一種新型的納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜及其製備方法和用途與流程
2023-07-14 01:58:22 1
本發明涉及一種新型的納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜及其製備方法和用途，屬生物材料領域。
背景技術：
大面積的皮膚缺損能導致體內水分、電解質和蛋白質等大量丟失，破壞人體內環境穩定，並且易導致微生物侵入引起局部和全身感染，從而出現各系統複雜和嚴重的病理生理變化，繼而對人的生命構成威脅[1]。研究表明，任何直徑大於4cm的全層皮膚缺損，人體無法通過自身來完全癒合，必須藉助皮膚創面修復材料來進行治療[2]。傳統的皮膚創面修復材料通常採用：①自體組織移植；②異體組織移植。自體皮膚組織移植雖然具有良好的修復治療效果，但面臨供體來源缺乏、需二次手術並且會造成新的創傷等條件的制約；異體、異種皮膚組織移植不僅面臨供體來源少的限制，而且存在引起免疫排斥反應、傳播病原等風險；因此上述兩種皮膚創面修復材料均存在一定程度的缺陷，無法滿足臨床的需要。近些年興起的皮膚組織工程為解決這些問題提供了一種優越的方法。這種方法的核心是在體外利用人工合成的皮膚支架材料，結合皮膚組織細胞及生長因子來構建工程化皮膚，有效治療和修復大面積皮膚缺損。然而，在皮膚組織工程的研究中，一個最突出和最具挑戰性的問題是人工修復材料往往生物活性較差，不能有效地促進以及誘導皮膚組織細胞的增殖、分化以及促創面癒合相關因子的表達[3]。
為了解決這個問題，由靜電紡絲技術製備的納米纖維材料，由於具有同天然人體細胞外基質(ECM)相似的纖維結構以及較大的比表面積，能夠促進皮膚組織細胞在其上的粘附與生長，並且其良好的孔連通性也有利於創傷區域細胞的呼吸作用以及增加組織液的吸收，使其能夠保持理想的潤溼程度，這些優點使得靜電紡絲作為一種理想的組織工程修復材料的製備技術在皮膚組織工程領域受到了越來越多的關注和青睞[4]。然而，目前由靜電紡絲技術製備的創面修復材料普遍存在活性較低等缺點。為了解決這個問題，近些年來，研究者員通過在人工高分子中添加天然高分子如膠原蛋白等進行混合電紡，或者通過對已製得的電紡纖維材料表面進行改性接枝一些生物活性因子如bFGF等等，期望能夠製備出具有較好生物活性的複合纖維材料，但這些天然高分子以及生物活性因子往往來源有限，價格昂貴，並且在製備過程中容易失活，導致其在皮膚組織工程的應用中受到了較大的限制[5]。與此同時，生 物活性玻璃由於具有良好的生物活性以及生物相容性，能夠與皮膚等軟組織形成良好的結合，還能夠促進成纖維細胞增殖，以及刺激血管內皮生長因子(VEGF)的表達和蛋白分泌，並且基因晶片研究發現其還能激活具有造血功能的CD44抗原形成前體、成纖維母細胞生長因子受體(N-sam)和血管細胞粘附蛋白(V-CAM1)等對創面修復起關鍵作用的基因上調，因此，生物活性玻璃在創面修復中受到了廣泛的關注[6,7]。因此，如果能運用一種新的方法均勻穩定地將生物活性玻璃塗敷於電紡纖維表面，這種生物活性玻璃塗層將會由於離子釋放而在纖維表面形成活性離子微環境，從而刺激以及促進皮膚組織細胞的生長以及促創面癒合相關因子的表達來提高創面修復材料表面的生物活性促進創面癒合，並且如果還能夠進一步結合靜電紡絲微圖案技術，從微納米級別的結構上對皮膚組織細胞的生長分化行為進行引導和調控，那麼這種結構和成分上的協同作用將會使得複合材料具有更高的生物活性，這將對於促進大面積創面癒合具有很高的研究價值。近年來，脈衝雷射技術(PLD)被廣泛應用於材料製備中[8]。Ca-Mg-Si體系陶瓷，比如說鎂黃長石(Akermanite,AKT)，是一種含鈣、鎂、矽的生物陶瓷，具有優異的骨誘導能力，被廣泛應用組織工程領域中[7]。
參考文獻
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8.H.Kim,R.P.Camata,S.Chowdhury,Y.K.Vohra,Acta Biomater,2010,6,3234-3241.。
技術實現要素：
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供一種具有良好的生物活性及促創面癒合能力的納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜及其製備方法和用途。
在此，一方面，本發明提供一種納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜，其包括圖案化電紡纖維膜和均勻塗敷於所述圖案化電紡纖維膜表面的Ca-Mg-Si生物玻璃塗層。
本發明將具有良好生物活性和生物相容性的Ca-Mg-Si生物玻璃均勻塗敷於圖案化電紡纖維膜表面，該Ca-Mg-Si生物玻璃由於離子釋放而在纖維表面形成活性離子微環境，從 而刺激以及促進皮膚組織細胞的生長以及促創面癒合相關因子的表達來提高創面修復材料表面的生物活性促進創面癒合，同時圖案化電紡纖維膜具有微納米級別的結構，對皮膚組織細胞的生長分化行為進行引導和調控，這種結構和成分上的協同作用使得複合材料具有更高的生物活性，適合用作創面修復材料。
本發明中，所述納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜呈多級微納米結構，包括微米級圖案結構、納米級纖維結構、和纖維表面的納米Ca-Mg-Si生物玻璃顆粒結構。
較佳地，圖案的尺寸為100～800μm，纖維的直徑為500～1000nm，Ca-Mg-Si生物玻璃顆粒的粒徑為20～40nm，所述Ca-Mg-Si生物玻璃塗層的厚度為30～100nm。
較佳地，所述Ca-Mg-Si生物玻璃為鎂黃長石、白矽鈣石、透灰石、和鎂薔薇輝石中的至少一種。
另一方面，本發明還提供上述納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜的製備方法，採用脈衝雷射沉積技術，以Ca-Mg-Si生物陶瓷為靶材，在圖案化電紡纖維膜表面沉積Ca-Mg-Si生物玻璃塗層。
本發明中，通過採用脈衝雷射沉積法，可以製得塗層均勻、穩定性好的Ca-Mg-Si生物玻璃塗層，從而使製得的納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜具有更好的生物活性。而且該方法工藝簡單、條件易於控制、可重複性好。另外，可以通過控制工藝參數來控制塗層厚度、結晶度及晶粒大小等。
較佳地，在所述脈衝雷射沉積技術中，雷射器頻率為5～20Hz，基體與靶材之間的距離為5～10cm，雷射束與靶材表面成30～60度角，沉積溫度為10～50℃，氣氛壓強為10～50MPa，沉積時間為5～40分鐘。
較佳地，沉積過程中靶材以1000～3000轉/小時的速度旋轉。
較佳地，所述Ca-Mg-Si陶瓷的製備包括如下步驟：按Ca-Mg-Si陶瓷的化學計量比稱取正矽酸乙酯、可溶性鈣鹽和可溶性鎂鹽為原料，經溶膠凝膠法製得幹凝膠；以及將所得幹凝膠在1000～1400℃下煅燒得到Ca-Mg-Si陶瓷。
較佳地，所述圖案化電紡纖維膜的製備包括如下步驟：以具有編織結構的導電模板作為靜電紡絲收集器，將電紡溶液或熔體進行靜電紡絲，靜電紡絲過程中電壓為6～12kv，收集距離為10～15cm，電紡流量為0.01～0.06ml/分鐘，收集時間為15～60分鐘。
又一方面，本發明還提供上述納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜在製備創面修復材料中的應用。
附圖說明
圖1為無塗層的圖案化電紡纖維膜(PT)、生物玻璃塗覆的無紡纖維膜(NW-NBG)以及生物玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)的SEM(掃描電鏡)圖，其中，圖案結構為微米級別(100～800μm)，纖維結構為納米級別(500～1000nm)，生物活性玻璃顆粒為納米級別(約為30nm)；
圖2A為無塗層圖案化纖維膜的EDS(能譜分析)圖；
圖2B為生物活性玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)的EDS圖；
圖2C為生物活性玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)及無塗層圖案化纖維膜的XRD(X-射線衍射)圖；
圖2D為生物活性玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)及無塗層圖案化纖維膜的水接觸角圖；
圖3為將不同類型的創面修復材料植入實驗鼠背部創傷區域隨著時間的變化情況；
圖4為3天以及7天後經過不同創面修復材料處理後的創傷區域組織的組織染色觀察情況；圖5為3天以及7天後經過不同創面修復材料處理後的創傷區域組織的組織螢光染色(CD31)觀察情況以及內皮生長因子(VEGF)的表達情況；
圖6為7天後經過不同創面修復材料處理後的創傷區域組織的Masson’s三色染色情況，其中藍色代表膠原纖維；圖中C為利用Western blotting對COL 1和COL 3進行表達分析。
具體實施方式
以下結合附圖和下述實施方式進一步說明本發明，應理解，附圖及下述實施方式僅用於說明本發明，而非限制本發明。
本發明一方面提供一種納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜，其包括圖案化電紡纖維膜和均勻塗敷於所述圖案化電紡纖維膜表面的Ca-Mg-Si生物玻璃塗層。該Ca-Mg-Si生物玻璃塗層呈現納米級別的顆粒，其粒徑可為20～40nm。該Ca-Mg-Si生物玻璃塗層的厚度可為30～100nm。
本發明的納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜呈多級微納米結構，包括微米級圖案結構、納米級纖維結構、和纖維表面納米顆粒結構。其中微米級圖案結構的圖案形狀可為正方形、圓形、條紋狀、菱形等任意形狀。圖案大小可為100～800μm。構成圖案的納米級纖維結構的直徑可為500～1000nm。位於纖維表面的Ca-Mg-Si生物玻璃顆粒如上所述粒徑可為20～40nm。該圖案具有三級微納米結構，從大孔微米級，到幾百納米纖維，再到幾十納米的顆粒。
這種多級微納米結構與生物活性玻璃塗層能夠顯著提高材料的生物活性。並且採用 體內實驗鼠背部創面癒合實驗證明了這種多級微納米結構與納米生物活性玻璃塗層能夠協同促進創面的修復，提高創面修復速率以及快速上皮化，並且還能夠促進創傷區域血管新生以及膠原沉積，在一定程度上還能夠減少疤痕組織的形成。
本發明中，Ca-Mg-Si生物玻璃塗層是含有Ca、Mg和Si的三元組分的生物玻璃，包括但不限於鎂黃長石、白矽鈣石、透灰石、鎂薔薇輝石。
在一個優選的實施方式中，Ca-Mg-Si生物玻璃塗層通過脈衝雷射沉積法製得。由此可以使Ca-Mg-Si生物玻璃塗層塗敷均勻、結構穩定，有利於提高其生物活性，而且易於獲得納米級別的生物玻璃顆粒。
本發明中，圖案化電紡纖維膜的材料沒有特別限制，只要是能夠通過靜電紡絲技術製備成圖案化電紡纖維膜的高分子聚合物都可以適用，包括但不限於聚己內酯、聚乳酸、聚乙烯醇縮丁醛、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、殼聚糖等。優選為具有生物相容性的高分子聚合物。
可以採用Ca-Mg-Si體系生物陶瓷為原材料(靶材)，在具有微米級圖案結構的靜電紡絲納米纖維膜(圖案化電紡纖維膜)上，利用脈衝雷射沉積法製備上述納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜。
作為靶材的Ca-Mg-Si陶瓷可以通過溶膠凝膠法製備。在一個示例中，按Ca-Mg-Si陶瓷的化學計量比稱取正矽酸乙酯、可溶性鈣鹽和可溶性鎂鹽為原料，經溶膠凝膠法製得幹凝膠；以及將所得幹凝膠在1000～1400℃下煅燒得到Ca-Mg-Si陶瓷。其中可溶性鈣鹽包括但不限於硝酸鈣、氯化鈣等。可溶性鎂鹽包括但不限於硝酸鎂、氯化鎂等。
圖案化電紡纖維膜通過靜電紡絲法製備。具體方法可參見現有技術例如CN101182650等。在一個示例中，電紡液可以是適合電紡的高分子聚合物的溶液或熔體。電紡溶液的濃度可為3～10％,w/v。作為靜電紡絲收集器，可以採用具有編織結構的導電模板，其編織結構和尺寸可根據所需的圖案化電紡纖維膜的結構和尺寸來選擇，例如可為邊長為100-800μm的正方形。在一個示例中，電紡過程中電壓為6～12kv，收集距離為10～15cm，電紡流量為0.01～0.06ml/min，收集時間為15～60min，製得具有正方形編織結構(圖案大小為100-800μm)的圖案化電紡纖維膜。
在脈衝雷射沉積法中，例如可以採用KrF雷射器(波長248nm，脈衝寬度20ns)。雷射器頻率可為5～20Hz。基體與靶材之間的距離可為5～10cm。雷射束與靶材表面可成30～60度角。氣氛壓強可為10～50Pa。沉積溫度可為10～50℃。沉積時間可為5～40分鐘。可以通過調控沉積溫度、氣氛壓強、靶基距、以及沉積時間來控制塗層的厚度、結晶度 及晶粒大小。為提高沉積薄膜的均勻性以及防止靶材被擊穿,沉積過程中Ca-Mg-Si陶瓷可以1000～3000r/hr的速度旋轉。
以下，作為示例，說明本發明的一個實施方式。在該實施方式中，通過脈衝雷射沉積法製備了納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜；通過系統研究生物納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜是否具有良好的生物活性及促創面癒合能力等性能來確定其是否能夠用作新型的創面修復材料。具體如下。
1.雷射脈衝沉積法製備納米生物玻璃及表徵
試驗用脈衝雷射沉積薄膜的基體材料為圖案化靜電紡絲材料，實驗採用金屬平板以及具有編織結構的導電模板作為靜電紡絲收集器(邊長為100-800μm)(篩網，市場購買所得)，將聚己內酯/聚乳酸(1/9～9/1,w/w)溶於DMF/THF(1/1～5/1,v/v)中配得電紡溶液(3～10％,w/v)，電紡過程中電壓為6～12kv，收集距離為10～15cm，電紡流量為0.01～0.06ml/min，收集時間為15～60min，由此製得具有無紡結構纖維膜(NW)以及正方形編織結構(圖案大小為100-800μm)的圖案化電紡纖維膜(PT)。並且將一部分所得到的無紡纖維膜以及圖案化纖維膜分別用於下一步的雷射脈衝表面沉積納米生物活性玻璃顆粒。
用於脈衝雷射沉積薄膜的靶材為Ca-Mg-Si體系生物陶瓷。採用正矽酸乙酯(TEOS)、四水合硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O]和六水合硝酸鎂[Mg(NO3)2·6H2O]為原料,經溶膠、凝膠、陳化、乾燥等過程,並在1300℃下煅燒得到純的Ca-Mg-Si陶瓷粉體。
實驗採用KrF雷射器(波長248nm，脈衝寬度20ns)。雷射器頻率5-10Hz，靜電紡絲纖維膜與緻密陶瓷塊體靶材之間的距離為5-10cm，雷射束與靶材表面成30-60度角。為提高沉積薄膜的均勻性以及防止靶材被擊穿，沉積過程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋轉，採用分子泵對沉積室抽真空到20MPa，使用機械泵控制其壓強。本試驗主要通過調控沉積溫度(室溫10-50℃範圍)、氣氛壓強(10-50MPa)、靶基距(5-10cm)以及沉積時間(5-40分鐘)來控制塗層的厚度、結晶度及晶粒大小。由此製得表面塗覆有納米生物活性玻璃的無紡結構纖維膜(NW-NBG)以及表面塗覆有納米生物活性玻璃的圖案化纖維膜(PT-NBG)。
所獲得的塗層通過廣角X-射線衍射(XRD)、掃描電鏡(SEM)及能譜分析(EDS)等對塗層材料的物相組成、表面微觀結構進行分析與表徵，並對該新型皮膚組織工程支架材料的體內促創面癒合能力進行系統的研究。
本發明採用脈衝雷射技術(PLD)在圖案化電紡纖維膜表面製備具有結構穩定的生物活性玻璃塗層，提高了圖案化纖維膜表面的生物活性。通過脈衝雷射沉積方法製備了納米生 物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜，具有工藝比較簡單，條件易於控制等優點。而含納米生物玻璃的圖案化電紡纖維膜用作創面修復材料具有良好的生物活性、促創面癒合等多功能特性。因此，本發明製備的納米生物塗敷的圖案化電紡纖維膜具有很強的實用意義，是一種新型的具有生物活性的創面修復材料。
本發明還提供由該納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜所製備的醫療產品及其用途，所述醫療產品是皮膚組織工程支架。
本發明的納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜及其醫療產品可用於創面修復。
下面進一步例舉實施例以詳細說明本發明。同樣應理解，以下實施例只用於對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，本領域的技術人員根據本發明的上述內容作出的一些非本質的改進和調整均屬於本發明的保護範圍。下述示例具體的工藝參數等也僅是合適範圍中的一個示例，即本領域技術人員可以通過本文的說明做合適的範圍內選擇，而並非要限定於下文示例的具體數值。
實例1：納米生物玻璃塗敷的圖案化電紡纖維膜的製備
實驗採用具有編織結構的導電模板作為靜電紡絲收集器，將聚己內酯/聚乳酸(1/1,w/w)溶於DMF/THF(4/1,v/v)中配得電紡溶液(4.8％,w/v)，電紡過程中電壓為10kv，收集距離為12cm，電紡流量為0.02ml/min，收集時間為30min，製得具有正方形編織結構(邊長為300μm)的圖案化電紡纖維膜。實驗採用KrF雷射器(波長248nm,脈衝寬度20ns)。雷射器頻率5Hz，圖案化纖維膜與陶瓷靶材之間的距離為5.5cm，雷射束與靶材表面成45度角。為提高沉積薄膜的均勻性以及防止靶材被擊穿，沉積過程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋轉，採用分子泵對沉積室抽真空到20MPa，使用機械泵控制其壓強。本試驗主要通過調控沉積溫度(室溫)、氣氛壓強(20MPa)、靶基距(5.5cm)以及沉積時間(40分鐘)來控制塗層的厚度、結晶度及晶粒大小。
實例1-2檢測所得塗層的效果
所獲得的塗層通過廣角X-射線衍射(XRD)、掃描電鏡(SEM)及能譜分析(EDS)等對塗層材料的物相組成、表面微觀結構進行分析與表徵。圖1為無塗層的圖案化電紡纖維膜(PT)、生物玻璃塗覆的無紡纖維膜(NW-NBG)以及生物玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)的SEM圖，其中，圖案結構為微米級別(100～800μm)，纖維結構為納米級別(500～1000nm)，生物活性玻璃顆粒為納米級別(約為30nm)。在圖1中，圖1A為生物玻璃塗覆的無紡纖維膜(NW)，圖1a為圖1A中的單根纖維的形貌圖，圖1a』為圖1a中單根纖維表面形貌的進一步放大細節圖。圖1B為無塗層的圖案化電紡纖維膜(PT)，圖1b為圖1B中的單根 纖維的形貌圖，圖1b』為圖1b中單根纖維表面形貌的進一步放大細節圖。圖1C為生物玻璃塗覆的正方型微圖案結構的纖維膜(PT-NBG)，圖1c為圖1C中的單根纖維的形貌圖，圖1c』為圖1c中單根纖維表面形貌的進一步放大細節圖。圖1D為生物玻璃塗覆的圓型微圖案結構的纖維膜。圖1E為生物玻璃塗覆的條紋狀微圖案結構的纖維膜。圖1F為生物玻璃塗覆的菱形微圖案結構的纖維膜。圖2A為無塗層圖案化纖維膜的EDS圖，圖2B為生物活性玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)的EDS圖，圖2C為生物活性玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)及無塗層圖案化纖維膜的XRD圖，圖2D為生物活性玻璃塗覆的圖案化纖維膜(PT-NBG)及無塗層圖案化纖維膜的WCA圖。EDS結果顯示與塗層前相比，塗層後的圖案化纖維膜表面具有明顯的Ca、Mg、Si等元素峰，但XRD結果顯示塗層前後複合纖維膜的晶型未發生變化，均為無定形結構，即圖案化纖維膜表面的納米顆粒為生物玻璃形態。表面潤溼性檢測結果顯示，塗層後的纖維膜表面的親水性得到了極大的提高，均為0°。
實例2研究創面修復材料中多級微納米圖案結構以及納米生物活性玻璃對小鼠體內的創面修復速率以及質量的影響及其相關機理
2.1實驗鼠體內全皮層創傷修復重建實驗
40隻18g的雄性BALB/c實驗鼠(國家嚙齒類實驗動物資源中心，中國上海分公司)，利用麻醉呼吸機將小鼠麻醉後，將老鼠背部區域的毛髮去除後，建立一個完整的厚度傷口(直徑為8mm)。將創面修復材料分別植入小鼠創傷區域，它們分別是：(1)無植入材料(Control)；(2)無紡結構纖維膜(NW)；(3)表面塗覆有納米生物活性玻璃的無紡結構纖維膜(NW-NBG)；(4)圖案化纖維膜(PT)；(5)表面塗覆有納米生物活性玻璃的圖案化纖維膜(PT-NBG)，每組8隻老鼠。在植入前，支架材料分別用75％的究竟進行浸泡消毒滅菌30min，之後在PBS溶液中清洗兩遍。植入後老鼠背部創傷區域用醫用膠帶固定。手術後，老鼠被分別關在無菌環境下的裝有充足水以及食物的籠子中。利用數位相機在固定的時間點(1，3，5，7，9，11天)、固定的距離以及角度記錄創傷區域的變化情況，並對其面積進行計算；
面積收縮率(％)＝[A0-At]/A0×100％
其中A0和At分別是原始的創傷區域面積以及在固定的時間點「t」時的創傷面積；
另外，每組其中4隻老鼠在3天和7天的時候被處死，取出創傷區域周圍的組織標本(2mm左右)進行組織分析。
圖3為將不同類型的創面修復材料植入實驗鼠背部創傷區域隨著時間的變化情況。相對於空白對照組(control)以及塗層前後的無紡纖維膜(NW和NW-NBG)，圖案化膜(PT) 以及塗層後的圖案化纖維膜(PT-NBG)能夠明顯提高傷口的癒合速度。
2.2創傷區域組織形態定量分析
將取得的組織標本用4％的多聚甲醛固定至少12h後，利用分級醇以及二甲苯脫水後，進行石蠟包埋，利用RM2155切片機切取5μm厚切片，採用蘇木精和曙紅對組織樣本進行常規組織染色固定。Masson三色染色用作觀察創傷組織處膠原網絡的形成情況。採用奧林巴斯倒置顯微鏡觀察創傷區域情況，Image Pro Plus version 6.0(Media Cybernetics,Rockville,MD,USA)進行拍照，其中藍綠色表示膠原纖維，並且通過計算像素點來統計膠原纖維的形成情況。
圖4為3天以及7天後經過不同創面修復材料處理後的創傷區域組織的組織染色觀察情況。結果顯示，相對於空白對照組(Control)以及植入圖案化纖維膜組(PT)，表面塗覆有納米生物活性玻璃的圖案化纖維膜(PT-NBG)能夠明顯促進皮膚組織的形成。圖6中的圖A和B為7天後經過不同創面修復材料處理後的創傷區域組織的Masson’s三色染色情況，其中藍色代表膠原纖維，結果顯示PT-NBG同樣能夠促進膠原纖維的沉積，並且創傷處膠原纖維的排列更為規整。
2.3免疫組織螢光染色分析
將同樣切片後的組織標本(5μm)在檸檬酸鈉緩衝溶液中浸泡20min後，冷卻至室溫至少一個小時，然後在4℃下進行一抗(rabbit polyclonal to CD31antibody(Abcam))孵化過夜。之後，將其浸泡在PBS中清洗，在室溫下進行兩個小時的二抗孵化過程。最後，將4』,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)添加到樣品中(避光)。利用螢光顯微鏡(Leica Confocal microscope)進行觀察分析。
圖5中的圖A和B分別為3天以及7天後經過不同創面修復材料處理後的創傷區域組織的組織螢光染色(CD31)觀察情況。結果顯示PT-NBG能夠促進CD31的表達，即創傷處血管的新生。
2.4Real Time-PCR檢測細胞樣本
主要檢測成血管化基因(VEGF)。簡要步驟如下：樣本處理；細胞樣品Total RNA的抽提；用逆轉錄酶Reverse Transcriptase M-MLV(D2640A,Takara)進行逆轉錄合成cDNA；Real time PCR擴增體系和反應條件；數據分析。
圖5中的圖D為內皮生長因子(VEGF)的表達情況。結果顯示PT-NBG能夠促進VEGF的高表達。
2.5Western blotting進行膠原蛋白表達分析
將創傷區域組織浸泡在含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA緩衝溶液中，通過二辛可寧酸法(Bicinchoninic acid assay(Thermo Scientific))進行蛋白濃度測定，然後將樣本煮10min用於蛋白變形。所有的樣本被用來製備10％SDS-PAGE凝膠並且轉化為聚乙二烯二氟化物膜(Gibco)，然後利用5％的牛奶進行封閉1h。對其在4℃下進行特定的抗體如COL 1 A2 and COL 3 A1 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA),β-actin(Sigma)孵化過夜。最後通過Odyssey Western blotting detection system進行可視信號檢測。
圖6中的圖C為利用Western blotting對COL 1(I型膠原)和COL 3(III型膠原)進行表達分析。結果表面PT-NBG以及PT組均能夠很好地促進膠原蛋白的表達。