伯醇的氧化和胺化的製作方法

2023-07-29 07:12:26 2

本發明申請是pct專利申請pct/ep2012/063994，國際申請日為2012年07月17日、發明名稱為「伯醇的氧化和胺化」的發明專利申請的分案申請，母案進入中國的申請號為201280045779.8。本發明涉及包括下述步驟的方法：a)提供下式的伯醇ho-(ch2)x-r1,其中r1選自–oh、-sh、-nh2和–coor2，x是至少3且r2選自h、烷基和芳基，b)通過與nad(p)+依賴性的醇脫氫酶接觸氧化所述伯醇，和c)使步驟a)的氧化產物與轉氨酶接觸，其中所述nad(p)+依賴性的醇脫氫酶和/或所述轉氨酶是重組的或分離的酶，涉及用於施行所述方法的全細胞催化劑，和涉及這樣的全細胞催化劑用於氧化伯醇的用途。
背景技術：
：聚醯胺是以重複的醯胺基為特徵的一類聚合物。與化學上有關的蛋白不同，術語「聚醯胺」通常涉及合成的、商購可得的熱塑性塑料。聚醯胺衍生自伯胺或仲胺，其通常在烴裂解中得到。但是，也可以使用衍生物，更精確地講，氨基羧酸、內醯胺和二胺，用於聚合物的生產。另外，短鏈氣態烷烴作為原料是令人感興趣的，其可以用生物技術方法從再生原料起始得到。許多在商業上具有巨大需求的聚醯胺是從內醯胺起始製備。例如，「聚醯胺6」可以通過聚合ε-己內醯胺得到，而「聚醯胺12」可以通過聚合月桂內醯胺得到。其它商業上感興趣的產物包括內醯胺的共聚物，例如ε-己內醯胺和月桂內醯胺的共聚物。胺類的常規化學工業生產依賴於化石原料的供給，是低效的，且在該過程中產生大量不希望的副產物，在某些合成步驟中最高達80%。這樣的方法的一個例子是月桂內醯胺的製備，其通常通過丁二烯的三聚化而得到。氫化該三聚化產物環十二碳三烯，並將由此產生的環十二烷氧化成環癸酮，其隨後與羥胺反應生成環十二烷酮肟（cyclododecanonoxin），其最後經由貝克曼重排轉化成月桂內醯胺。考慮到這些缺點，已經開發了使用生物催化劑從再生原料起始製備胺的方法。pct/ep2008/067447描述了使用細胞生產化學相關產物，更精確地講ω-氨基羧酸的生物體系，所述細胞具有一系列合適的酶活性且能夠將羧酸轉化成相應的ω-氨基。但是，在該方法中使用的得自惡臭假單胞菌（pseudomonasputida）gpo1的alkbgt-氧化酶體系的一個已知缺點是，它不能提供使脂族烷烴生成伯醇的選擇性氧化。相反，產生多種氧化產物；尤其是，更高度氧化的產物（諸如相應的醛、酮或相應的羧酸）的比例隨著反應時間增加而增加(c.grant,j.m.woodley和f.baganz(2011),enzymeandmicrobialtechnology48,480-486)，這相應地降低了期望的胺的收率。技術實現要素：在該背景下，本發明的目的在於，提供使用生物催化劑氧化醇的改進方法。另一個目的是，如下改進所述方法，即增加收率和/或降低副產物濃度。最後，需要這樣的方法，即其允許基於再生原料來生產聚醯胺或用於生產聚醯胺的原材料。所述目的和其它目的通過本申請的主題和通過獨立權利要求的主題得以實現，其中由從屬權利要求得出實施方案。根據本發明，所述目的在第一方面由包括下述步驟的方法實現：a)提供下式的伯醇ho-(ch2)x-r1,其中r1選自–oh、-sh、-nh2和–coor2，x是至少3且r2選自h、烷基和芳基，b)通過與nad(p)+依賴性的醇脫氫酶接觸氧化所述伯醇，和c)使步驟a)的氧化產物與轉氨酶接觸，其中所述nad(p)+-醇脫氫酶和/或所述轉氨酶是重組的或分離的酶。在所述第一方面的第一實施方案中，步驟a)通過下式的鏈烷h-(ch2)x-r1通過單加氧酶的羥基化進行，所述單加氧酶優選是重組的或分離的。在所述第一方面的第二實施方案（其也是第一實施方案的一個實施方案）中，所述nad(p)+依賴性的醇脫氫酶是具有至少一個鋅原子作為輔因子的nad(p)+依賴性的醇脫氫酶。在所述第一方面的第三實施方案（其是第二實施方案的一個實施方案）中，所述醇脫氫酶是得自嗜熱脂肪芽孢桿菌（bacillusstearothermophilus）的醇脫氫酶(資料庫代碼p42328)或其變體。在所述第一方面的第四實施方案（其是第一至第三實施方案的一個實施方案）中，所述單加氧酶選自：惡臭假單胞菌的alkbgt，得自熱帶假絲酵母（candidatropicalis）或得自鷹嘴豆（cicerarietinum）的細胞色素p450。在所述第一方面的第五實施方案（其也是第一至第四實施方案的一個實施方案）中，所述轉氨酶選自特徵如下的轉氨酶及其變體：在與青紫色素桿菌（chromobacteriumviolaceum）atcc12472的轉氨酶(資料庫代碼np_901695)的val224對應的胺基酸序列的位置處，其具有選自異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的胺基酸，且在與青紫色素桿菌atcc12472的轉氨酶(資料庫代碼np_901695)的gly230對應的胺基酸序列的位置處，其具有除了蘇氨酸以外的胺基酸，且優選選自絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的胺基酸。在所述第一方面的第六實施方案（其也是第一至第五實施方案的一個實施方案）中，在分離的或重組的丙氨酸脫氫酶和無機氮源存在下進行步驟b)和/或步驟c)。在所述第一方面的第七實施方案（其也是第一至第七實施方案的一個實施方案）中，在包含nad(p)+依賴性的醇脫氫酶、轉氨酶、單加氧酶和丙氨酸脫氫酶的組中的至少一種酶是重組的，且以具有相應酶的全細胞催化劑的形式提供。在所述第一方面的第八實施方案（其也是第七實施方案的一個實施方案）中，所有酶以一種或多種全細胞催化劑的形式提供，其中，優選地，一種全細胞催化劑具有所有必需的酶。在所述第一方面的第九實施方案（其也是第一至第八實施方案的一個實施方案）中，在步驟b)時，優選在步驟b)和c)時，存在有機共溶劑，其具有大於-1.38、優選0至1.2的logp。在所述第一方面的第十實施方案（其也是第九實施方案的一個實施方案）中，所述共溶劑選自不飽和脂肪酸，優選油酸。在所述第四方面的第十一實施方案（其也是第九實施方案的一個優選實施方案）中，所述共溶劑是式r3-o–(ch2)x–o–r4的化合物，其中r3和r4各自且彼此獨立地選自：甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中特別優選r3和r4各自是甲基且x是2。在所述第一方面的第十二實施方案（其也是第九實施方案的一個優選實施方案）中，所述共溶劑選自二烷基醚，並且優選二甲醚。根據本發明，所述目的在第二方面中通過全細胞催化劑得以實現，所述全細胞催化劑具有nad(p)+依賴性的醇脫氫酶（優選地，具有至少一個鋅原子作為輔因子）、轉氨酶、任選的單加氧酶和任選的丙氨酸脫氫酶，其中所述酶是重組酶。根據本發明，所述目的在第三方面中通過根據本發明的第二方面的全細胞催化劑用於氧化和胺化式(ho)-(ch2)x-r1的伯醇的用途得以實現，其中r1選自-oh、-sh、-nh2和-coor2，x是至少3，且r2選自h、烷基和芳基。在第三方面的第一實施方案（其是第一實施方案的一個實施方案）中，所述用途進一步包括有機共溶劑的存在，所述有機共溶劑具有大於-1.38、優選0至1.2的logp，且優選地為二甲醚。在第三方面的第二實施方案（其是第二實施方案的一個實施方案）中，所述共溶劑選自不飽和脂肪酸，且優選地是油酸。所述第二和第三方面的其它實施方案包括本發明的第一方面的所有實施方案。本發明的發明人已經驚訝地發現，存在一組醇脫氫酶，其可以用於實現形成少量副產物伯醇的氧化。本發明的發明人此外已驚訝地發現，存在可以使用生物催化劑將醇胺化而不形成大量副產物的酶活性級聯，其中不必添加或除去還原當量。本發明的發明人此外已驚訝地發現了可以令人驚訝地使用全細胞催化劑並從再生原料出發生產聚醯胺的方法。本發明的發明人此外已驚訝地發現，事先氧化後的伯醇的胺化可以特別有利地用以某些序列特性為特徵的轉氨酶集合來進行。本發明的發明人此外已驚訝地發現，在包含醇脫氫酶、轉氨酶和丙氨酸脫氫酶的氧化和胺化伯醇的體系中使用不同於alkj類型的醇脫氫酶，尤其是使用nad(p)+-依賴性醇脫氫酶對該方法的產率是有利的，尤其是在使用全細胞催化劑進行時。根據本發明的方法可以應用於大量的工業相關的醇。在一個優選的實施方案中，其涉及可氧化和胺化成ω-氨基羧酸的ω-羥基羧酸或酯，優選甲酯。在另一實施方案中，其涉及可氧化和胺化成二胺的二醇。在另一個優選的實施方案中，所述伯醇是羥基烷基胺。在此，碳鏈的長度是可變的，並且x為至少3。所述碳鏈優選具有多於3個的c-原子，即x=4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。示例性化合物包括ω-羥基月桂酸、ω-羥基月桂酸甲酯，和鏈烷二醇，尤其是1,8-辛二醇和1,10-癸二醇。在一個特別優選的實施方案中，r1選自–oh和-coor2，x是至少11，且r2選自h、甲基、乙基和丙基。在一個最優選的實施方案中，所述伯醇是ω-羥基脂肪酸甲酯。根據本發明，在所述方法的步驟b)中，使用nad(p)+依賴性的醇脫氫酶用於氧化伯醇。在該情況下，與根據本發明使用的所有的酶活性多肽一樣，其可以是包含酶活性多肽的細胞或其裂解物、或處於所有純化階段（從粗製的裂解物至純的多肽）的多肽的製品。本領域技術人員已知大量可以在合適的細胞中過表達酶活性多肽並進行純化和/或分離的方法。因而，為表達多肽，可以使用本領域技術人員可得到的所有表達體系。可以使用色譜方法用於純化，例如提供了標記的重組蛋白的親和色譜使用固定化的配體的純化，所述固定化的配體為例如在組氨酸標記的情況中鎳離子、在與靶蛋白融合的穀胱甘肽-s-轉移酶的情況中使用固定化的穀胱甘肽或在包含麥芽糖結合蛋白的標籤的情況中使用固定化的麥芽糖。可以以可溶形式或固定化地使用經純化的酶活性多肽。本領域技術人員已知可以將多肽共價地或非共價地固定至有機或無機固相上的合適方法，例如通過巰基偶聯化學(例如得自pierce的試劑盒)。在一個優選的實施方案中，所述用作全細胞催化劑或用作表達體系的細胞是原核細胞，優選細菌細胞。在另一個優選的實施方案中，其是哺乳動物細胞。在另一個優選的實施方案中，其是低等真核細胞，優選是酵母細胞。示例性的原核細胞包括埃希氏菌屬（escherichia），特別是大腸桿菌（escherichiacoli），和假單胞菌屬（pseudomonas）和棒狀桿菌屬（corynebacterium）的菌株。示例性的低等真核細胞包括酵母屬（saccharomyces）、假絲酵母屬（candida）、畢赤酵母屬（pichia）、耶氏酵母屬（yarrowia）、裂殖酵母（schizosaccharomyces）屬，特別是熱帶假絲酵母（candidatropicalis）、粟酒裂殖酵母（schizosaccharomycespombe）、巴斯德畢赤酵母（pichiapastoris）、解脂耶氏酵母（yarrowialipolytica）和釀酒酵母菌（saccharomycescerivisiae）菌株。在一個特別優選的實施方案中，所述醇脫氫酶是含鋅的nad(p)+依賴性的醇脫氫酶，即所述催化活性酶包含至少一個鋅原子作為輔因子，所述鋅原子通過包含半胱氨酸殘基的特徵序列基序與所述多肽共價結合。在一個特別優選的實施方案中，所述醇脫氫酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶(資料庫代碼p42328)或其變體。本發明的教導不僅可以使用本文描述的生物大分子的精確胺基酸序列或核酸序列來完成，而且也可以使用這樣的大分子的變體來完成，所述變體可以通過一個或多於一個胺基酸或核酸的缺失、添加或置換而得到。在一個優選的實施方案中，表述核酸序列或胺基酸序列的「變體」（其在下文中與本文中使用的表述「同源體」同義地和可互換地使用）是指另一個核酸-或胺基酸序列，考慮到相應的原始野生型-核酸-或-胺基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性（在這裡與同一性同義使用），其中，優選地，除了形成催化活性中心的那些胺基酸或者結構或摺疊必需的胺基酸以外的胺基酸被刪除或置換，或者後者僅僅是保守置換，例如穀氨酸替代天冬氨酸、或亮氨酸替代纈氨酸。現有技術描述了可以用於計算2個序列的同源性程度的算法，例如arthurlesk(2008),introductiontobioinformatics,第3版。在本發明的另一個優選的實施方案中，胺基酸序列或核酸序列的所述變體，優選地除了上述的序列同源性以外，基本上具有野生型分子或原始分子的相同的酶活性。例如，作為蛋白酶的酶活性多肽的變體具有與所述多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽鍵水解的能力。在一個特別的實施方案中，表述「基本上相同的酶活性」是指顯著高於背景活性或/和與相對於相同底物的野生型多肽所具有的km-和/或kcat-值相差小於3個、更優選2個、還更優選1個數量級的相對於野生型-多肽的底物的活性。在另一個優選的實施方案中，表述核酸序列或胺基酸序列的「變體」包含所述核酸-或胺基酸序列的至少一個活性部分/或片段。在另一個優選的實施方案中，本文中使用的表述「活性部分」是指這樣的胺基酸序列或核酸序列，其具有小於所述胺基酸序列的整個長度的長度，或者編碼比所述胺基酸序列的全長更短的長度，其中具有比野生型胺基酸序列更短長度的胺基酸序列或編碼的胺基酸序列基本上具有與所述野生型多肽或其變體相同的酶活性，例如作為醇脫氫酶、單加氧酶或轉氨酶。在一個特殊的實施方案中，表述核酸的「變體」是這樣的核酸，其互補鏈，優選地在嚴格的條件下，結合在野生型核酸上。雜交反應的嚴格性可由本領域技術人員容易地確定，並且通常取決於探針的長度、洗滌過程中的溫度和鹽濃度。通常，較長的探針需要較高的溫度才能雜交，而較短的探針需要低溫。雜交是否發生通常取決於變性dna與存在於其環境中的互補鏈對合的能力，更精確地講，在解鏈溫度以下。雜交反應的嚴格性和相應的條件更詳細地描述在ausubel等人，1995中。在一個優選的實施方案中，本文中使用的表述核酸的「變體」是編碼與原始核酸相同的胺基酸序列，或者在遺傳密碼的簡併性範圍內編碼該胺基酸序列的變體的任意的核酸序列。數十年來，醇脫氫酶是生物化學中與釀造發酵過程有關的受到強烈關注的且在生物技術上高度相關的生物化學酶類別，其包括多種異形體集合。因而，存在惡臭假單胞菌gpo1alkj型的膜結合的、黃素依賴性的醇脫氫酶，其使用黃素輔因子替代nad(p)+。另一組包括含鐵的、對氧敏感的醇脫氫酶，其在細菌中且以無活性形式在酵母中被發現。另一組包括nad(p)+依賴性的醇脫氫酶，包括含鋅的醇脫氫酶，其中活性中心具有半胱氨酸配位的鋅原子，所述鋅原子固定醇底物。在一個優選的實施方案中，將本文中使用的表述「醇脫氫酶」理解為是指將醛或酮氧化為相應的伯醇或伯醇的酶。優選地，在根據本發明的方法中的醇脫氫酶是nad(p)+依賴性的醇脫氫酶，即使用nad(p)+作為輔因子來氧化醇或使用nad(p)h來還原相應的醛或酮的醇脫氫酶。在最優選的實施方案中，所述醇脫氫酶是nad(p)+依賴性的、含鋅的醇脫氫酶。在一個優選的實施方案中，本文中使用的表述「nad(p)+依賴性的醇脫氫酶」表示nad+-和/或nadp+依賴性的醇脫氫酶。根據本發明，在步驟c)中，使用轉氨酶。在一個優選的實施方案中，本文中使用的表述「轉氨酶」理解為催化α-氨基從供體（優選胺基酸）向受體分子（優選α-酮羧酸）轉移的酶。在一個優選的實施方案中，所述轉氨酶選自具有以下特徵的轉氨酶及其變體：在與青紫色素桿菌（chromobacteriumviolaceum）atcc12472的轉氨酶(資料庫代碼np_901695)的val224對應的胺基酸序列的位置處，其具有選自異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的胺基酸，且在與青紫色素桿菌atcc12472的轉氨酶(資料庫代碼np_901695)的gly230對應的胺基酸序列的位置處，其具有除了蘇氨酸以外的胺基酸，且優選選自絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的胺基酸。在一個特別優選的實施方案中，所述轉氨酶選自：青紫色素桿菌dsm30191的ω-轉氨酶，源自惡臭假單胞菌w619、銅綠假單孢菌（pseudomonasaeruginosa）pa01、天藍色鏈黴菌（streptomycescoelicolor）a3(2)和除蟲鏈黴菌（streptomycesavermitilis）ma4680的轉氨酶。在一個優選的實施方案中，本文中使用的表述「與青紫色素桿菌atcc12472的轉氨酶的胺基酸序列的位置x對應的位置」是指，在所研究的分子的比對中，顯得與青紫色素桿菌atcc12472的轉氨酶的胺基酸序列的位置x同源的對應位置。本領域技術人員已知眾多可以用於進行胺基酸序列比對的軟體包和算法。示例性的軟體包方法包括由embl提供的程序包clustalw(larkinetal.,2007;goujonetal.2010)，或者列出和描述在arthurm.lesk(2008),introductiontobioinformatics,第3版中。根據本發明使用的酶優選地是重組酶。在一個優選的實施方案中，將本文中使用的表述「重組的」理解為相應的核酸分子在自然界中不存在，和/或它使用基因工程方法產生。在一個優選的實施方案中，當相應的多肽由重組核酸編碼時，提及重組蛋白。在一個優選的實施方案中，將本文中使用的重組細胞理解為具有至少一個重組核酸或重組多肽的細胞。本領域技術人員已知適合用於生產重組分子或細胞的方法，例如在sambrook等人,1989中描述的那些。根據本發明的教導可以使用分離的酶和使用全細胞催化劑來實行。在一個優選的實施方案中，將本文中使用的表述「全細胞催化劑」理解為提供所期望的酶活性的完整的、存活的且有代謝活性的細胞。所述全細胞催化劑可以將要代謝的底物（在本發明的情況中，醇）或由所述底物形成的氧化產物運輸進細胞內部，在此處被細胞溶質酶代謝，或者其可以將目標酶呈遞到它的表面上，在此處直接暴露給培養基中的底物。本領域技術人員已知眾多用於生產全細胞催化劑的體系，例如從de60216245中已知。就許多應用而言，推薦使用分離的酶。在一個優選的實施方案中，本文中使用的表述「分離的」是指，所述酶以比它的天然來源更純和/或更濃的形式存在。在一個優選的實施方案中，如果酶是多肽酶且佔相應製品的質量蛋白分數多於60、70、80、90或優選95%，則認為所述酶是分離的。本領域技術人員已知眾多用於測量溶液中的蛋白的質量的方法，例如藉助sds-聚丙烯醯胺凝膠上的對應蛋白帶的厚度的視覺估測、nmr光譜法或基於質量-光譜測定法的方法。根據本發明的方法的酶催化反應通常在溶劑或具有高的水比例的溶劑混合物中進行，優選地在用於建立與酶活性相容的ph-值的合適緩衝體系的存在下進行。但是，在疏水性原料的情況中，特別是在具有包含多於3個碳原子的碳鏈的醇中，有機共溶劑的額外存在是有利的，所述有機共溶劑可以介導酶與底物的接觸。一種或多於一種共溶劑以佔溶劑混合物或低於溶劑混合物的95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5體積%的總比例存在。共溶劑的疏水性在這裡起重要作用。它可以由logp表示，所述logp是正辛醇-水-分配係數的以10為底的對數。優選的共溶劑具有大於-1.38、更優選-1至+2、還更優選0至1.5的logp。正辛醇-水-分配係數kow或p是指示物質在1-辛醇和水的兩相體系中的濃度的比例的無量綱分配係數(參見j.sangster,octanol-waterpartitioncoefficients:fundamentalsandphysicalchemistry,wileyseriesinsolutionchemistry的第2卷,johnwiley&sons,chichester,1997)。更精確地講，kow或p表示物質在富含辛醇的相中的濃度與其在富含水的相中的濃度之比。kow值是物質的親脂性(脂溶性)和親水性(水溶性)之間的比例的模型指數（modellmaß）。預見到，使用物質在辛醇-水體系中的分配係數，也能夠估測該物質在具有水相的其它體系中的分配係數。如果物質可更好地溶於脂性溶劑諸如正辛醇中，那麼kow大於1，如果物質可更好地溶於水中，那麼kow小於1。相應地，親脂性物質的logp為正值，親水性物質的logp為負值。由於不能測量所有化學試劑的kow，因此存在非常多樣化的預測模型，例如通過定量構效關係(qsar)或通過線性自由能關係(lfer)，例如描述於eugenekelloggg,abrahamdj:hydrophobicity:islogp(o/w)morethanthesumofitsparts.eurjmedchem.2000年7-8月;35(7-8):651-61或gudrunwienke,「messungundvorausberechnungvonn-octanol/wasser-verteilungskoeffizienten」，博士論文,oldenburg大學,1-172,1993。在本申請範圍內，根據advancedchemistrydevelopmentinc.,toronto的方法，藉助程序模塊acd/logpdb確定logp。優選的共溶劑具有大於-1.38，更優選-1至+2，還更優選-0.75至1.5、或-0.5至0.5、或-0.4至0.4、或-0.3至-0.1的logp。在一個優選的實施方案中，所述共溶劑是式alk1-o-alk2的二烷基醚，其具有大於-1.38、更優選-1至+2、還更優選0至1.5的logp，其中所述2個烷基取代基alk1和alk2各自彼此獨立地選自甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基和叔丁基。在一個特別優選的實施方案中，所述共溶劑是甲基叔丁基醚(mtbe)。在最優選的實施方案中，所述共溶劑是二甲氧基乙烷(dme)。在另一優選的實施方案中，所述共溶劑是式r3-o-(ch2)x-o-r4的化合物，其中r3和r4各自且彼此獨立地選自甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中優選r3和r4各自是甲基且x是2。在另一個優選的實施方案中，所述共溶劑是羧酸或脂肪酸，優選具有至少6個碳原子的脂肪酸，更優選具有至少12個碳原子的脂肪酸。所述脂肪酸可以是飽和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸或山嵛酸，或不飽和脂肪酸，例如肉豆蔻腦酸、棕櫚油酸、巖芹酸、油酸、反油酸、異油酸、順-9-二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸或芥酸。不同脂肪酸的混合物同樣是可能的，例如主要含有不飽和脂肪酸的藍刺頭油。由於並非所有的脂肪酸在室溫時都是顯著可溶的，可能需要求助於其它措施，例如升高溫度，或者，更優選地，加入其它溶劑來使它可接近水相。在一個特別優選的實施方案中，使用脂肪酸或其酯、優選甲酯、最優選月桂酸甲酯作為這樣的其它溶劑。根據本發明的酶級聯可以根據本發明在有丙氨酸脫氫酶存在下進行。本發明的一個特別的長處是，該構型能夠實現還原當量中性的反應操作，即該反應在沒有供給或除去還原當量形式的電子的情況下進行，因為在醇氧化過程中由醇脫氫酶產生的nadh在製備丙氨酸時被消耗，消耗無機氮供體，優選氨或氨源。在一個優選的實施方案中，本文中使用的表述「丙氨酸脫氫酶」理解為這樣的酶：其催化l-丙氨酸的轉化，消耗水和nad+，形成丙酮酸、氨和nadh。優選地，所述丙氨酸脫氫酶是細胞內的丙氨酸脫氫酶，還更優選地，細菌全細胞催化劑的重組細胞內的丙氨酸脫氫酶。在一個優選的實施方案中，將具有所有需要的活性的全細胞催化劑用於根據本發明的方法中，即nad(p)+依賴性的醇脫氫酶、轉氨酶和任選的單加氧酶和/或丙氨酸脫氫酶。這樣的全細胞催化劑的應用具有以下優點：以單一試劑的形式使用所有活性，並且不必大規模地準備生物活性形式的酶。適合用於構建全細胞催化劑的方法是本領域技術人員已知的，尤其是用於表達一種或多種重組蛋白的質粒體系的構建，或編碼所需重組蛋白的dna向使用的宿主細胞的染色體dna中的整合。在先前的描述、權利要求書和附圖中公開的本發明的特徵單獨地和以任意組合以本發明不同實施方案用於實現本發明可能是重要的。附圖說明圖1顯示了包含不同轉氨酶、尤其是青紫色素桿菌atcc12472的轉氨酶(資料庫代碼np_901695,「tacv_co」)的示例性比對。在所有序列中，用下劃線標記與後者的轉氨酶的位置val224和gly230對應的胺基酸殘基。使用clustalw2進行所述比對。具體實施方式實施例1：使用根據本發明的方法，與醇脫氫酶alkj相比，使用nad+依賴性的醇脫氫酶的不同底物的胺化底物：使用的底物是環己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇(2)和乙基-6-羥基己酸酯(3)。酶：丙氨酸脫氫酶：在大腸桿菌中表達枯草芽孢桿菌的l-丙氨酸脫氫酶。首先，製備過夜培養物，然後將其用於接種主要培養物(lb-氨苄西林培養基)。將細胞在搖床上在30℃和120upm溫育24小時。然後，在無菌條件下加入iptg(0.5mm,異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷,sigma)進行誘導，並將培養物在20℃振搖另外24小時。將細胞離心出(8000upm,20min4℃)，洗滌，並拋棄上清液。然後使用超聲(1s脈衝,4s暫停，時間：10min,振幅:40%)破碎細胞，將混合物離心(20min,18000upm,4℃)，並使用his-prep柱純化酶。嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶(adh-ht;p42328.1))為了製備嗜熱脂肪芽孢桿菌的nad+依賴性的醇脫氫酶(fiorentinog,cannior,rossim,bartoluccis:decreasingthestabilityandchangingthesubstratespecificityofthebacillusstearothermophilusalcoholdehydrogenasebysingleaminoacidreplacements.proteineng1998,11:925-930)，首先製備過夜培養物(10mllb/氨苄西林培養基,氨苄西林100µg/ml,30℃,120upm)，然後將其用於接種培養容器，再將其在37℃和120upm振搖約12小時。將細胞離心出(8000upm,20分鐘,4℃)，洗滌，拋棄上清液，並將沉澱物凍幹。最後，使用超聲(1s脈衝，4s暫停，時間：10min，振幅：40%)破碎細胞，並將混合物離心(20min,18000upm,4℃)和用作粗提取物。藉助sds-page估測蛋白濃度。alkj-醇脫氫酶(得自食油假單胞菌（pseudomonasoleovirans）gpo1)：除了使用質粒ptze03_alkj(seqidno20)和使用卡那黴素作為抗生素(50µg/ml)以外，在與嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶相同的條件下製備該酶。同樣藉助sds-page估測蛋白濃度。得自青紫色素桿菌的轉氨酶cv-ωta：為了從青紫色素桿菌製備cv-ωta(u.kaulmann,k.smithies,m.e.b.smith,h.c.hailes,j.m.ward,enzymemicrob.technol.2007,41,628-637;b)m.s.humble,k.e.cassimjee,m.håkansson,y.r.kimbung,b.walse,v.abedi,h.-j.federsel,p.berglund,d.t.logan,febsjournal2012,279,779-792;c)d.koszelewski,m.göritzer,d.clay,b.seisser,w.kroutil,chemcatchem2010,2,73-77)，首先製備過夜培養物(lb/氨苄西林培養基,30℃,120rpm)，然後將其用於接種含有相同培養基的培養瓶，將其在37℃和120upm下振搖約3小時，直到達到在600nm為0.7的光密度。然後，加入iptg儲備溶液(0.5mm)，在20℃和120upm誘導3小時。將細胞離心出，拋棄上清液，並在4℃儲存細胞。最後，使用超聲(1s脈衝，4s暫停，時間：10min，振幅：40%)破碎細胞，將混合物離心(20min,18000upm,4℃)，並將上清液用作粗提取物。實驗操作：實驗溶液描述在表1中。表1:實驗溶液實驗溶液adh-ht(粗製物)200µl轉氨酶200µlaladh10µl(250u)l-丙氨酸22.3mg(250µmol)nad+0.5mg(0.75µmol)nh4cl21mg(500µmol)plp0.1mg(0.35µmol)naoh6m7.5µlh2o/共溶劑400µl底物50µmol最終ph8.5總體積1.22ml將底物溶解在適當量的共溶劑(見表2)中，並加入溶解在300µl水中的l-丙氨酸。在75µl水中，加入氯化銨。加入各自溶解在25µl水中的nad+和plp。通過加入7.5µl6mnaoh溶液，調節ph-值。加入轉氨酶和丙氨酸脫氫酶。通過加入醇脫氫酶，開始反應。22小時以後，通過加入下述的衍生化試劑，停止反應。胺的衍生化：將200µl三乙胺和esof(琥珀醯亞胺基氧基甲酸乙酯)(80或40mg)在乙腈(500µl)中的溶液加入到500µl樣品中。然後將樣品在45℃振搖1小時，然後用二氯甲烷萃取，經硫酸鈉乾燥，並使用gc-ms測量。如果不採用丙氨酸脫氫酶，則在ph8.5(通過加入naoh來調節)下向水溶液中加入l-丙氨酸(500mm)、nad+(2mm)和plp(0.5mm)和在dme中的底物(120µl,25mm)。通過加入各200µl的醇脫氫酶(nad+依賴性的)或alkj)和轉氨酶，開始反應。將樣品在25℃和300upm振搖24小時。將樣品如上所述進行處理，並用gc-ms進行分析。結果：表2:在不存在丙氨酸脫氫酶的情況下的胺化。底物是環己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇(2)和乙基-6-羥基己酸酯(3)。表3:在丙氨酸脫氫酶存在下的胺化。底物是環己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇(2)和乙基-6-羥基己酸酯(3)。總結：對於一系列在結構上不同的底物，即環己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇(2)和乙基-6-羥基己酸酯(3)，在每種情況下表明，與使用醇脫氫酶alkj相比，使用嗜熱脂肪芽孢桿菌的nad+依賴性的醇脫氫酶會顯著更有效地進行反應。此外，存在和不存在丙氨酸脫氫酶均可展現出相同的令人驚訝的技術效果。實施例2：不同醇底物的胺化為了證實根據本發明的酶體系能轉化結構各異的底物，使用合適的酶在體外將另外的鏈烷醇和鏈烷二醇轉化成相應的胺和二胺。已發現，得自馬肝的醇脫氫酶(hl-adh,e-同工酶;np_001075997.1)和得自嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶(adh-ht;p42328.1)同樣適合。使用兩種不同的氨基酶，即得自青紫色素桿菌[16](cv-ωta)的氨基酶和得自節桿菌（arthrobactercitreus）的(s)-選擇性ω-ta(ars-ωta)的變體(a.r.martin,r.disanto,i.plotnikov,s.kamat,d.shonnard,s.pannuri,biochem.eng.j.2007,37,246-255)。丙氨酸脫氫酶源自枯草桿菌（bacillussubtilis）(f.g.mutti,c.s.fuchs,d.pressnitz,j.h.sattler,w.kroutil,adv.synth.catal.2011,353,3227–3233)。用琥珀醯亞胺基氧基甲酸乙酯(i.edafiogho,k.r.scott,j.a.moore,v.a.famar,j.m.nicholson,j.med.chem.1991,34,387-392)衍生化產物並通過gc-ms使用agilentj&whp-5柱(30m,320μm,0.25μm)檢測。表4:伯醇的胺化[a]反應條件：底物(50mm),cv-ωta(1mg,0.2u)和adh-ht(1mg,0.25u),aladh(0.0.4mg,0.25u),plp(0.35mm),nad+(0.75mm),氯化銨(275mm),l-丙氨酸(250mm),ph8.5,24小時,20℃.[b]添加1,2-二甲氧基乙烷(10%vv-1)作為共溶劑。表5.1,ω-二醇的胺化[c][c]通用反應條件：底物(50mm),cv-ωta(1mg,0.25u)和adh-ht(1mg,0.2u),aladh(0.1mg,0.7u),plp(0.35mm),nad+(0.75mm),氯化銨(275mm),l-丙氨酸(250mm),ph8.5.[d]使用ars-ωta代替cv-ωta。序列表evonikdegussagmbh醇的氧化2011e00296de"=patentinversion3.5157prt人工序列序列部分1valvalalaalaargtrpleugluglulysileleugluileglyala151015asplysvalalaalaphevalglygluproileglnglyalaglygly202530valilevalproproalathrtyrtrpprogluilegluargilecys354045arglystyraspvalleuleuvalala5055257prt人工序列序列部分2alahiscysvalalagluleuglualaleuilegluarggluglyala151015aspthrilealaalapheileglygluproileleuglythrglygly202530ilevalproproproalaglytyrtrpglualaileglnthrvalleu354045asnlyshisaspileleuleuvalala5055357prt人工序列序列部分3glnhiscysalaasplysleugluglumetileleualagluglypro151015gluthrilealaalapheileglygluproileleuglythrglygly202530ilevalproproproalaglytyrtrpglulysileglnalavalleu354045lyslystyraspvalleuleuvalala5055457prt人工序列序列部分4aspaspleuvalglngluphegluaspargilegluserleuglypro151015aspthrilealaalapheleualagluproileleualaserglygly202530valileileproproalaglytyrhisalaargphelysalailecys354045glulyshisaspileleutyrileser5055557prt人工序列序列部分5alagluleualaasngluleugluargilevalalaleuhisaspala151015serthrilealaalavalilevalgluprovalalaglyserthrgly202530valileleuproprolysglytyrleuglnlysleuarggluilecys354045thrlyshisglyileleuleuilephe5055657prt人工序列序列部分6alagluleualaasngluleugluargilevalalaleuhisaspala151015serthrilealaalavalilevalgluprovalalaglyserthrgly202530valileleuproprolysglytyrleuglnlysleuarggluilecys354045thrlyshisglyileleuleuilephe5055757prt人工序列序列部分7alahisleualaaspgluleugluargileilealaleuhisaspala151015serthrilealaalavalilevalgluprometalaglyserthrgly202530valleuvalproprolysglytyrleuglulysleuarggluilethr354045alaarghisglyileleuleuilephe5055857prt人工序列序列部分8alahisleualaaspgluleugluargilevalalaleuhisasppro151015serthrilealaalavalilevalgluproleualaglyseralagly202530valleuvalproprovalglytyrleuasplysleuarggluilethr354045thrlyshisglyileleuleuilephe5055957prt人工序列序列部分9valgluleualaasngluleuleulysleuilegluleuhisaspala151015serasnilealaalavalilevalgluprometserglyseralagly202530valleuvalproprovalglytyrleuglnargleuarggluilecys354045aspglnhisasnileleuleuilephe50551057prt人工序列序列部分10ilealaleualaaspgluleuleulysleuilegluleuhisaspala151015serasnilealaalavalphevalgluproleualaglyseralagly202530valleuvalproprogluglytyrleulysargasnarggluilecys354045asnglnhisasnileleuleuvalphe50551157prt人工序列序列部分11proalatyrseralaalapheglualaglnleualaglnhisalagly151015gluleualaalavalvalvalgluprovalvalglnglyalaglygly202530metargphehisaspproargtyrleuhisaspleuargaspilecys354045argargtyrgluvalleuleuilephe50551257prt人工序列序列部分12gluargaspmetvalglyphealaargleumetalaalahisarghis151015gluilealaalavalileilegluproilevalglnglyalaglygly202530metargmettyrhisproglutrpleulysargilearglysilecys354045asparggluglyileleuleuileala50551357prt人工序列序列部分13aspglncysleuarggluleualaglnleuleuglugluhishisglu151015gluilealaalaleuserileglusermetvalglnglyalasergly202530metilevalmetprogluglytyrleualaglyvalarggluleucys354045thrthrtyraspvalleumetileval50551454prt人工序列序列部分14alaasngluileaspargilemetthrtrpgluleusergluthrile151015alaglyvalilemetgluproileilethrglyglyglyileleumet202530proproaspglytyrmetlyslysvalgluaspilecysargarghis354045glyalaleuleuilecys501556prt人工序列序列部分15leuleuservallystyrthrargargmetilegluasntyrglypro151015gluglnvalalaalavalilethrgluvalserglnglyalaglyser202530alametproprotyrglutyrileproglnphearglysmetthrlys354045gluleuglyvalleutrpileasn50551656prt人工序列序列部分16leuleuservallystyrthrargargmetilegluasntyrglypro151015gluglnvalalaalavalilethrgluvalserglnglyalaglyser202530alametproprotyrglutyrileproglnilearglysmetthrlys354045gluleuglyvalleutrpileasn50551756prt人工序列序列部分17leuleuservallystyrthrargargmetilegluasntyrglypro151015gluglnvalalaalavalilethrgluvalserglnglyvalglyser202530thrmetproprotyrglutyrvalproglnilearglysmetthrlys354045gluleuglyvalleutrpileser50551856prt人工序列序列部分18lystyralaseraspvalhisaspleuileglnpheglythrsergly151015glnvalalaglypheileglygluserileglnglyvalglyglyile202530valgluleualaproglytyrleuproalaalatyraspilevalarg354045lysalaglyglyvalcysileala50551957prt人工序列序列部分19leualagluleuasptyralapheaspleuileaspargglnserser151015glyasnleualaalapheilealagluproileleuserserglygly202530ileilegluleuproaspglytyrmetalaalaleulysarglyscys354045glualaargglymetleuleuileleu5055206949dna人工序列質粒ptze03_alkj1tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcg60cagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttc120ctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagg180gttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttc240acgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgtt300ctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattc360ttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgattta420acaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttt480tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgta540tccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttat600tcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaa660actcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactc720gtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgaga780aatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttcc840agacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaac900cgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggac960aattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatat1020tttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcag1080tggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggca1140taaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctac1200ctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattg1260tcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatcca1320tgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacac1380cccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaa1440cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttga1500gatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcg1560gtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagc1620agagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaag1680aactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcc1740agtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcg1800cagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac1860accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggaga1920aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagctt1980ccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgag2040cgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg2100gcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtta2160tcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc2220agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg2280tattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagta2340caatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactg2400ggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtct2460gctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagag2520gttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtc2580gtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccag2640aagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgttt2700ggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaa2760acgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacg2820ttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcaggg2880tcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcc2940tgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagacttta3000cgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagca3060gcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaacc3120ccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgc3180catgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaa3240ggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgc3300gctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctac3360gagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgccca3420ccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgccta3480atgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaa3540cctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtat3600tgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttca3660ccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa3720aatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgt3780atcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattg3840cgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattca3900gcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgcta3960tcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccg4020agacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagat4080gctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtct4140ggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatgg4200catcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagat4260tgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgc4320tggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgca4380gggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg4440ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttt4500tcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccgg4560catactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactct4620cttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccggga4680tctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgagg4740ccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtccc4800ccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtgg4860cgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtg4920gcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcga4980aattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataa5040ttttgtttaactttaagaaggagatatacgatgtacgactatataatcgttggtgctgga5100tctgcaggatgtgtgcttgctaatcgtctttcggccgacccctctaaaagagtttgttta5160cttgaagctgggccgcgagatacgaatccgctaattcatatgccgttaggtattgctttg5220ctttcaaatagtaaaaagttgaattgggcttttcaaactgcgccacagcaaaatctcaac5280ggccggagccttttctggccacgaggaaaaacgttaggtggttcaagctcaatcaacgca5340atggtctatatccgagggcatgaagacgattaccacgcatgggagcaggcggccggccgc5400tactggggttggtaccgggctcttgagttgttcaaaaggcttgaatgcaaccagcgattc5460gataagtccgagcaccatggggttgacggagaattagctgttagtgatttaaaatatatc5520aatccgcttagcaaagcattcgtgcaagccggcatggaggccaatattaatttcaacgga5580gatttcaacggcgagtaccaggacggcgtagggttctatcaagtaacccaaaaaaatgga5640caacgctggagctcggcgcgtgcattcttgcacggtgtactttccagaccaaatctagac5700atcattactgatgcgcatgcatcaaaaattctttttgaagaccgtaaggcggttggtgtt5760tcttatataaagaaaaatatgcaccatcaagtcaagacaacgagtggtggtgaagtactt5820cttagtcttggcgcagtcggcacgcctcaccttctaatgctttctggtgttggggctgca5880gccgagcttaaggaacatggtgtttctctagtccatgatcttcctgaggtggggaaaaat5940cttcaagatcatttggacatcacattgatgtgcgcagcaaattcgagagagccgataggt6000gttgctctttctttcatccctcgtggtgtctcgggtttgttttcatatgtgtttaagcgc6060gaggggtttctcactagtaacgtggcagagtcgggtggttttgtaaaaagttctcctgat6120cgtgatcggcccaatttgcagtttcatttccttccaacttatcttaaagatcacggtcga6180aaaatagcgggtggttatggttatacgctacatatatgtgatcttttgcctaagagccga6240ggcagaattggcctaaaaagcgccaatccattacagccgcctttaattgacccgaactat6300cttagcgatcatgaagatattaaaaccatgattgcgggtattaagatagggcgcgctatt6360ttgcaggccccatcgatggcgaagcattttaagcatgaagtagtaccgggccaggctgtt6420aaaactgatgatgaaataatcgaagatattcgtaggcgagctgagactatataccatccg6480gtaggtacttgtaggatgggtaaagatccagcgtcagttgttgatccgtgcctgaagatc6540cgtgggttggcaaatattagagtcgttgatgcgtcaattatgccgcacttggtcgcgggt6600aacacaaacgctccaactattatgattgcagaaaatgcggcagaaataattatgcggaat6660cttgatgtggaagcattagaggctagcgctgagtttgctcgcgagggtgcagagctagag6720ttggcctggcgcgccctcgagggatcccacgtgctggtgccgcgtggcagcgcggccgca6780ctggagcaccaccaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaag6840gaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctct6900aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat6949當前第1頁12