 BD pharmingen) ;anti_CD31(l: 50，購自 BDpharmingen) ;anti_CKl (1: 50,購自 Santa Cruz) ；ant1-CK20 (1: 50,購自 Santa Cruz)；ant1-CDX2(l: 100，購自 DAKO)。
c)4°C孵育20分 鍾，然後用流式細胞儀檢測對應抗原的表達情況；FITC標記的山羊抗小鼠IgG與P6C細胞系孵育作為陰性對照。
如圖4所示，表明細胞系P6C表達上皮細胞標誌物⑶24，癌症幹細胞標誌物⑶44，⑶133 ;不表達內皮來源標誌物⑶45，⑶31 ;低表達分化的癌細胞標誌物CK1、CK20、⑶X2。球狀克隆狀態的P6C(P6MC)表達更多的腫瘤幹細胞標誌蛋白⑶44和⑶133。結腸癌細胞系SW480作為分化癌細胞對照。
實施例4腫瘤幹細朐系P6C表汰幹細朐閔子0ct3/4
a)在低粘附培養板中如實施例1所述條件下培養腫瘤幹細胞系P6C，收集P6C球狀克隆。
b)加入多聚甲醒(購自Sigma公司)固定20分鐘，2N HCl處理20分鐘。
c)加入小鼠抗人0ct3/4單克隆抗體(購自Santa Cruz公司)，室溫孵育3小時。
d)加入Cy3標記的抗小鼠IgG 二抗。
e) DAPI復染細胞核後封片。
如圖5所示，螢光顯微鏡下檢測到P6C表達內源性0ct3/4，且與DAPI染色結果重合，表明0ct3/4定位於細胞核中。
實施例5腫瘤幹細胞系P6C體外克隆形成能力檢測
a)細胞系P6C用0.2%胰蛋白酶37°C消化10分鐘，玻璃管吹打成單細胞懸液，計數。
b) IOOOrpm離心去上清，加入細胞培養液(同前所述)至終濃度IO4個細胞/毫升。
c)取20微升P6C單細胞懸液接種於六孔板，每4_5天更換新鮮細胞培養液。
d)21天以後吸去細胞培養液，pH7.2磷酸鹽緩衝液洗I次。
e)加入1%結晶紫(購自Sigma公司)染色，PBS洗一次。計算每孔克隆數量，結果如圖6所示，顯示P6C的克隆形成能力顯著高於結腸癌細胞系HCT116和SW480。
實施例6腫瘤幹細胞系P6C在免疫缺陷小鼠皮下形成腫瘤
a) 2 X IO6個P6C細胞接種在六孔板中，加入如前所述的細胞培養液培養24小時。
b)將DsRed紅色螢光質粒(購自中國科學院動物研究所)I μ g與3 μ L轉染試劑(購自Origen公司)在200 μ L無血清DMEM中混合均勻，滴入預鋪P6C細胞的六孔板中，共同孵育6小時。
c)吸去細胞培養液混合物，加入如前所述細胞培養液，24小時之後在螢光顯微鏡下觀察紅色螢光，估算轉染效率。
d)往細胞培養液中加入0.5 μ g/mL終濃度的嘌呤黴素(puromycin)(購自Sigma公司)，隔天吸去死細胞並加入新鮮細胞培養液(含嘌呤黴素)，重複4次，獲得穩定表達DsRed紅色螢光蛋白的P6C細胞。
e)0.2%胰蛋白酶消化此細胞成單細胞懸液，並以平均0.5個細胞/孔的密度接種於96孔板中。14天後取形成的單細胞克隆接種於裸鼠(BALB/cnude，購自中國醫學科學院動物所)皮下，用活體螢光成像的方法檢測皮下腫瘤的形成，如圖7所示。
實施例7腫瘤幹細胞系P6C能在免疫缺陷小鼠盲腸形成原位腫瘤
a)以3X IO5個細胞/mL細胞培養液的密度將穩定表達DsRed紅色螢光的P6C腫瘤幹細胞系接種在底面積為25cm2的培養瓶中，加入如前所述的細胞培養液培養24小時，獲得對數生長期的細胞。
b)0.2%胰蛋白酶消化此細胞成單細胞懸液，計數，並以2X107個細胞/mL的濃度重懸在磷酸鹽緩衝液PBS中。
c) 100 μ L 3%戊巴比妥溶液腹腔注射聯合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID，購自中國醫學科學院動物所)，待5分鐘小鼠麻醉後在超淨工作檯剪開小鼠腹膜，暴露盲腸。
d)用胰島素針吸取50 μ L P6C細胞懸液，並將細胞懸液移植到盲腸腸壁。
e)手術縫合小鼠腹膜和皮膚，4周後用活體螢光成像的方法檢測盲腸原位腫瘤的形成，如圖8所示。
實施例8腫瘤幹細胞系P6C形成的腫瘤能夠轉移到肝臟
a)以3X IO5個細胞/mL細胞 培養液的密度將穩定表達DsRed紅色螢光的P6C腫瘤幹細胞系接種在底面積為25cm2的培養瓶中，加入如前所述的細胞培養液培養24小時，獲得對數生長期的細胞。
b)0.2%胰蛋白酶消化此細胞成單細胞懸液，計數，並以2X107個細胞/mL的濃度重懸在磷酸鹽緩衝液PBS中。
c) 100 μ L 3%戊巴比妥溶液腹腔注射聯合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID，購自中國醫學科學院動物所)，待5分鐘小鼠麻醉後在超淨工作檯剪開小鼠腹膜，暴露盲腸。
d)用胰島素針吸取50 μ L P6C細胞懸液，並將細胞懸液移植到盲腸腸壁。
e)手術縫合小鼠腹膜和皮膚，12周後用活體螢光成像的方法檢測腫瘤轉移到肝臟，如圖8所示。
實施例9腫瘤幹細胞系P6C的耐藥性
a)將P6C細胞克隆球用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，預鋪於鋪有明膠的六孔板中(2 X IO5個細胞/孔)，培養24小時。
b)加入終濃度為2 μ M, 5 μ M喜樹鹼(Camptothecin,購自Sigma公司),培養24小時至48小時。
c)明場顯微鏡下觀察細胞形態，按與步驟b)相同的方法處理的普通結腸癌細胞系HCT116(購自ATCC)和SW480作為一般結腸癌細胞系耐藥性對照，未加喜樹鹼處理的P6C、HCT116和SW480細胞作為陰性對照。
d)收集所有貼壁和懸浮的細胞，AnnexinV/PI染色(Manon van Engeland, LucJ.W.Nieland, Fran s C.S.Ramaekers, Bert Schutte, and Chris P.M.Reutelingsperger,Annexin V-Affinity Assay:Α Review on an Apoptosis Detection System Based onPhosphatidylserine Exposure，Cytometry, 1998 年，31 期，1-9 頁)，流式細胞技術檢測活細胞比例。
試驗結果如圖9所示，圖示濃度和作用時間下細胞形態的檢測(圖9A)和MTT細胞活力檢測(Denis Gerlier, Nicole Thomasset，Use of MTT colorimetric assay tomeasure cell activation,Journal of Immunological Methods，94 卷，1-2 期，57-63 頁，1986年)(圖9B)都顯示相對於結腸癌細胞HCT116和SW480，P6C都具有高耐藥性。
權利要求
1.一種表達CD44 I吳蛋白的人結直腸癌腫瘤幹細胞系，所述細胞係為保減號為CGMCCN0.5558的人結直腸癌腫瘤幹細胞系P6C。
2.一種人結直腸癌腫瘤幹細胞系P6C的指示細胞系，所述細胞系通過將Otc3/4啟動子連接EGFP基因的質粒轉染於權利要求1所述的細胞系而得。
3.根據權利要求1或2所述的細胞系，其特徵在於，所述細胞系能夠形成腫瘤。
4.根據權利要求3所述的細胞系，其特徵在於，所述腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤。
5.根據權利要求4所述的細胞系，其特徵在於，所述腫瘤能夠發生轉移，優選地，所述腫瘤能夠轉移到肝臟。
6.根據權利要求1所述的細胞系的製備方法，包括以下步驟: 1)分離原代結腸癌幹細胞:取結腸癌組織剪碎後，消化獲得單細胞懸液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647單抗和小鼠抗人⑶44 FITC單抗孵育；再用無菌流式細胞分選技術分離出原代結腸癌細胞； 2)原代結腸癌幹細胞的體外培養:稀釋步驟I)獲得的原代細胞，接種於96孔板中進行培養； 3)結腸癌幹細胞的培養及鑑定:當原代細胞形成的懸浮球狀克隆直徑達到0.5毫米左右時，離心去上清，再將其消化後，以1: 5的比例重新接種到新鮮細胞培養液中，篩選體內成瘤能力和體外克隆形成能力的P6C細胞； 4)將步驟3)獲得的結腸癌幹細胞再次按與步驟I)、2)和3)相同的方法分離、培養篩選表達⑶44膜蛋白的腫瘤幹細胞系P6C，即得。
7.根據權利要求6所述的細胞系的製備方法，其特徵在於，還包括將Otc3/4啟動子連接EGFP基因的質粒轉染於步驟4)獲得的腫瘤幹細胞系。
8.根據權利要求1至5中任一項所述的細胞系或權利要求6或7所述的方法製得的細胞系在製備用於腫瘤形成或轉移腫瘤的藥物中的應用。
9.根據權利要求1至5中任一項所述的細胞系或權利要求6或7所述的方法製得的細胞系在製備篩選抗腫瘤發生、腫瘤生長或腫瘤轉移的藥物中的應用。
10.根據權利要求8或9所述 的應用，其特徵在於，所述腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤。
全文摘要
本發明提供一種人結直腸癌腫瘤幹細胞系及其製備方法和應用，所述細胞係為保藏號為CGMCC No.5558的人結直腸癌腫瘤幹細胞系P6C，所述細胞系的製備方法，包括以下步驟1)分離原代結腸癌幹細胞；2)原代結腸癌幹細胞的體外培養3)結腸癌幹細胞的培養及鑑定；4)將步驟3)獲得的結腸癌幹細胞再次按與步驟1)、2)和3)相同的方法分離、培養篩選表達CD44膜蛋白的腫瘤幹細胞系所述細胞系的應用為其在製備用於誘導腫瘤形成的藥物、用於腫瘤轉移的藥物和篩選抗腫瘤發生、抗腫瘤生長和抗腫瘤轉移藥物中的應用。
文檔編號C12N5/10GK103243074SQ20121003312
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月14日 優先權日2012年2月14日
發明者陳佺, 杜蕾, 王珺, 金海京, 王曉慧 申請人:中國科學院動物研究所