一種豬冷凍精液保藏方法

2023-07-29 18:35:46

一種豬冷凍精液保藏方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬冷凍精液保藏方法，屬於動物生產繁殖學領域，該方法將採集精液稀釋後降溫到17℃，等溫下加入冷卻保護液稀釋，進一步降溫到4~5℃，再加入冷凍保護液進封裝冷藏；根據冷凍曲線降溫恆定到-120℃後，儲藏在液氮罐中。本發明的方法，豬用冷凍精液需在無菌的環境下操作，每一步都需嚴格控制，嚴防出錯，否則會影響最終結果。每一環節和參數都是經過大量試驗進行校正和優化。本方法製作的冷凍精液合格率達100%，即冷凍精液解凍後精子活力在0.3以上。
【專利說明】一種豬冷凍精液保藏方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物生產和繁殖領域，具體地說涉及一種豬冷凍精液保藏方法。

【背景技術】
[0002] 人工授精技術是動物繁殖中提高雄性動物繁殖力的一個關鍵技術。豬人工授精技 術中的常用精液為常溫保存的液態精液，其保存時間3-5天，最多不超過10天；如能應用冷 凍技術，那公豬的利用力則能大幅度提高。目前，在牛上，特別是奶牛上，冷凍技術的研究和 應用非常成熟和普遍，並有專門的國家標準，如《牛冷凍精液》（GB4143-2008)、《牛冷凍精液 生產技術規程》（NY/T1234-2006)。豬和牛繁殖生理的不同，如精液量、精子密度、精液成分 等，導致冷凍技術在兩者上應用面的差異。目前，豬冷凍精液技術，缺乏統一的國家標準或 行業標準，尚處於研究階段，其製作工藝流程還處在摸索階段，大多研究主要集中在稀釋液 成分、甘油濃度、稀釋方法、劑量等方面。


【發明內容】

[0003] 發明目的：本發明的目的是提供一種對豬新鮮精液進行稀釋、抗冷處理、篩選並分 裝冷凍的保藏方法，以獲得100%精液合格率，高精子活力的凍精產品。
[0004] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明的一種豬冷凍精液保藏方法，包括如下 步驟：對採集精液稀釋後降溫到17°c，測量精子密度，離心後測量上清液精子密度，等溫下 加入冷卻保護液稀釋，稀釋液計算公式為式（I)所示：
[0005] 稀釋液總量=(稀釋後精子密度-上清液精子密度）X體積/7億 （I)，
[0006] 進一步降溫到4?5°C，再加入冷凍保護液進封裝冷藏；根據冷凍曲線降溫恆定 到-120°C後，儲藏在液氮罐中；所述冷凍曲線的過程是：從4?5°C以2°C /min的降溫速度 降溫至_5°C，再以60°C /min降溫速度降溫至-140°C，然後回到_120°C維持lOmin。
[0007] 採集精液的稀釋步驟為：取IOOOml無菌雙蒸水水浴鍋中加熱至30?38°C，再加 入原精稀釋液粉
[0008] 溶解獲得原精稀釋液，穩定1小時待用；採集精液、原精稀釋液按1 : 0. 5的比例 等溫稀釋，放入17°C冰箱中平衡40分鐘。
[0009] 稀釋後精液降溫到17°C後立即進行離心，17°C等溫環境下，800g離心12. 5min，並 吸除上清液。
[0010] 加冷卻保護液稀釋後的體積為最終體積的一半，加完稀釋液後，於4°C環境下降溫 平衡，Ih後水杯中加冰塊或周圍加冰袋促使其快速降溫至4-5°C ;0. 5h後等量等溫加入冷 凍保護液，加入後平衡45分鐘裝管。
[0011] 封裝時利用細管容納冷藏精液，水平放置，封口後將管內氣泡晃動到管中央。
[0012] 冷凍採用將容納有冷凍精液的細管置於液氮上方的方式，通過控制與液氮液面的 距離，在-80°c?-120°c之間調節，Smin後投入液氮獲得凍精。
[0013] 有益效果：本發明所述方法中，豬用冷凍精液需在無菌的環境下操作，每一步都需 嚴格控制，嚴防出錯，否則會影響最終結果。本工藝中的每一環節和參數都是經過大量試驗 進行校正和優化。本工藝製作的冷凍精液合格率達100%，即冷凍精液解凍後精子活力在 0. 3以上。

【具體實施方式】
[0014] 實施例1
[0015] (一）準備工作：
[0016] 原精稀釋液：取IOOOml無菌雙蒸水置30?38°C水浴鍋中調至30?38°C，溶解原 精稀釋液粉47g，然後穩定1小時待用。原精稀釋液粉來自Minitube公司下的產品Androhep PRO Plus Extender，產品批號 13533/3009 ;
[0017] 冷卻保護液：用400ml30?38°C雙蒸水溶解44g藥品A ;使用時，加入IOOg新鮮蛋 黃，用磁力攪拌器攪拌30min ;然後冷卻到17°C備用。
[0018] 冷凍保護液：用370ml32?38°C雙蒸水溶解40. 7g藥品B。使用時，加入IOOg新 鮮蛋黃，加入30ml甘油，用磁力攪拌器攪拌30min。然後冷卻到5°C備用。或取冷卻保護液 185ml加入15ml甘油，用磁力攪拌器攪拌30min。然後冷卻到5°C備用。
[0019] 配製冷卻保護液中藥品A的和冷凍保護液中的藥品B來自Minitube公司下產品 Androhep CryoGuard Cooling&Freezing Extender，產品批號 13533/2006。
[0020] (二）具體操作：
[0021] 步驟1 :精液採集和處理
[0022] 精液採集：按規範操作。注意各個體間不要混雜。多個體使用同一集精杯時，用完 後要先用蒸餾水衝洗再用38°C生理鹽水衝洗乾淨。或在集精杯中套入一保鮮袋，每頭豬換 一個。
[0023] 原精液稀釋：採集精液、原精稀釋液按1 : 0. 5的比例等溫（一般30_35°C，根據 不同季節採集到的原精溫度而定）稀釋。放入17°C冰箱中平衡40分鐘。
[0024] 測量精子密度：按計數板法或密度測定儀法測定稀釋後的精子密度。
[0025] 步驟2:離心處理
[0026] 原精稀釋後40分鐘左右，溫度降到17°C後立即進行離心。用50或IOOml離心管 在17°C環境下，800g離心12. 5min，吸去上清液。並測量上清液精子密度。（注意：離心機 要提前預冷至17°C。）
[0027] 步驟3:加冷卻保護液
[0028] 用加冷卻保護液等溫稀釋，稀釋後的體積為最終體積的一半。加完稀釋液後，用水 杯盛適量的17°C水，把稀釋管放入後送4°C低溫櫃內降溫平衡，Ih後水杯中加冰塊或周圍 加冰袋促使其快速降溫至4_5°C (0. 5h後進行下一步）。
[0029] 稀釋液計算公式為式（I)所示：
[0030] 稀釋液總量=(稀釋後精子密度-上清液精子密度）X體積/7億 （I)，
[0031] 步驟4 :加冷卻保護液II
[0032] 等量等溫加入冷凍保護液，加入後平衡45分鐘裝管。（注意：這時在水杯加大量 的4_5°C水，以便防止在加冷卻保護液II和下面的分裝過程中溫度變化。）
[0033] 步驟5:裝管和封口
[0034] 在4_5°C的冷藏室或平衡櫃中進行裝管和封口，封口後將管內氣泡晃動到管的中 央。
[0035] 步驟6 :冷凍
[0036] 利用Minitube全自動冷凍儀設置冷凍曲線：從4?5°C以2°C /min的降溫速度降 溫至-5°C，再以60°C /min降溫速度降溫至-140°C，然後回到_120°C維持lOmin。程序凍精 完成後將凍精管迅速取出並迅速投入到裝有液氮的泡沫盒中。後裝入紗布袋中快速放入液 氣罐中。
[0037] 利用大口徑液氮罐冷凍，應符合GB/T5458的規定。冷凍採用將容納有冷凍精液的 細管置於液氮上方的方式，通過控制與液氮液面的距離，在_80°C?_120°C之間調節，Smin 後投入液氮獲得凍精。
[0038] 實施例2
[0039] 將實施例1獲得的凍精進行解凍，解凍採取溼解法解，即先將60ml解凍液加入試 管，26°C水浴預熱，然後1-2支凍精放入38°C水中，30秒鐘後取出，用吸水紙或紗布擦乾水 珠，再用細管剪剪去封口端後注入試管中（26°C)，然後用26°C解凍液I : 1稀釋，3?4秒 後再緩慢加入更多的解凍液，邊加變搖晃。獲得解凍後精液。鏡檢精子活率，達0.3以上者 包裝。批量生產。隨機抽查不合格，則全部棄之。
[0040] 實施例3
[0041] 本發明的方法就工藝參數進行優化，獲得最優效果。
[0042] 試驗動物：國家級小梅山豬保種場的12頭成年、體質健康、性慾旺盛、採精頻率正 常的公豬（大約克豬2頭、巴克夏豬2頭、梅山豬4頭、楓涇豬4頭）。
[0043] 試驗設計：依據預實驗結果選擇稀釋比例在1 : 0.5?1 : 1.5下進行的實驗，在 此範圍內進行分組稀釋，研究冷凍後精子活力的大小。將採集來的精液測量其活力和密度 然後將其分成5份每份精液6mL，並按照每份理論密度一次是2. 4億/mL、2億/mL、1. 6億/ mL、l. 2億/mL、0. 8億/mL的順序稀釋精液。並測量每份密度的活力和密度，然後進行豬精 冷凍試驗，冷凍後分別解凍，測量每份精液的密度和活力，並在室溫下兩小時後再次側量它 們的活力和密度並記錄以上數據進行分析。
[0044] 試驗方法如本發明實施例1所述。
[0045] 試驗結果：隨著稀釋倍數的增大，解凍後精子的活力也有所增大的。解凍兩小時後 的精子活力也有所增大，當稀釋密度處於〇. 8億/mL?1. 6億/mL時顯示的解凍後精子活 力比較高。建議進行精液冷凍前將精液稀釋至〇. 8億/mL?1. 6億/mL，對解凍後精子的活 力會比較高。
[0046] 實施例4
[0047] 本試驗是針對2中稀釋劑證明本發明採用的稀釋劑應用於冷凍精液上可獲得更 商活力和質量的精子。
[0048] 試驗動物：楓涇種公豬五頭。公豬3-5歲、體重IOOkg左右、體質健康，強壯，性慾 旺盛。
[0049] 試驗設計：2種稀釋液 [0050] 表1 :精液稀釋液的製作
[0051]

【權利要求】
1. 一種豬冷凍精液保藏方法，其特徵在於包括如下步驟： 對採集精液稀釋後降溫到17°c，測量精子密度，離心後測量上清液精子密度，等溫下加 入冷卻保護液稀釋，稀釋液計算公式為式（I)所示： 稀釋液總量=(稀釋後精子密度一上清液精子密度）X體積/7億 (I)， 進一步降溫到4~5°C，再加入冷凍保護液進封裝冷藏；根據冷凍曲線降溫恆定 到-120°C後，儲藏在液氮罐中； 所述冷凍曲線的過程是：從4~5°C以2°C /min的降溫速度降溫至-5°C，再以60°C /min 降溫速度降溫至_140°C，然後回到_120°C維持lOmin。
2. 根據權利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特徵在於：採集精液的稀釋步 驟為： 取1000ml無菌雙蒸水水浴鍋中加熱至3(T38°C，再加入原精稀釋液粉溶解獲得原精稀 釋液，穩定1小時待用；採集精液、原精稀釋液按1 :〇. 5的比例等溫稀釋，放入17°C冰箱中 平衡40分鐘。
3. 根據權利要求1或2所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特徵在於：將稀釋後精液 降溫到17°C後立即進行離心，17°C等溫環境下，800g離心12. 5min，並吸除上清液。
4. 根據權利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特徵在於：加冷卻保護液稀釋 後的體積為最終體積的一半，加完稀釋液後，於4°C環境下降溫平衡，lh後水杯中加冰塊或 周圍加冰袋促使其快速降溫至4-5°C ;0. 5h後等量等溫加入冷凍保護液，加入後平衡45分 鍾裝管。
5. 根據根據權利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特徵在於：封裝時利用細 管容納冷藏精液，水平放置，封口後將管內氣泡晃動到管中央。
6. 根據根據權利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特徵在於：冷凍採用將容 納有冷凍精液的細管置於液氮上方的方式，通過控制與液氮液面的距離，在_8〇°C ~-120°C 之間調節，8min後投入液氮獲得凍精。
【文檔編號】A01N1/02GK104255704SQ201410526704
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月8日 優先權日:2014年10月8日
【發明者】吳井生, 楊劍波, 肖安磊, 邢軍 申請人:江蘇農林職業技術學院