酶法製備穀胱甘肽的方法

2023-07-29 20:42:16

專利名稱：酶法製備穀胱甘肽的方法
技術領域：
本發明涉及製備穀胱甘肽的方法，尤其涉及一種酶法製備穀胱甘肽的方法。
背景技術：
穀胱甘肽廣泛存在於動植物和微生物中，是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型穀胱甘肽(GSH)和氧化型穀胱甘肽(GSSG)，生物體內大量存在並起主要作用的是GSH，廣泛用於治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內分泌疾病，並作為生物活性添加劑及抗氧化劑用於食品領域。
GSH由穀氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通過肽鍵形成，分子中有一特殊的Y肽鍵，即由穀氨酸的Y-COOH與半胱氨酸的α-ΝΗ2縮合成的肽鍵，它不同於蛋白質分子中的普通肽鍵。GSH為白色晶體，易溶於水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲醯胺。 兩分子GSH脫氫後以二硫鍵相連形成氧化型穀胱甘肽(GSSG)，又稱穀胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶於水的白色晶體。
目前穀胱甘肽的主要製備方法有溶劑萃取法、化學合成法、生物發酵法和酶法。 從穀物胚芽中提取GSH，由於GSH得率低、成本高、有機溶劑汙染嚴重、純度不高，而且消耗大量糧食，現已很少使用。化學合成法合成GSH，由於活性產物不易分離，需要化學拆分，產品純度不高，難以推廣。
近年頗受重視的是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到大腸桿菌或酵母中，使用微生物發酵生產GSH。酵母發酵法，工藝較成熟，但產量有待提高，而且下遊工藝處理複雜。與三磷酸腺苷(ATP)再生體系偶聯合成GSH，乙醯激酶儘管效率較高，但乙醯磷酸的高價格及穩定性限制了此法的產業化；酵母糖酵解途徑成本低廉，雖在胞二磷膽鹼和NADP的合成方面獲得成功，但合成GSH的效率較低，主要是ATP再生反應效率不高，反應條件與GSH酶系催化合成GSH的條件不協調以及由此造成的成本較高限制了此方法潛力的發揮。
近年來國內外GSH生產基本採用發酵法，酶法生產GSH的技術還未成形。有研究者提出用固定化酶技術生產GSH，通過調節GSH I和GSH II兩種酶的比例，將兩種酶固定在載體上，通過加入底物和ATP來生產GSH。但是該方法存在以下問題，直接限制了該技術的工業化應用
I) GSH I和GSH II兩種酶固定在一起，無法解決兩步反應之間的相互抑制，影響了生產速度；
2)固定化酶技術未解決酶活性的穩定性問題，提高了生產酶的成本；以及
3)酶法合成的最大問題是ATP的來源，由於ATP價格昂貴，使得利用酶法合成GSH 的成本比傳統發酵法高很多。發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種大規模、低成本、工業化生產 GSH的方法，解決目前酶法生產GSH存在的問題。
本發明提供了一種酶法製備穀胱甘肽的方法，包括以下步驟
(I)在反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸；
(2)在過濾器El中分離GSH I酶；
(3)在反應iip B中生成穀胱;甘妝；
(4)在過濾器Ε2中分離GSH II酶；以及
(5)分尚產物 GSH。
本發明方法進一步包括以下步驟
(6)在再生罐C中利用二磷酸腺苷(ADP)和/或磷酸腺苷(AMP)再生ΑΤΡ，並分離生成的ATP。
本發明方法還可進一步包括以下步驟
(7)所述步驟(2)中分離的GSH I酶的循環利用，即將分離的GSH I酶添加至反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的連續反應；以及
(8) GSH I酶的連續分離，即在過濾器El中連續分離GSH I酶。
本發明方法還可進一步包括以下步驟
(9)所述步驟(4)中分離的GSH II酶的循環利用，即將分離的GSH II酶添加至反應罐B中生成穀胱甘肽的連續反應；以及
(10) GSH II酶的連續分離，即在過濾器Ε2中連續分離GSH II酶。
本發明方法還進一步包括以下步驟
(11)產物GSH的連續分離。
在本發明方法中，循環利用GSH I酶和GSH II酶、以及再生ATP至少一次，即重複所述步驟(6)至所述步驟(11)至少一次，優選重複多次，例如重複2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25、30、40、50 次等。
本發明方法中，在反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的反應如下
反應溫度為25_60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ；
反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下；
反應體系I為含有底物穀氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液；
在反應體系I中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHI酶，反應一段時間，例如1-10小時,優選2-8小時,最優選3-6小時生成Y-穀氨醯半胱氨酸；
其中所述鎂離子源自氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸鎂或硝酸鎂中的一種或多種；所述鉀離子源自氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鉀、亞硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鉀或檸檬酸鉀中的一種或多種；所述鈉離子源自氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、碳酸鈉、 碳酸氫鈉、醋酸鈉或檸檬酸鈉中的一種或多種。
本發明方法中在反應罐B中生成穀胱甘肽的反應如下
反應溫度為25-60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ；
反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下；
反應體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ;
在反應體系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHII酶， 反應一段時間，例如1-10小時，優選2-8小時，最優選2-5小時生成穀胱甘肽。
本發明方法中在再生罐C中的再生反應如下
反應溫度為25_50°C，優選 25_40°C ；
反應 PH 為 4-9，優選 5-8 ；
再生反應體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液；
向再生罐C中添加的ADP和/或AMP為所述步驟(5)分離出產物GSH之後的反應液的濃縮液；
在再生罐C反應一段時間生成再生的ATP，再生的ATP通過離心或過濾方法分離；
其中所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母 (Pichia pastoris)，所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的一種或多種。
本發明方法中過濾器El或E2具有進料口、出料口和回流口，內設過濾膜，在循環利用GSH I酶或GSH II酶時，反應體系通過過濾器El或E2添加至反應罐的方式如下
向反應罐A或反應罐B中添加完分離的GSH I酶或GSH II酶之後，將補加的反應體系I的反應液或反應體系2的反應液經過濾器El或過濾器E2的回流口、過濾器El或 E2、和過濾器El或E2的進料口添加至反應罐A或反應罐B。
本發明方法中所提及的胺基酸或其鹽都為L型胺基酸或其鹽。
更具體地，本發明方法包括以下步驟
(I)在反應罐A中生成Y -穀氨醯半胱氨酸(Y -GluCys )
在反應體系I中添加ATP和GSH I酶，在25_60°C、PH為5-10的條件下反應生成 Y-穀氨醯半胱氨酸，其中所述反應體系I為含有底物穀氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液；
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，從所述步驟(I)的反應體系I的反應液中分離出GSH I酶，經過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液，其中所述過濾器El具有進料口、出料口和回流口，內設截留分子量小於56kDa的膜；
(3)在反應iig B中生成穀胱;甘妝
在反應體系2中添加ATP和GSH II酶，在25_60°C、PH為5-10的條件下反應生成穀胱甘肽，其中所述反應體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ;
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，從所述步驟(3)的反應體系2的反應液中分離出GSH II酶，經過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液，其中所述過濾器E2具有進料口、出料口和回流口，內設截留分子量小於35kDa的膜；以及
(5)分離產物GSH
通過離子交換方法，從所述步驟(4)的濾出液2中分離產物GSH，經離子交換後的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本發明方法還可進一步包含以下步驟
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，並分離生成的ATP
將所述步驟(5)的穿出液濃縮之後，將其含有的ADP和/或AMP在20_50°C、PH值為4-9的條件下在再生反應體系中再生為ATP，所述再生反應體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液；再生的ATP通過本領域技術人員熟知的離心或過濾方法分離，將再生反應體系中的酵母去除；
(7)反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的連續反應，即步驟(I)的連續反應
將所述步驟(2)中分離出的GSH I酶經由過濾器El的回流口添加至反應罐A，
將一定量所述步驟(6)中再生的ATP量添加至反應罐A，
添加完分離的GSH I酶之後，將補加的的反應體系I的反應液經由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進料口添加至反應罐A，
在25_60°C、PH為5_10的條件下進行生成Y -穀氨醯半胱氨酸的連續反應；以及
(8)在過濾器El中連續分離GSH I酶，即步驟(2)的連續分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)即步驟(I)的連續反應步驟中的反應體系I的反應液中分離出GSH I酶，經過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
(9)反應罐B中生成穀胱甘肽的連續反應，即步驟(3)的連續反應
所述步驟(4)中分離出的GSH II酶經由過濾器E2的回流口添加至反應罐B，
將一定量所述步驟(6)中再生的ATP添加至反應罐B，
添加完分離的GSH II酶之後，將反應體系2經由過濾器E2的回流口、過濾器E2、 和過濾器E2的進料口添加至反應罐B，其中所述反應體系2為添加了底物l-10g/L甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的連續分離步驟，即所述步驟(8)的濾出液1，
在25_60°C、PH為5_10的條件下進行反應生成穀胱甘肽的連續反應；
(10)在過濾器E2中連續分離GSH II酶，即步驟(4)的連續分離
通過超濾方法，從所述步驟(3)的連續反應步驟，即所述步驟(9)的反應體系2的反應液中分離出GSH II酶，經過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2 的反應液；以及
(11)分離產物GSH，即步驟(5)的連續分離
通過離子交換方法，從所述步驟(4)的連續分離步驟，即所述步驟(10)的濾出液2 中分離產物GSH，經離子交換後的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本發明的方法中所述步驟(6)至所述步驟(11)可以重複至少一次，優選重複多次，例如重複 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50 次等。
本發明所採用的GSH I酶和GSH II酶來源於任何生物，或者是經過人工改造具有同樣催化功能的酶。
本發明方法步驟(I)添加的ATP為l_20g/L，優選2_15g/L ;添加的GSHI酶的濃度為O. 01-0. 2g/L，優選O. 05g/L ;所述步驟(I)或步驟(I)的連續反應步驟中，反應溫度為 30-55°C，優選35-50°C，更優選37_45°C，反應PH為6_10，優選7_9，反應體系I為含有底物l-8g/L穀氨酸或其鹽，優選2-6g/L穀氨酸或其鹽；l-8g/L半胱氨酸或其鹽，優選2_5g/L 半胱氨酸或其鹽；以及O. 01-0. IM鎂離子，優選O. 01-0. 08M鎂離子；0. 01-0. 3M鉀離子，優選O. 05-0. 2M鉀離子；0. 01-0. 3M鈉離子，優選O. 05-0. 2M鈉離子；和2_12g/L Tris,優選 4-8g/L Tris 的溶液。
本發明方法步驟(2)和步驟(4)中採用的膜選自醋酸纖維素膜、聚碸膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚醯胺膜或陶瓷膜。
本發明方法步驟(3)添加的ATP為l_20g/L，優選2_15g/L ;添加的GSHII酶的濃度為O. 01-0. 2g/L，優選O. 05g/L ;所述步驟(3)或步驟(3)的連續反應步驟中，反應溫度為 30-550C，優選30-50°C，更優選35-45°C，反應的pH值為6_10，優選7_9，添加的底物濃度為 l-10g/L甘氨酸或其鹽，優選2-8g/L甘氨酸或其鹽。
本發明方法步驟(6)的反應溫度為25-40 °C、PH為5-8，所述再生反應體系包含l_60g/L葡萄糖，優選10-50g/L葡萄糖，更優選10-40g/L葡萄糖；l_60g/L酵母，優選 10-50g/L,更優選 20-40g/L 酵母；0. 01-0. IM 鎂離子，優選 O. 02-0. 08M 鎂離子；0. 01-0. 5M 鉀離子，優選O. 05-0. 3M鉀離子；0. 01-1M鈉離子，優選O. 05-0. 8M鈉離子；以及O. 01-0. 5M 磷酸根離子，優選O. 1-0. 5M磷酸根離子；所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母(Pichia pastoris),所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的一種或多種。
本發明方法將合成GSH的兩步反應，即生成Y-穀氨醯半胱氨酸的反應和生成GSH 的反應，分別在不同的反應罐中進行，並且每步反應之後都分離出反應使用的酶即Y-穀氨醯半胱氨酸合成酶(GSH-I)和穀胱甘肽合成酶(GSH-II)，使得GSH I和GSH II兩種酶的酶活力得到最大程度利用，降低了兩種酶促反應之間的相互抑制。本發明方法實現了 GSH I 和GSH II的循環利用，並且使用了適合製備GSH的反應所需的ATP再生系統，降低了製備 GSH的生產成本，提高了 GSH產率，實現了大規模工業化生產。
在本發明方法中，按實施例3計算，僅使用約5克GSH I酶和5克GSH II酶和約 2400克ATP，在100升反應體系中，連續循環反應10次，在40小時內可以生產8000克GSH。 如果用以前報導的工藝進行生產，至少需要使用ATP24960克，生產時間至少200小時。因此，用我們的發明方法生產GSH節約了約90%的ATP，相比於以前報導的固定化酶法製備 GSH技術，效率提高了 10倍以上。綜上所述，本發明的方法具有如下優點
I)拋棄固定化技術，將合成GSH所需的兩種酶Y-穀氨醯半胱氨酸合成酶(GSH-I) 和穀胱甘肽合成酶(GSH-II)分開反應，降低了兩種酶促反應之間的相互抑制，同時使每種酶的酶活力最大程度的得到充分使用；
2)兩步反應可以方便檢測GSH I和GSH II兩種酶的活性變化，有利於生產監控；
3)建立了適合GSH生產的ATP再生系統，降低了生產成本；
4)建立了適合GSH I和GSH II兩種酶保持高活性的反應體系，可以大規模連續生產；
5)採用連續反應體系，分兩步合成GSH，利用連續分離體系和ATP再生體系使酶促合成GSH連續穩定生產；以及
6 )本發明方法縮短了反應時間。


圖I為本發明方法製備GSH的工藝流程圖。
圖2為本發明所表達的GSH I酶和GSH II酶的SDS-PAGE圖。
圖3為生成Y-穀氨醯半胱氨酸反應在起始O小時10倍稀釋反應液的HPLC圖譜。
圖4為生成Y -穀氨醯半胱氨酸反應3小時10倍稀釋反應液的HPLC圖譜。
圖5為反應罐A中Y -穀氨醯半胱氨酸生成量與時間關係圖
圖6為分離的GSH I和GSH II酶的SDS-PAGE圖。
圖7為生成穀胱甘肽反應2. 5小時20倍稀釋反應液的HPLC圖譜。
圖8為反應罐B中穀胱甘肽生成量與時間關係圖
圖9為陽離子交換穿出液的HPLC圖譜
圖10為ATP再生體系反應O小時的HPLC圖譜。
圖11為ATP再生體系反應3小時的HPLC圖譜。
圖12為循環反應次數與Y-GluCys生成量關係圖。
圖13為循環反應次數與GSH生成量關係圖。實施例
下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細描述。本領域的技術人員應能理解，以下實施例是示意性的而非限制性的。
實施例IGSH I酶和GSH II酶的製備
本發明方法中的GSH I酶和GSH II酶可以商購獲得，或者是經過人工改造具有同樣催化功能的酶。
GSH I酶和GSH II酶的製備過程如下
根據gsh I與gsh II基因序列(GenBank:X03954. I和X01666),設計兩對擴增引物，由中美泰和生物技術有限公司合成，引物序列如下
gshl 正義引物5』 -CCCATGGTCCCGGACGTATCACAGGCGCTG-3』 ；
gshl 反義引物5』 -CGGATCCTCAGGCGTGTTTTTCCAGCCACAC-3> ；
gsh II 正義引物5』 -CCCATGGTCAAGCTCGGCATCGTGATGG-3，；
gsh II 反義引物5』 -CGGATCCTTACTGCTGCTGTAAACGTGC-3』。
提取大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株(購於天根生化科技有限公司)DNA,以其為模板，通過PCR擴增出gsh I與gsh II基因片段，並將其分別連接至pET 28a載體(購於Invitrogen公司),經測序正確後,分別轉入E. coli BL21 (DE3)菌株(購於天根生化科技有限公司)。
將轉化後的E. coli BL21 (DE3)單克隆接入LB培養基，培養至對數期後，加入ImM 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導5小時後，收集菌體，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE )篩選高表達菌株。
將篩選出的高表達菌株在無菌條件下接入種子培養基，培養至對數生長期後接入含5L發酵培養基的發酵罐中，培養至對數生長期後接入含50L發酵培養基的發酵罐中，培養5小時後加入ImM IPTG誘導5小時後，離心收集菌體約1000g。
其中LB培養基成分為1%蛋白腖、0. 5%酵母粉和l%NaCl ;種子培養基成分為1% 蛋白腖、0. 5%酵母粉和1%氯化鈉；發酵培養基成分為1%蛋白腖、0. 5%酵母粉、1%氯化鈉、 5%磷酸氫二鈉、1%磷酸二氫鈉、0. 01%硫酸鎂和1%甘油。
收穫的菌體經超聲或高壓勻漿破菌後，離心收集上清。然後加30%飽和的硫酸銨， 離心收集沉澱。經Tris緩衝液pH 8. O溶解後，使用G25柱(購於通用電氣醫療生物科學有限公司)脫鹽，再經DEAE-Sepharose FF (購於通用電氣醫療生物科學有限公司)層析可得到初步純化的GSH I酶和GSH II酶。參見圖2為所製備酶的SDS-PAGE圖，泳道I為GSH I 酶，約56kDa ;泳道2為GSH II酶，約35kDa ;泳道3為蛋白標誌物14_97kDa(購於北京欣經科生物技術有限公司)。IOOOg菌體獲得約10-30g粗純的酶。使用現有技術記載的公知的測定GSH I酶和GSH II酶活性的方法，檢測到GSH I酶和GSH II酶活性分別為7000U和 100001其中將1111底物完全轉化定義為I個活性單位(U)。
實施例2反應時間的確定
參見圖1，根據本發明製備GSH的工藝流程圖進行如下反應
(I)在反應罐A中生成Y -穀氨醯半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應罐A中，100L無菌水的反應體系I為含有底物600g穀氨酸和400g半胱氨酸，以及600g TrisUlOOg氯化鉀、870g氯化鈉和800g氯化鎂的溶液，在反應體系I中添加5g GSH I酶，加氫氧化鉀調節pH值至8. 5，流加ATP開始反應。反應期間控制pH恆定為 8. 5，溫度為40。。。
使用高效液相色譜(HPLC)檢測反應第0、1、2、3、4、5小時Y-穀氨醯半胱氨酸的生成量，參見參見圖3、圖4和圖5。圖3為反應起始O小時10倍稀釋反應液的HPLC圖譜， 圖4為反應3小時10倍稀釋反應液的HPLC圖譜，圖中未標出峰為胺基酸。圖5為反應罐A 中Y-穀氨醯半胱氨酸生成量與時間關係圖。HPLC檢測條件為Kromasi I C18色譜柱(購於AKZO NOBEL公司)(250X4. 6mm)，檢測波長210nm。流動相為含有6. 8g/L磷酸二氫鉀、 2. Og/L庚烷磺酸鈉和3%甲醇的水溶液，pH=3. O。
從結果可以看出3小時後，Y-穀氨醯半胱氨酸生成量達到約6. 6g/L，反應增長緩慢，ATP用量約為1200g。繼續補充ATP，5小時後，ATP用量約為2000g，Y -穀氨醯半胱氨酸生成量約7g/L。從中可以看出，反應3小時後，由於產物的抑制作用，Y-穀氨醯半胱氨酸生成速度明顯降低。由此確定，反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的反應時間為3 小時。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應體系I的反應液經過濾器El的進料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
分離的GSH I酶參見圖6酶的SDS-PAGE圖，泳道I為膜包截留的GSH I酶，約 56kDa ;泳道2為濾出液I,無蛋白濾出；泳道3為蛋白標誌物14_97kDa(購於北京欣經科生物技術有限公司)。使用實施例I中描述方法，檢測GSH I酶的活性約為7000U。
(3)在反應iig B中生成穀胱;甘妝
在反應罐B中，向反應體系2中添加5g GSH II，反應體系2為添加了底物300g甘氨酸的實施例2步驟(2)的濾出液1，控制pH恆定為8. 5，溫度為35°C，流加ATP開始反應。 使用高效液相色譜(HPLC)檢測反應第O、I、2、2. 5、3、4、5小時GSH的生成量，參見參見圖7 和圖8。圖7為生成穀胱甘肽反應2. 5小時20倍稀釋反應液的HPLC圖譜，圖中未標出峰為胺基酸。圖8為反應罐B中穀胱甘肽生成量與時間關係圖。HPLC檢測條件同上述步驟(I)。
從結果可以看出2. 5小時後，穀胱甘肽生成量達到約8g/L，98%以上Y -穀氨醯半胱氨酸被耗盡，ATP用量約為1200g。繼續補充ATP，5小時後，ATP用量約為2000g，穀胱甘肽生成量沒有明顯增加。由此確定，反應罐B中生成穀胱甘肽的反應時間為2. 5小時。
實施例3穀胱甘肽的製備
參見圖1，根據本發明製備GSH的工藝流程圖按照如下步驟製備穀胱甘肽
(I)在反應罐A中生成Y -穀氨醯半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應罐A中，100L無菌水的反應體系I為含有底物600g穀氨酸和400g半胱氨酸，以及600g TrisUlOOg氯化鉀、870g氯化鈉和800g氯化鎂的溶液，在反應體系I中添加5g GSH I酶，加氫氧化鉀調節pH值至8. 5，流加ATP開始反應。反應期間控制pH恆定為 8. 5，溫度為40°C。3小時後，ATP用量約為1200g。
高效液相色譜(HPLC)檢測Y-穀氨醯半胱氨酸的生成量約為6. 6g/L，90%以上 ATP轉化為ADP (AMP)，參見圖4，為反應3小時10倍稀釋反應液的HPLC圖譜，圖中未標出峰為胺基酸。HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應體系I的反應液經過濾器El的進料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
使用實施例I中描述方法，檢測GSH I酶的活性約為7000U。
(3)在反應iig B中生成穀胱;甘妝
在反應罐B中，向反應體系2中添加5g GSH II，反應體系2為添加了底物300g甘氨酸的步驟(2)的濾出液1，控制pH恆定為8. 5，溫度為35°C，流加ATP開始反應。2. 5小時後，ATP用量約為1200g。
HPLC檢測GSH的生成量約為8g/L，90%以上ATP轉化為ADP(AMP)，參見圖7，為反應2. 5小時20倍稀釋反應液的HPLC圖譜，圖中未標出峰為胺基酸。HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，將步驟(3)的反應體系2的反應液經過濾器E2的進料口至過濾器 E2過濾分離GSH II酶，過濾器E2內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器E2 的出料口流出的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液。
分離的GSH II酶參見圖6酶的SDS-PAGE圖，泳道3為為蛋白標誌物14-97kDa(購於北京欣經科生物技術有限公司);泳道4為濾出液2，無蛋白濾出；泳道5為膜包截留的GSH II酶，約35kDa。使用實施例I中描述的方法，檢測GSH II酶的活性約為10000Uo
(5)分離產物穀胱甘肽
使用鹽酸調節濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購於天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分胺基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質，參見圖9，為陽離子交換穿出液的HPLC圖譜。HPLC檢測條件為KromasiI C18色譜柱(購於AKZO NOBEL公司)(250X4. 6_)，檢測波長254nm。 流動相為50mM磷酸鹽緩衝液，pH=6. O。穿出液經濃縮後含有ATP、ADP和/或AMP。
使用O. 2M NaOH,0-0. 8M NaCl梯度洗脫陽離子交換樹脂上的GSH，GSH產量共計 720g，收率可達90%。
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，並分離生成的ATP
將步驟(5)的穿出液在蒸餾塔中減壓蒸餾濃縮至約5倍，至ADP和/或AMP約O. 24M後，將其含有的ADP和/或AMP在30°C、PH值為5. 5的條件下在再生反應體系中再生為ATP，所述再生反應體系為20L無菌水中包含600g葡萄糖、320g氯化鎂、360g氯化鉀、 600g氯化鈉、320ml 85%H3P04和500g乾燥處理過的釀酒酵母，加NaOH調pH至5. 5。3小時後，ATP再生轉化率為90%以上，參見圖10和圖11。圖10為ATP再生體系反應O小時的 HPLC圖譜，從圖10可以看出，步驟(5)的穿出液中主要含有ADP和AMP。圖11為ATP再生反應體系反應3小時的HPLC圖譜，從圖11可以看出，90%的ADP和AMP已再生轉化為ATP， 共計2200g ATP。HPLC檢測條件同上述步驟(5)。
再生的ATP在離心機中以5000rpm轉速通過離心從再生反應體系中分離，將再生反應體系中的酵母去除。
(7)反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的連續反應，即步驟(I)的連續反應
將步驟(2)中分離出的GSH I酶經由過濾器El的回流口添加至反應罐A，
將一定量步驟(6)中再生的ATP添加至反應罐A，例如按補加的反應體系I所需量，約1200g以流加方式添加ATP至反應罐A，
添加完分離的GSH I酶之後，將補加的反應體系I經由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進料口添加至反應罐A，以便將過濾器El中的膜上吸附的少量GSH I 酶反衝至反應罐A ；
在40°C、PH為8. 5的條件下進行生成Y _穀氨醯半胱氨酸的連續反應；3小時後， HPLC檢測Y -穀氨醯半胱氨酸的生成量約為6. 5g/L，90%以上ATP轉化為ADP(AMP)。HPLC 檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
在該步驟中，ATP和GSH I酶被循環利用。GSH I酶循環反應10次後，酶活性約降低15%，需補加15%新酶。參見圖12，為循環反應次數與Y-GluCys生成量關係圖。
(8)在過濾器El中連續分離GSH I酶，即步驟(2)的連續分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)的反應體系I的反應液中分離出GSH I酶，經過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
(9)反應罐B中生成穀胱甘肽的連續反應，即步驟(3)的連續反應
將步驟(4)中分離出的GSH II酶經由過濾器E2的回流口添加至反應罐B ；
將一定量步驟(6)中再生的ATP添加至反應罐B，例如按反應體系2所需量，約 1200g以流加方式添加ATP至反應罐B，
添加完分離的GSH II酶之後，將反應體系2 (為添加了底物l_10g/L甘氨酸的步驟(2)的連續分離步驟，即步驟(8)的濾出液I)經由過濾器E2的回流口、過濾器E2、和過濾器E2的進料口添加至反應罐B，以便將膜包中吸附的少量GSH II酶反衝至反應罐B ;
在35°C、PH為8. 5的條件下進行反應生成穀胱甘肽的連續反應；2. 5小時後，HPLC 檢測GSH的生成量約為8g/L，共計800g。90%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
在該步驟中，實現了 ATP以及GSH II的循環利用。GSH II循環反應10次後，酶活性約降低11%，需補加11%新酶。參見圖13，為循環反應次數與GSH生成量關係圖。
(10)在過濾器E2中連續分離GSH II酶，即步驟(4)的連續分離
通過超濾方法，從步驟(3)的連續反應步驟，即步驟(9)的反應體系2的反應液中分離出GSH II酶，經過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液。
(11)分離產物穀胱甘肽，即步驟(5)的連續分離
使用鹽酸調節步驟(4)的連續分離步驟，即步驟(10)的濾出液2的pH值至3. 0， 在離子交換柱中通過DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購於天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分胺基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質。
使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產量共計720g，收率可達90%。
重複步驟(6)至步驟(11)8次，參見圖12和圖13，分別為為循環反應次數與 Y -GluCys生成量關係圖和循環反應次數與GSH生成量關係圖。
實施例4使用胺基酸鹽生成Y -穀氨醯半胱氨酸
在反應罐A中，100L無菌水的反應體系I為含有底物763g穀氨酸鈉和580g半胱氨酸鹽酸鹽，以及600g TrisUlOOg氯化鉀、870g氯化鈉和800g氯化鎂的溶液，在反應體系 I中添加5g GSH I酶，加氫氧化鉀調節pH值至8. 5，流加ATP開始反應。反應期間控制pH 恆定為8. 5，溫度為40°C。3小時後，ATP用量約為1200g。
HPLC檢測Y-穀氨醯半胱氨酸的生成量約為6. 6g/L，90%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
從結果可以看出使用穀氨酸鹽和半胱氨酸鹽替代相同摩爾濃度的穀氨酸和半胱氨酸對反應結果沒有影響。生產中可使用穀氨酸鹽和半胱氨酸鹽替代穀氨酸和半胱氨酸。
實施例5使用胺基酸鹽生成穀胱甘肽
在反應罐B中，向反應體系2中添加5g GSH II，反應體系2為添加了底物388g甘氨酸鈉的實施例2步驟(2)的濾出液1，控制pH恆定為8. 5，溫度為35°C，流加ATP開始反應。2. 5小時後，ATP用量約為1200g。
HPLC檢測GSH的生成量約為8g/L，90%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
從結果可以看出使用甘氨酸鹽替代相同摩爾濃度的甘氨酸對反應結果沒有影響。生產中可使用甘氨酸鹽替代甘氨酸。
實施例6穀胱甘肽的製備
參見圖1，根據本發明製備GSH的工藝流程圖按照如下步驟製備穀胱甘肽
(I)在反應罐A中生成Y -穀氨醯半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應罐A中，100L無菌水的反應體系I為含有底物IOOg穀氨酸和IOOg半胱氨酸，以及200g Tris、2200g氯化鉀、60g氯化鈉和200g氯化鎂的溶液，在反應體系I中添加 Ig GSH I酶，加氫氧化鉀調節pH值至10，流加ATP開始反應。反應期間控制pH恆定為10， 溫度為60°C。3小時後，ATP用量約為100g。
HPLC檢測Y-穀氨醯半胱氨酸的生成量約為O. 5g/L，95%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應體系I的反應液經過濾器El的進料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
(3)在反應iig B中生成穀胱;甘妝
在反應罐B中，在反應體系2中添加Ig GSH II，反應體系2為添加了底物IOOg甘氨酸的步驟(2)的濾出液1，控制pH恆定為10，溫度為60°C，流加ATP開始反應。2. 5小時後，ATP用量約為IOOgo
HPLC檢測GSH的生成量約為O. 6g/L，90%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述步驟(I)。
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，將步驟(3)的反應體系2的反應液經過濾器E2的進料口至過濾器 E2過濾分離GSH II酶，過濾器E2內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器E2 的出料口流出的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液。
(5)分離產物穀胱甘肽
使用鹽酸調節濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購於天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分胺基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和AMP。
使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產量共計55g，收率可達90%。
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，並分離生成的ATP
將步驟(5)的穿出液在蒸餾塔中減壓蒸餾濃縮約5倍，至ADP和/或AMP約O. 02M 後，將其含有的ADP和/或AMP在20°C、PH值為9. O的條件下在再生反應體系中再生為ATP， 所述再生反應體系為20L反應液中包含20g葡萄糖、40g氯化鎂、750g氯化鉀、12g氯化鈉、 13. 6ml 85%H3P04和20g乾燥處理過的釀酒酵母，加NaOH調pH至9. O。5小時後，ATP再生轉化率為90%以上。HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(6)。
再生的ATP在離心機中以5000rpm轉速通過離心分離。
(7)反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的連續反應，即步驟(I)的連續反應
將步驟(2)中分離出的GSH I酶經由過濾器El的回流口添加至反應罐A，
將步驟(6)中再生的ATP約IOOg以流加方式添加至反應罐A，
添加完分離的GSH I酶之後，將補加的的反應體系I經由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進料口添加至反應罐A，以便將過濾器El中的膜上吸附的少量GSH I酶反衝至反應罐A ;
在60°C、PH為10的條件下進行生成Y _穀氨醯半胱氨酸的連續反應；3小時後， HPLC檢測Y -穀氨醯半胱氨酸的生成量約為O. 5g/L，95%以上ATP轉化為ADP(AMP)。HPLC 檢測條件同上述步驟(I)。
該步驟中，ATP以及GSH I酶的循環利用。GSH I酶循環反應10次後，酶活性約降低25%，需補加25%新酶。
(8)在過濾器El中連續分離GSH I酶，即步驟(2)的連續分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)的反應體系I的反應液中分離出GSH I酶，經過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
(9)反應罐B中生成穀胱甘肽的連續反應，即步驟(3)的連續反應
將步驟(4)中分離出的GSH II酶經由過濾器E2的回流口添加至反應罐B ；
將步驟(6)中再生的ATP約IOOg以流加方式添加至反應罐B ；
添加完分離的GSH II酶之後，將反應體系2 (為添加了底物l_10g/L甘氨酸的步驟(2)的連續分離步驟，即步驟(8)的濾出液I)經由過濾器E2的回流口、過濾器E2、和過濾器E2的進料口添加至反應罐B，以便將膜包中吸附的少量GSH II酶反衝至反應罐B ;
在60°C、PH為10的條件下進行反應生成穀胱甘肽的連續反應；2. 5小時後，HPLC 檢測GSH的生成量約為O. 6g/L，90%以上ATP轉化為ADP (AMP)0
在該步驟中，實現了 ATP以及GSH II的循環利用。GSH II循環反應10次後，酶活性約降低17%，需補加17%新酶。
(10)在過濾器E2中連續分離GSH II酶，即步驟(4)的連續分離
通過超濾方法，從步驟(3)的連續反應步驟，即步驟(9)的反應體系2的反應液中分離出GSH II酶，經過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液。
(11)分離產物穀胱甘肽，即步驟(5)的連續分離
使用鹽酸調節步驟(4)的連續分離步驟，即步驟(10)的濾出液2的pH值至3.0， 在離子交換柱中通過DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購於天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分胺基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質。使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產量共計54g，收率可達90%。
重複步驟(6)至步驟(11) 10次。
實施例7穀胱甘肽的製備
參見圖1，根據本發明製備GSH的工藝流程圖按照如下步驟製備穀胱甘肽
(I)在反應罐A中生成Y -穀氨醯半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應罐A中，100L無菌水的反應體系I為含有底物800g穀氨酸和800g半胱氨酸，以及1200g Tris、75g氯化鉀、1750g氯化鈉和2000g氯化鎂的溶液，在反應體系I中添加20g GSH I酶，加氫氧化鉀調節pH值至5，流加ATP開始反應。反應期間控制pH恆定為 5，溫度為25°C。3小時後ATP用量約為2000g。
HPLC檢測Y-穀氨醯半胱氨酸的生成量約為5g/L，50%以上ATP轉化為ADP(AMP)。 HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(I)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應體系I的反應液經過濾器El的進料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
(3)在反應iig B中生成穀胱；甘妝
在反應罐B中，在反應體系2中添加20g GSH II，反應體系2為添加了底物IOOOg 甘氨酸的步驟(2)的濾出液1，控制pH恆定為5，溫度為25°C，流加ATP開始反應。2. 5小時後，ATP用量約為2000g。
HPLC檢測GSH的生成量約為6. 5g/L，55%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述步驟(I)。
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，將步驟(3)的反應體系2的反應液經過濾器E2的進料口至過濾器 E2過濾分離GSH II酶，過濾器E2內裝膜包(購於Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器E2 的出料口流出的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液。
(5)分離產物穀胱甘肽
使用鹽酸調節濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購於天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分胺基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質。
使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產量共計600g，收率可達90%。
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，並分離生成的ATP
將步驟(5)的穿出液在蒸餾塔中減壓蒸餾濃縮約5倍，至ATP、ADP和/或AMP約 O. 4M後，將其含有的ADP和/或AMP在50°C、PH值為4. O的條件下在再生反應體系中再生為ATP，所述再生反應體系為20L無菌水中包含1200g葡萄糖、400g氯化鎂、15g氯化鉀、 1200g氯化鈉、680ml 85%H3P04和1200g乾燥處理過的釀酒酵母，加NaOH調pH至4. O。3小時後，ATP再生轉化率為85%以上。HPLC檢測條件同上述實施例2中的步驟(6)。
再生的ATP在離心機中以5000rpm轉速通過離心分離。
(7)反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的連續反應，即步驟(I)的連續反應
將步驟(2)中分離出的GSH I酶經由過濾器El的回流口添加至反應罐A，
將步驟(6)中再生的ATP約2000g以流加方式添加至反應罐A，
添加完分離的GSH I酶之後，將補加的的反應體系I經由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進料口添加至反應罐A，以便將過濾器El中的膜上吸附的少量GSH I酶反衝至反應罐A ;
在25V、PH為5的條件下進行生成Y _穀氨醯半胱氨酸的連續反應；3小時後， HPLC檢測Y-穀氨醯半胱氨酸的生成量約為5g/L，50%以上ATP轉化為ADP (AMP)0 HPLC 檢測條件同上述步驟(I)。
該步驟中，ATP以及GSH I酶的循環利用。GSH I酶循環反應10次後，酶活性約降低16%，需補加16%新酶。
(8)在過濾器El中連續分離GSH I酶，即步驟(2)的連續分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)的反應體系I的反應液中分離出GSH I酶，經過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之後的反應體系I的反應液。
(9)反應罐B中生成穀胱甘肽的連續反應，即步驟(3)的連續反應
將步驟(4)中分離出的GSH II酶經由過濾器E2的回流口添加至反應罐B ；
將步驟(6)中再生ATP約2000g以流加方式添加至反應罐B ；
添加完分離的GSH II酶之後，將反應體系2 (為添加了底物l_10g/L甘氨酸的步驟(2)的連續分離步驟，即步驟(8)的濾出液I)經由過濾器E2的回流口、過濾器E2、和過濾器E2的進料口添加至反應罐B，以便將膜包中吸附的少量GSH II酶反衝至反應罐B ;
在25°C、PH為5的條件下進行反應生成穀胱甘肽的連續反應；2. 5小時後，HPLC檢測GSH的生成量約為6. 6g/L，55%以上ATP轉化為ADP (AMP)0
在該步驟中，實現了 ATP以及GSH II的循環利用。GSH II循環反應10次後，酶活性約降低13%，需補加13%新酶。
(10)在過濾器E2中連續分離GSH II酶，即步驟(4)的連續分離
通過超濾方法，從步驟(3)的連續反應步驟，即步驟(9)的反應體系2的反應液中分離出GSH II酶，經過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之後的反應體系2的反應液。
(11)分離產物穀胱甘肽，即步驟(5)的連續分離
使用鹽酸調節步驟(4)的連續分離步驟，即步驟(10)的濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購於天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分胺基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質。使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產量共計600g，收率可達90%。
重複步驟(6)至步驟(11) 9次。
對比例I
在100L無菌水中，加入600g穀氨酸、400g半胱氨酸、300g甘氨酸、600g Tris, IlOOg氯化鉀、870g氯化鈉、800g氯化鎂，加氫氧化鉀調節pH值至8. 5，加入5g GSH I、5g GSH II，流加ATP開始反應。反應期間控制pH恆定為8. 5，溫度為37°C。3小時後，ATP用量約為2400g，HPLC檢測GSH的生成量約為2. 5g/L，共計600g，30%以上ATP轉化為ADP (AMP), HPLC檢測條件同上述實施例2中步驟(I)。
從對比例I可以看出，由於GSH I與GSH II反應條件例如溫度、時間等略有不同， 以及GSH對GSH I的抑制作用，兩種酶放在一起催化底物生成GSH的產量低於本發明方法中將兩種酶分開反應的產量。
本領域的技術人員應能理解，在實際應用中，在本發明的啟示下，其他人員也可能作出與本發明相似的設計或對本發明進行一些添加或改變。特別需要指出的是，只要不脫離本發明的設計宗旨，所有顯而易見的改變以及具有等同替換的相似設計，均應屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1.ー種酶法製備穀胱甘肽的方法，包括以下步驟 (1)在反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸； (2)在過濾器El中分離GSHI酶； (3)在反應B中生成穀胱;甘妝； (4)在過濾器Ε2中分離GSHII酶；以及 (5)分離產物GSH。
2.根據權利要求I所述的方法，進ー步包括以下步驟 (6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ΑΤΡ，並分離生成的ΑΤΡ。
3.根據權利要求I或2所述的方法，進ー步包括以下步驟 (7)所述步驟(2)中分離的GSHI酶的循環利用，即將分離的GSH I酶添加至反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的連續反應；以及 (8)GSH I酶的連續分離，即在過濾器El中連續分離GSH I酶。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，進ー步包括以下步驟 (9)所述步驟(4)中分離的GSHII酶的循環利用，即將分離的GSH II酶添加至反應罐B中生成穀胱甘肽的連續反應；以及 (10)GSHII酶的連續分離，即在過濾器Ε2中連續分離GSH II酶。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，進ー步包括以下步驟 (11)產物GSH的連續分離。
6.根據權利要求5所述的方法，循環利用GSHI酶和GSH II酶、以及再生ATP至少ー次，即重複所述步驟(6)至所述步驟(11)至少一次，優選重複多次，例如重複2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50 次等。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，在反應罐A中生成Y-穀氨醯半胱氨酸的反應如下 反應溫度為25-60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ； 反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下； 反應體系I為含有底物穀氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液； 在反應體系I中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHI酶，反應ー段時間生成Y-穀氨醯半胱氨酸； 其中所述鎂離子源自氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸鎂或硝酸鎂中的ー種或多種；所述鉀離子源自氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鉀、亞硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鉀或檸檬酸鉀中的ー種或多種；所述鈉離子源自氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉或檸檬酸鈉中的ー種或多種。
8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，在反應罐B中生成穀胱甘肽的反應如下 反應溫度為25-60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ； 反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下； 反應體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ; 在反應體系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHII酶，反應一段時間生成穀胱甘肽。
9.根據權利要求2-8任一項所述的方法，在再生罐C中的再生反應如下 反應溫度為25-50°C，優選25-40°C ； 反應PH為4-9，優選5-8 ； 再生反應體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液； 向再生罐C中添加的ADP和/或AMP為所述步驟(5)分離出產物GSH之後的反應液的濃縮液； 在再生罐C反應一段時間生成再生的ATP，再生的ATP通過離心或過濾方法分離； 其中所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母(Pichiapastori s )，所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的ー種或多種。
10.根據權利要求3-9任一項所述的方法，過濾器El或E2具有進料ロ、出料口和回流ロ，內設過濾膜，在循環利用GSH I酶或GSH II酶時，反應體系通過過濾器El或E2添加至反應罐的方式如下 向反應罐A或反應罐B中添加完分離的GSH I酶或GSH II酶之後，將補加的反應體系I的反應液或反應體系2的反應液經過濾器El或過濾器E2的回流ロ、過濾器El或E2、和過濾器El或E2的進料ロ添加至反應罐A或反應罐B。
全文摘要
本發明提供一種酶法製備穀胱甘肽(GSH)的方法，該方法將合成GSH的兩步反應，即生成γ-穀氨醯半胱氨酸的反應和生成GSH的反應，分別在不同的反應罐中進行，並且每步反應之後都分離出反應使用的酶即γ-穀氨醯半胱氨酸合成酶(GSH-I)和穀胱甘肽合成酶(GSH-II)，使得GSH I和GSH II兩種酶的酶活力得到最大程度利用，降低了兩種酶促反應之間的相互抑制。本發明方法實現了GSH I和GSH II的循環利用，並且使用了適合製備GSH的反應所需的ATP再生系統，降低了製備GSH的生產成本，提高了GSH產率，實現了大規模連續生產，經濟效益顯著。
文檔編號C12P21/02GK102978267SQ20121020169
公開日2013年3月20日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者劉珊珊, 秦永發 申請人:北京天開易達生物科技有限公司