基因表達盒及轉化體、及使用該轉化體的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法及2-脫氧-青蟹肌...的製作方法

2023-07-29 19:05:51

專利名稱：：基因表達盒及轉化體、及使用該轉化體的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法及2-脫氧-青蟹肌...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因表達盒及轉化體、及使用該轉化體的2-脫氧-青蟹肌糖(scylloinosose)的製備方法及2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法。
背景技術：
：目前在石油化學領域中，開始以石油作為原料生產六元碳環化合物。另一方面，在丁醯苷菌素(butyrosin)生產菌環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)中發現了2-脫氧-青蟹肌糖合成酶(DOI合成酶)，該酶可催化以葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)為基質，合成六元碳環化合物2-脫氧-青蟹肌糖(以下也稱為DOI)的反應(圖l,專利文獻l)。D0I合成酶是參與含有2-脫氧鏈黴胺作為苷元的氨基糖苷抗生素的生物合成的酶，其生成物DOI是作為醫藥原料或化學工業資源有用的物質。化學合成DOI的方法使用多步反應和有害或昂貴的金屬，與其相對，如果使用DOI合成酶，則能夠用較短的工序高效率地生產DOI。目前已經確立了使用通過在大腸桿菌中表達DOI合成酶而荻得的重組DOI合成酶，用較短工序由葡萄糖-6-磷酸生產DOI的方法(專利文獻l)。並且，已知DOI可以通過下述反應合成，即，使己糖激酶和DOI合成酶與葡萄糖作用的二步酶反應、或使DOI合成酶與葡萄糖-6-磷酸作用的一步酶反應(專利文獻l、非專利文獻l)。另外，也有才艮道指出，濃縮酶反應液後製成乙酸溶液，與^典化氫作用，由此可以在不精製DOI的情況下變為兒茶酚(專利文獻l)。但是，使用嵌入DOI合成酶的大腸桿菌、以來自生物質(biomass)的D-葡萄糖為原料、通過發酵進行DOI合成的方法，尚未作為課題被提出。目前為止，已有報導指出可通過酶反應合成DOI,變為反應組合物狀態的DOI,但精製.分離DOI本身的方法未見報導。並且，完全沒有公開關於從含有比酶反應液中多種多量的培養基成分、作為碳源的葡萄糖、除此之外還含有來自蛋白腖等的胺基酸類、或各種金屬離子類的微生物培養液中精製DOI的信息。即。目前的現狀為，沒有在來自酶反應液及微生物培養液等的雜質的存在下精製DOI的相關報導，或尚未確立可工業應用的精製方法。為了在來自微生物培養液等的雜質的存在下精製DOI,已知有實驗室規模的通過HPLC分離或採用活性炭柱色語的方法。但是，不言而喻通過HPLC分離不適於工業生產。另外，採用活性炭柱色語的方法中，使培養基中的有機化合物都吸附到活性炭上後，邊改變醇等有機溶劑的濃度，邊利用吸附力的差別使其順次洗脫。所以，生產大量的DOI時，必須有足以吸附培養基中大部分有機化合物的量的活性炭，此方法也不適於大量4青制。由此可知，目前為止尚未確立用於糹青制DOI的適當的工業方法。專利文獻l:特開2000-236881號公報(專利第3122762號)非專利文獻l:K.Kakinuma、E.Nango、F.Kudo、Y.Matsushima、及T.Eguchi著、TetrahedronLetters、2000年、41巻、p.1935—1938非專利文獻2:Ota,Y.等著,J.Antibiot.、2000年、53巻、1p.158-1167非專利文獻3:Kudo,F.等著、J.Antibiot.、1999年、52巻、p.559-571
發明內容本發明是鑑於上述問題而完成的，其目的在於提供能夠實現可以工業規模製備DOI的體系的基因表達盒、具有此基因表達盒的轉化體及2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法及2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法。本發明的基因表達盒的特徵在於，由參與2-脫氧-青蟹肌糖的合成的基因構成。本發明的基因表達盒的特徵在於，所述參與2_脫氧-青蟹肌糖的合成的基因是2-脫氧-青蟹肌糖合成酶。由此，可以獲得能夠工業製備DOI的轉化體。另外，本發明轉化體的特徵在於，該轉化體是向宿主細胞中導入上述基因表達盒而獲得的。本發明轉化體的特徵在於，所述宿主細胞是選自大腸菌種、及GILSP基因重組微生物表記載的宿主細胞(平成18年3月公告表中記載的細胞)中的宿主細胞。由此，可以實施能工業製備DOI的方法。本發明轉化體的特徵在於，所述宿主細胞是基因被破壞的宿主細胞，所述基因選自編碼磷酸葡糖異構酶的pgi基因、編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氪酶的zwf基因、編碼磷酸葡糖變位酶的pgm基因、及編碼處於穩定期的負責蛋白質合成修飾的核糖體修飾因子蛋白質的rmf基因中的至少一種。由此，除上述之外，還能夠實施能以較高效率工業製備DOI的方法。另一方面，本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法的特徵在於，具有使上述轉化體和碳源接觸的工序。由此，能夠工業製備DOI。本發明的2_脫氧-青蟹肌糖的製備方法的特徵在於，所述碳源為選自D-葡萄糖、寡糖、多糖、澱粉、纖維素、米糠及廢糖蜜、及可以得到D-葡萄糖的生物質中的至少一種碳源。由此，除上述之外，還能通用地製備DOI。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的特徵在於，是通過上述2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法獲得的。由此，能夠得到充分發揮了利用轉化體的製備方法的特質的2-脫氧-青蟹肌糖。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的特徵在於，包含以下工序，即，使上述轉化體和碳源接觸，得到具有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物的工序，和，用具有氫離子型強酸性陽離子交換樹脂和有機酸離子型石成性陰離子交換樹脂的混合柱(mixed-bedcolumn)或雙柱(double-bedcolumn)處理所述組合物的工序。由此，能以工業方式獲得高純度的DOI。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的特徵在於，所述有枳i酸離子型鹼性陰離子交換樹脂是乙酸離子型陰離子交換樹脂。由此，能夠通過濃縮操作除去乙酸，因此實用中可以優選使用。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的特徵在於，是通過上述2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法獲得的。由此，可以得到純度高、充分發揮了利用轉化體的特質的2-脫氧-青蟹肌糖。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的特徵在於，包含以下工序，即，使上述2-脫氧-青蟹肌糖和三烷氧基曱烷反應，得到2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序，和在酸存在下水解所述2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序。由此，除上述之外，還能高效地分離雜質。本發明的2_脫氧-青蟹肌糖的精製方法的特徵在於，所述三烷氧基曱烷是三甲氧基曱烷。由此，能夠通過濃縮操作容易地除去在接下來的水解工序中生成的曱醇，因此，實用中可以優選使用。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的特徵在於，是通過上述2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法獲得的。由此，能夠得到在純度等方面實用性也優異的2-脫氧-青蟹肌糖。作為醫藥原料或化學工業原料十分重要的六元碳環化合物，目前為止通過以石油為原料的石油化學進行製備。但是，通過使用本發明的技術，可以以來自可再生的植物資源(生物質)的D-葡萄糖作為原料，由細菌合成六元碳環化合物2-脫氧-青蟹肌糖(DOI)。另夕卜，可以通過處理培養液，回收精製的DOI。[圖1]表示由D-葡萄糖生成DOI的反應路線及DOI合成酶催化的反應。[圖2A]表示pLEX-btrC的結構。[圖2B]表示pGAP-btrC的結構。[圖2C]表示pGAD-btrC的結構。[圖2D〗表示pGAP-btrC/pGAD—btrC的結構。[圖3A]表示將含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Apgi抹在2xYT培養基、或米糠培養基中培養不同的時間時，菌體萃取物的SDS-PAGE圖案。[圖3B]表示將含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的大腸桿菌GI724△pgiAzwfApgm林在2xYT培養基中培養不同的時間時，菌體萃取物的SDS-PAGE圖案。[圖4A]為含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Apgi抹的培養(2xYT3L、30°C、pH7.5、5%D-葡萄糖、培養24小時)上清液的肟化反應物的HPLC圖。[圖4B]為含有pLEX-btrC的大腸桿菌GYI724△rmf林的培養(2xYT、10mL、30°C、pH7，3%D-葡萄糖、培養48小時)上清液的肟化反應物的HPLC圖(左圖培養0小時)。[圖5]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Apgi林的培養(2xYT+2%葡萄糖，或，2xYT+5%D—葡萄糖(■)、3L、30°C、pH7.5),(A)培養基的濁度、(B)D-葡萄糖濃度、及(C)DOI生產量的時間曲線(橫軸為添加葡萄糖後的經過時間)。[圖6]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwf林的培養(2xYT+3。/。甘露醇+50/。D—葡萄糖、3L、30°C、pH7.5),(A)培養基的濁度、(B)D-葡萄糖濃度、及(C)DOI生產量的時間曲線(橫軸為添加葡萄糖後的經過時間)。[圖7]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwfApgm林的培養(2xYT+5%D-葡萄糖+0.5%甘露醇、3L、25°C、pH7),(左)菌體濁度、(中)培養基中的D-葡萄糖濃度、(右)DOI生產量的時間曲線(橫軸為添加D-葡萄糖後的經過時間)。[圖8]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwfApgm抹和含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwfApgm抹(■)的培養(2xYT+5%D-葡萄糖+0.5%甘露醇、3L、25°C、pH6-7),(左)菌體濁度、(中)培養基中的D-葡萄糖濃度、(右)DOI生產量的時間曲線(橫軸為添加D-葡萄糖後的經過時間)。[圖9]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI7M野生型抹和含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Armf林(■)的培養(2xYT+3%D-葡萄糖、10mL、30°C、pH7),(左)菌體濁度、(中)培養基中的D-葡萄糖濃度、(右)DOI生產量的時間曲線(橫軸為添加D-葡萄糖後的經過時間)。[圖10]為對按照實施例8的方法將培養液流入離子交換樹脂所得的餾分的pH、傳導度、DOI濃度進行繪製所得的圖。[圖11]按照實施例8的方法精製所得的DOI的13C-NMR光語。[圖12]為對按照實施例9的方法將培養液流入離子交換樹脂所得的餾分的pH、傳導度、DOI濃度進行繪製所得的圖。[圖13]按照實施例9的方法精製所得的DOI的13C-NMR光譜。[圖14]表示本發明2-脫氧-青蟹肌糖精製方法的第二方案的原理的簡圖。[圖15]按照實施例10的方法精製所得的DOI的H-NMR光譜。[圖16]按照實施例11的方法精製所得的DOI的&-NMR光語。[圖17]按照實施例12的方法精製所得的DOI的^-NMR光i脊。具體實施方式考慮DOI合成酶的特性，將該酶導入其他微生物中，由此能夠以來自大量存在的生物質的D-葡萄糖為原料，高效率地用較短工序生產有用資源DOI。因此，本發明人等為了開發出以大腸桿菌為宿主細胞通過發酵法用簡便便宜的方法生產DOI的方法作為DOI的新型合成方法，進行了潛心研究。從而完成本發明。另外，為採用工業方法精製DOI的系統時，作為優選方法，例如可以舉出原理為從柱上部流入培養液，從下部流出精製的DOI的方法、及使DOI或其衍生物結晶化進行分離的方法、及將上述方法組合的方法。基於上述觀點，通過研究吸附DOI之外的物質且DOI不祐:吸附最先流出之類的柱基材，並且研究在結晶化.分離後能夠高效地獲取DOI的DOI衍生物，從而完成本發明。以下，說明本發明的優選實施方案。〈本發明的基因表達盒〉本發明的基因表達盒的特徵在於，由參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因構成。即，本發明的基因表達盒只要由參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因、和能使此基因表達的例如載體等的基因構成即可，沒有特殊的限制。(參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因)在本發明的基因表達盒中，作為參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因可以為編碼能夠合成2-脫氧-青蟹肌糖的公知的蛋白質的基因。作為其例子，可以舉出btrC基因，該btrC基因編碼由D-葡萄糖合成DOI的、來自環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的DOI合成酶的42kDa亞基(參見專利文獻l、非專利文獻l及GenbankAB066276等)。當然，只要為編碼具有DOI合成酶活性的酶的基因即可，也可以利用來自環狀芽孢桿菌之外的生物的基因。另外，上述基因的鹼基序列只要是合成具有本發明DOI合成酶活性的酶的基因即可，在其基因的鹼基序列中可以產生缺失、取代、插入等變異。(本發明的基因表達盒的構建)為了構建本發明的基因表達盒，可以使用在下述宿主細胞內能夠使上述參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因表達的基因。作為基因表達盒的基因構建，可以舉出啟動子、參與轉錄活化的序列、RBS(核糖體結合部位)、終止子等。例如，在以大腸桿菌為宿主細胞的大量表達蛋白質的體系中，該基因的5'上遊可以連接啟動子、參與轉錄活化的序列、RBS(核糖體結合部位)等DNA序列，該基因的3'下遊可以連接終止子等DNA序列。上述DNA序列只要是在大腸桿菌中發揮作用的序列即可，可以為任意序列。啟動子有進行結構表達的啟動子或進行誘導表達的啟動子，可以使用任一種啟動子，優選可以控制表達的啟動子。另夕卜，在以大腸桿菌為宿主的基因表達中，通常使用以IPTG(異丙基一石克4戈一p比口南半享'L鬥唐苦,isopropyl—thio—galactopyranoside)為首的成本較高的誘導物。本發明中，優選使用不利用IPTG之類昂貴誘導物即可實現目的基因高度表達的表達體系。作為用於實現此目的的宿主載體體系，例如可以利用P^表達體系(Invitogen)、使用GAP啟動子或GAD啟動子的表達體系等。在PL表達體系中，嵌入載體(pLEX，氨節青黴素耐性標記物)上的基因的表達，受到來自入噬菌體的引起構成上強表達的啟動子Pt啟動子的控制。另外，PL表達體系利用培養基中色氨酸濃度進行表達控制，在色氨酸濃度高的培養基中誘導表達。另一方面，在單獨或同時使用gapA(編碼甘油醛一3—磷酸脫氫酶A的基因)啟動子或gadA(編碼穀氨酸脫羧酶A的基因)啟動子的表達體系中，嵌入載體(來自pUC,氨千青黴素耐性標記物)上的基因的表達，可以在營養增殖期或穩定期引起結構上的強表達。使用上述gapA啟動子或gadA啟動子等的表達體系不需要特殊的試劑或操作，在通常的培養時誘導表達。另一方面，PL表達體系中，通常用於大腸桿菌培養的完全培養基中為了誘導啟動子活性存在充分量的色氨酸，不需要為了誘導表達再另外加入色氨酸。另外，使用gapA啟動子或gadA啟動子的表達體系也同樣不需要為了誘導表達而加入誘導物。即，不需要使用昂貴的誘導物，就可以高度表達目的基因。〈本發明的轉化體〉本發明的轉化體的特徵為，向宿主細胞中導入上述基因表達盒而形成。以下，說明本發明的宿主細胞。(宿主細胞)作為本發明的轉化體中可以使用的宿主細胞，沒有特殊的限制，可以使用保藏在菌抹保藏單位(例如IFO、ATCC等)中的菌抹。作為上述例子，例如可以舉出大腸桿菌。另外，作為大腸桿菌之外的宿主細月包，可以使用GILSP(GoodIndustrialLarge—ScalePractice(優良工業規範))基因重組微生物表中記載的宿主細胞(平成18年3月公告表中記載的細胞，解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、4豆芽孑包片幹菌(Bacillusbrevis)HPD31、^i芽孑包一幹菌HPD31—M3、；也衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)DN2461、地衣芽孢桿菌DN2717、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K2A1、來自枯草芽孢桿菌M168的菌才朱、谷氛酉臾才奉才幹菌(Corynebacteriumglutamicum)、來自大腸斥幹菌(Escherichiacoli)K12的菌抹、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus))。(本發明的基因破壞林)在本發明的轉化體中，考慮到2-脫氧-青蟹肌糖的合成，上述宿主細胞可以使用各種破壞染色體/質粒基因的菌抹。本發明的優選方案為，將編碼宿主細胞載有的、參與葡萄糖一6—磷酸代謝的酶即磷酸葡糖異構酶、葡萄糖一6—磷酸1一脫氫酶及磷酸葡糖變位酶的基因(分別為pgi基因、zwf基因及pgm基因)分別單獨地破壞、或同時破壞兩個(pgi基因和zwf基因及pgi基因和pgm基因)，或同時破壞3個。並且，可以單獨地破壞編碼參與控制穩定期中蛋白質合成的RMF蛋白質的基因(rmf基因)，或者將編碼參與上述葡萄糖一6—磷酸代謝的酶的基因被破壞的各種基因破壞株的rmf基因破壞。由此抑制菌引起的作為用於DOI生產的直接基質的葡萄糖一6—磷酸的分解代謝，通過穩定期中的蛋白質合成，使得DOI生產能力顯著提高。[參與葡萄糖一6—磷酸分解的基因的破壞林]為了以儘可能高的收率合成DOI，一般認為有必要儘可能地抑制由菌體導致的D—葡萄糖的異化代謝。在大腸桿菌中，作為編碼與D一葡萄糖異化代謝相關的酶的基因，有以下三種基因，即，編碼與在糖酵解體系中從葡萄糖一6—磷酸變為果糖一6—磷酸相關的磷酸葡糖異構酵(phosphoglucoseisomerase)的(pgi)基因，和編碼參與磷酸戊糖途徑中從葡萄糖-6-磷酸向磷酸葡萄糖酸內酯的轉化的酶即葡萄糖-6-磷酸卜脫氫酶(Gluxose_6-phosphatedehydrogenase)的zwf基因，編碼參與從葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸的轉化的酵即石岸酉吏葡#唐變知的方法。例如，可以舉出誘發突變的方法(通過自然育種的方法、添加變異劑、紫外線照射、放射線照射等)、採用隨機突變的方法(採用插入序列(IS)、易位子(Tn)等的方法)、部位特異性基因破壞法(採用單、雙交換方法的方法)等。其中，從篩選所期望的基因破壞抹的方面來看，優選可在破壞對象的基因中插入含有顯示耐藥性的基因的片段的部位特異基因破壞法。需要說明的是，如下所述，本發明轉化體中使用的實施了基因破壞的宿主細胞，可以4吏用GeneBridges社的QuickandEasyBACModificationKit製作，但並不限定於此。(本發明的轉化體的製作方法)本發明的轉化體可以將上述基因表達盒導入上述宿主細胞中進行製作。作為此導入方法，可以舉出感受態法(competencemethod)或利用受體介導的胞吞作用的方法等。〈本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法〉本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法的特徵在於，使上述轉化體和碳源在適於轉化體成長等的介質中接觸。作為碳源，可以使用D-葡萄糖或D-葡糖胺、D-半乳糖胺等含氮單糖類，上述單糖類構成的二糖以上的糖類或寡糖、或來自碳水化合物(澱粉、米糠、廢糖蜜等)多糖類的單糖類。作為進行本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法的介質，只要是能夠使宿主細胞增殖/成長等的公知的培養基即可，可以為固態、液體等，介質形態沒有限定。作為上述例子，可以舉出瓊脂培養基、RMG培養基、2xYT培養基、LB培養基、M9基礎培養基或SOB培養基等。上述介質中有碳源、氮源、無機鹽類、其他有機營養源。此碳源，除上述之外，還可以為甘露醇等表l所示的物質等。作為該氮源，例如可以舉出氯化銨、酪蛋白胺基酸、蛋白腖、酵母提取物。作為無機鹽類，例如可以舉出磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化4美、氯化鈉等。如上所述，作為宿主載體體系使用GAP-GAD表達體系或PL表達體系(Invitrogen)時，可以不用昂貴的誘導物。另一方面，為了適應宿主的生長等，介質還可以含有適當的添加劑。為了使導入上述基因表達盒中的參與2-脫氧-青蟹肌糖的合成的基因表達，介質中還可以含有例如IPTG或色氨酸等使啟動子活性提高的化合物。特別是，通過啟動子進行的基因表達為誘導型時，可以適時添加i秀導物。在本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法中，使上述轉化體和碳源接觸的溫度、時間、氛圍等，只要是適於轉化體成長的環境即可，沒有特殊的限制。例如，其溫度較優選為20。C至37。C。另外，時間也沒有特殊限制，可以大致為1天至7天。例如，本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法，首先，使作為碳源的大腸桿菌能夠同化的物質(例如，D-葡萄糖等)在培養基中與上述轉化體接觸。之後，從所得培養上清液中回收DOI。如上所述，通過使用轉化體的本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法，可以工業上獲得DOI。本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法由於具有上述構成，所以能夠通過己糖激酶(hexokinase)和DOI合成酶以高收率由D-葡萄糖合成DOI。另外，通過製作、培養上述含有質粒pGAP-btrC、pGAD-btrC、pGAP—btrC/pGAD—btrC或pLEX—btrC的GI724Armf轉化抹、GI724ApgiArmf轉化林、GI724Apgi轉化林、GI724ApgiAzwf轉化林或GI724ApgiAzwfApgm轉化抹等的方法，如圖l所示，從D-葡萄糖經過葡萄糖-6-磷酸，再經過DOI合成酶催化的5步反應，可生成DOI。在本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法中，如上所述，使轉化體和碳源接觸，可以得到具有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物(例如，含有2-脫氧-青蟹肌糖的培養基、宿主細胞等)。例如，以含有2-脫氧-青蟹肌糖的培養基為2-脫氧-青蟹肌糖的原料時，只需從培養上清液中回收DOI即可。在本發明中，作為從培養液中回收DOI的方法，考慮到2-脫氧-青蟹肌糖的物理/化學性質或培養基的組成等，只需採用公知的萃取方法回收2-脫氧-青蟹肌糖即可。例如，可以使用下述方法。即，首先，在培養結束後，用離心機或過濾裝置等從培養液中除去菌體，得到培養上清液。之後，再過濾處理此培養上清液，除去菌體等固態物，將此濾液添加到離子交換樹脂中，用蒸餾水洗脫。邊測定折射率、pH、傳導率，邊分離不含雜質的餾分，去除此水溶液的溶劑，可以回收DOI。例如可以採用高效液相色i普法或核f茲共振法等對所得DOI進行分析。〈本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的第一方案〉本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的特徵在於包括如下工序，即，使上述轉化體和碳源接觸，得到具有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物的工序，和用具有氫離子型強酸性陽離子交換樹脂和有機酸離子型鹼性陰離子交換樹脂的混合柱或雙柱處理所述組合物的工序。在本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法中，使轉化體和碳源接觸的步驟，以上述本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法為基準進行。通過此步驟，可以得到含有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物。此組合物由上述介質構成，以下說明使用培養基作為介質的情況。在含有碳源的培養基中培養轉化體，在該培養結束後的培養液中，除了作為殘留碳源的葡萄糖之外，還含有培養基的各種成分。作為上述各種成分可以舉出各種胺基酸或肽類、及各種金屬離子類等。為了獲得DOI,必須除去上述各成分，在本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法中提供了解決上述問題的方法。作為培養基中含有的應該除去的雜質，如上所述，有作為殘留碳源的D-葡萄糖、各種胺基酸或肽類、及各種金屬離子類。其中通過研究培養條件，可知能夠繼續培養至D-葡萄糖完全消耗。如上所述得到的培養基中，作為殘留的雜質，有各種胺基酸或肽類、及各種金屬離子類。在胺基酸類中，有賴氨酸或組氨酸、色氨酸之類具有多個氨基的鹼性胺基酸，也有穀氨酸或天冬氨酸之類具有多個羧基的酸性胺基酸。另外，金屬離子當然為陽離子，同時培養基中也存在作為其相反離子的氯離子或硫酸根離子等。所以，只需研究出一種吸附所有上述雜質，並且不吸附DOI的基材即可。本發明人等基於上述構思，對基材進行研究且探討了洗脫條件，結果發現，使用常用的離子交換樹脂，例如鈉離子型或氫離子型強酸性陽離子交換樹脂及氯離子型或氫氧根離子型鹼性陰離子交換樹脂的方法，不能高效率地精製DOI。即，即使使用分別連接的雙柱、或將兩者混合的混合柱，仍然不能實現上述目的。胺基酸可以與2種離子交換樹脂的任一種鍵合。另外，金屬離子與陽離子交換樹脂鍵合，而DOI由於無離子性官能團，所以，具有不與任何離子交換樹脂鍵合的特性。所以，推測胺基酸類及金屬鹽類與離子交換樹脂鍵合，只有DOI不吸附而溶離出來，-f旦結果並非如此。DOI的回收率為50%以下，並且因離子交換樹脂的使用條件不同而變化較大。為了適合大量處理的工業方法，必須進一步提高回收率且使效果穩定。本發明人等更廣泛地深入研究基材和精製條件，結果發現，通過採用使用有機酸離子作為陰離子交換樹脂的相反離子的方法，即，使用有機酸離子型陰離子交換樹脂和氫離子型陽離子交換樹脂的混合柱或雙柱，可以更有效率地精製DOI。作為有機酸，可以舉出乙酸、丙酸、草酸等，其中優選使用乙酸。考慮到在pH為8以上的鹼性區域內DOI極易分解，只有在pH為35的弱酸性條件下穩定，優選使用乙酸作為有機酸。即，如果DOI在酸性和鹼性兩區域內完全穩定，則可以採用將培養液流入常用的將陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂填充到各柱內的雙柱中的方法，除去上述雜質。另外，如果在兩區域中具有與果糖同等的穩定性，則可以用混合柱精製。本發明人等率先發現，即使使用混合柱，DOI在鹼性區域中仍發生分解而不穩定，更不必i兌7又片主。為了解決此問題，本發明人等對如何選擇與所用離子交換樹脂鍵合的相反離子進行了研究，結果發現了使用有機酸離子作為陰離子交換樹脂的相反離子的方法。由此，有機酸殘留在溶離液中，也可混入到DOI的溶離成分中，但其能夠有效地將溶離液的pH保持在4左右。在有機酸中，乙酸具有可以通過濃縮除去的優點。由此可知，可以通過使培養液通過將氫離子型陽離子交換樹脂和有機酸離子型陰離子交換樹脂混合而製成的離子交換柱，精製DOI,從而完成本發明。該方法是能適用於工業大量生產的方法。使用混合填充式或雙填充式離子交換樹脂柱的精製方法能夠吸附除去殘留在葡萄糖完全消耗的培養液中的來自原料的帶電性雜質、各種胺基酸或肽類、及各種金屬離子類。所以，可以通過洗脫未吸附的中性物質DOI進行精製。但是，根據培養條件不同，此DOI中可能混入微量中性物質，進一步研究將從離子交換樹脂柱中洗脫的DOI更高度灃青制的方法。才艮據NMR等的測定，可以推斷DOI以酮型和水合物型混合的結構存在，DOI難於結晶化。目前為止，DOI和其衍生物的結晶化均未見報導。以下，說明進一步高度精製DOI的方法。〈本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的第二方案〉本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法的特徵在於包含以下工序，即，使上述2-脫氧-青蟹肌糖和三烷氧基曱烷反應，得到2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序，和在酸存在下水解所述2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序。作為該方案中可以使用的2-脫氧-青蟹肌糖，除含有2-脫氧-青蟹肌糖的上述組合物之外，還可以舉出第一方案得到的2-脫氧-青蟹肌糖等。以下，說明該第二方案。本發明人等基於將洗脫的DOI衍生轉化為結晶性物質進行結晶化，分離.精製後，高效地恢復為DOI的原理，探討適用此原理的物質及精製方法。圖14給出該原理的概述。圖14為表示本發明2-脫氧-青蟹肌糖精製方法的第二方案的原理的簡圖。為了滿足上述要件，轉化DOI的反應條件及恢復的反應條件的必須要件是能夠在DOI不發生分解的酸性條件下實施、及衍生改變的物質易於結晶化且能恢復成DOI、並且上述操作能夠以工業規模實施。研究了符合上述要件的各種方法。其結果發現，在穩定的酸性條件下使DOI與三烷氧基甲烷反應，轉化為2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮(DOI-dak)進行結晶化.精製的方法。在此三烷氧基曱烷((RO)3CH)中，R只要為碳原子數為14的鏈狀烷烴類即可，沒有特殊的限制，例如可以舉出甲烷、乙烷、丙烷、丁烷等。本發明中，作為該烷氧基曱烷，從容易除去下述水解工序中生成的醇的方面來看，最優選三曱基曱烷。需要說明的是，使用三甲基曱烷時，可以得到脫氧-青蟹肌糖二曱基縮酮(DOI-dmk)。2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮的結晶化可以在將2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮溶解於適當的溶劑(例如曱醇、乙醇、水等)後，利用使液相的親水性降低的介質(例如氯仿、己烷、醚等)進行結晶化。如上所述，可以得到2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮的結晶。如上所述得到的2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮在酸存在下水解，變為2-脫氧-青蟹肌糖。此水解反應可以在甲苯石黃酸、鹽酸、石克酸等適當的介質存在下進行。水解後可以得到2-脫氧-青蟹肌糖。由此可知，本發明的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法是能夠充分地進行工業大量生產的方法。實施例以下，通過實施例具體地說明本發明。但本發明的範圍並不限定於這些實施例。(實施例l)作為糖環化酶基因，可以使用來自環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的、編碼2-脫氧-青蟹肌糖(DOI)合成酶的42kDa亞基的btrC基因(參見專利文獻l、GenbankAB066276、非專利文獻2等)。(實施例2)<<重組質粒及重組4朱的構建〉〉以含有btrC基因全長的質粒pDS4(非專利文獻3)作為模板，使用序列號1所示引物1和序列號2所示引物2，btrC基因的PCR擴增使用KOD聚合酶(TOYOBO)，PCR的反應條件為以94。O30秒、52°030秒、68。Cxl分為l次循環，進行30次循環。將如上所述地進行PCR擴增得到的DNA片斷用NdeI和XbaI進行消化，通過將其插入載體pLEX(Invitrogen)的多克隆位點NdeI—Xbal部位,構建pLEX-btrC(圖2A)。<pGAP-btrC/p-GAD-btrC〉gapA啟動子基因以大腸桿菌的染色體DNA為模板，使用序列號17所示引物和序列號18所示引物，通過PCR擴增進行合成。該gapA啟動子基因的PCR擴增中，使用KOD聚合酶，在以下反應條件下進行，得到gapA啟動子片斷。將94。O30秒50。030秒68。Cxl分鐘作為l次循環，進行30次循環gadA啟動子基因，以大腸桿菌的染色體DNA為模板，使用序列號19所示引物和序列號20所示引物，通過PCR擴增進行合成。該gadA啟動子基因的PCR擴增使用KOD聚合酶，在以下反應條件下進行，得到gadA啟動子片斷。將94。Cx30秒52。Cx30秒68。Cxl分鐘作為l次循環，進行30次循環aspA終止子基因，以含有aspA終止子基因的質粒pLEX(Invitrogen)作為模板，使用序列號21所示引物和序列號22所示引物，通過PCR擴增進行合成。該aspA終止子基因的PCR擴增使用KOD聚合酶(TOYOBO),在以下反應條件下進行，得到aspA終止子片斷。將94"Cx30秒55°030秒68。Cxl分鐘作為l次循環，進^於30次循環在16°C下，使用2xLigationmix(TAKARA)使PCR擴增得到的gadA啟動子片斷和上述btrC片斷反應30分鐘。將由此所得的連接(Ligation)產物作為模板，使用序列號2所示引物和序列號5所示引物，使用KOD聚合酶，在以下條件下進行PCR擴增，得到2個片斷合為1個形成的片斷gadA-btrC片斷。將94。O30秒52。Cx30秒68。Cxl分鐘作為l次循環，進行30次循環將此片斷用Xbal消化所得的片斷插入載體pLEX(Invitrogen)的多克隆位點的XbaI部位。然後，在16。C下，使用2xLigationmix使上述擴增得到的gapA啟動子片斷和btrC片斷和aspA終止子片斷反應30分鐘。將由此所得的連接(Ligation)產物作為模板，使用序列號3所示的引物和序列號8所示的引物，使用KOD聚合酶，在以下條件下進行PCR擴增，得到3個片斷合為l個形成的片斷gapA啟動子-btrC-aspA終止子片斷。將94"Cx30秒5(TCx30秒68。Cxl分鐘作為l次循環，進行30次循環將此片斷用BamHI消化所得的片斷插入載體pLEX(Invitrogen)的多克隆位點的BamHI部位，所述載體中插入了gadA-btrC,由此構建pGAP-btrC/pGAD-btrC(圖5)。(實施例3)<<宿主細胞的製備〉〉<吏用GeneBridges牙土的QuickandEasyBACModificationKit,才艮才居其中所附說明書記載的方法進行基因破壞。用於製作單獨破壞pgi基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號3和序列號4所示。在用於單獨破壞zwf基因所用的盒的擴增中使用的PCR引物組的序列如序列號5和序列號6所示。用於製作單獨破壞pgm基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號7、序列號8、序列號9及序列號10所示。為了得到pgi基因和zwf基因的雙重破壞抹，用於擴增破壞zwf基因單獨破壞抹中的pgi基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號11和序列號12所示。為了得到pgi基因和pgm基因的雙重破壞抹，用於擴增破壞pgi基因單獨破壞林中的pgm基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號7、序列號8、序列號9及序列號10所示。進而，為了得到pgi基因和zwf基因和pgm基因的三重破壞抹，用於擴增破壞pgi基因和pgm基因的雙重破壞抹中的zwf基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號5和序列號6所示。另外，破壞rmf基因的盒所用的引物如序列號13、序列號14、序列號15及序列號16所示。將載體、pSC101-BAD-gbaA-tetra導入宿主細胞大腸桿菌抹(GI724)中，所述載體添加在試劑盒中，編碼在大腸桿菌內促進相同重組的酶群。在添加3pg/mL四環素的LB培養基中將該抹進行一夜前培養。將前培養菌體以1%濃度植菌在添加了3(ig/mL的LB培養基中，在30。C下培養至O.D.=0.2。在該時間點下添加阿拉伯糖使終濃度為0.2%，進而在37。C下培養1小時，由此誘導表達參與促進相同重組的酶群。進而分別轉化基因破壞用盒，誘導靶基因的基因破壞。通過在含有氯黴素、新黴素(卡那黴素)或鏈黴素或其中2個或3個的、37°C的LB培養基中選擇轉化體，得到目的基因破壞林(pgi基因破壞抹(Apgi抹)、zwf基因破壞林(Azw琳)、pgm基因破壞抹(Apgm抹)、pgi/zwf雙重基因破壞抹(ApgiAzwf抹)、pgi/pgm雙重基因破壞林(ApgiApgm4朱)及pgi/zwf/pgm三重基因破壞抹(Apgi△zwfApgm抹))。對於rmf基因破壞抹(Armf株)，使用與上述相同的方法，得到上述各種破壞抹的rmf破壞抹。由此所得的野生型抹及各基因破壞林在各種單一碳源中的生長水平如表1所示。Apgi抹、Azwf抹及Apgm株可以使用D-葡萄糖作為碳源，與野生型抹相比，使用D-葡萄糖的生長速度也顯著減緩，認為能夠抑制菌體對D-葡萄糖的消耗。另外，由於ApgiAzwf抹、ApgiApgm林及ApgiAzwfApgm林以D-葡萄糖作為單一碳源生長非常困難，所以認為葡萄糖-6-磷酸的分解幾乎完全被抑制。由此可知，能夠期待通過使用上述的破壞抹，DOI生產量及DOI轉化效率與野生型株相比得到提高。另外，各雙重基因破壞抹及三重基因破壞抹通過輔助地加入甘露醇或葡糖酸鹽等非發酵性碳源，能夠使生長得到改善(表l)。另外，rmf基因破壞抹中的碳源，具有與破壞了葡萄糖-6-磷酸代謝酶基因的各種破壞抹相同的生長水平。[表l]tableseeoriginaldocumentpage22(表中，"++"表示生長非常好"+"表示生長良好"+/-"表示少量生長"-"表示幾乎不生長)(實施例4)<〉根據GeneBridges社試劑盒附帶說明書中記載的方案，用上述所得的pLEX-btrC轉化宿主大腸桿菌抹(GI724)，通過在含有氨節青黴素的培養基中進行選擇，得到GI724/pLEX-btrC抹。另外，與上述相同地，將pGAP-btrC/pGAD-btrC轉化到宿主大腸桿菌才朱(GI724)，通過在含有氨千青黴素的培養基中進行選擇，得到GI724/pGAP-btrC/pGAD-btrC才朱。進而，也可以對GI724Armf、GI724Apgi、GI724Azwf、GI724Apgm、GI724ApgiArmf、GI724ApgiAzwf、GI724ApgiApgm及GI724ApgiAzwfApgm的各基因破壞抹，相同地轉化pGAP-btrC/pGAD-btrC,分別得到GI724Armf/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹、GI724Apgi/pGAP-btrC/pGAD-btr沐、GI724Azwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹、GI724Apgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹、GI724ApgiArmf/pGAP-btrC/pGAD_btrC株、GI724ApgiAzwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC林、GI724ApgiApgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC林、GI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD_btrC才朱。(實施例5)<〈DOI合成酶表達的確認〉〉<GI724Apgi/pLEX-btrC抹〉在30。C下於誘導培養基(6%磷酸氳二鈉、3%磷酸二氬鉀、0.5%氯化鈉、1%氯化銨、0.2%酪蛋白胺基酸、0.5%D-葡萄糖、lmM氯化鎂)中培養GI724Apgi/pLEX-btrC抹至O.D600nm-0.7後，移至2xYT培養基(大腸桿菌用完全培養基、1.6%色氨酸、1%酵母提取物、0.5%氯化鈉)中，在37。C下再培養6小時後，回收菌體，通過12%SDS聚丙晞醯胺凝膠電泳確認BtrC蛋白質的表達。其結果如圖3A所示。可以確認通過在2xYT培養基中培養6小時，BtrC大量表達。需要說明的是，圖3A的各條帶如下所示。條帶M:分子量標記物(商品名:PrecisionPlusProteinStandard(BIO-RAD社制、目錄序號161-0374)、以下相同)條帶l:將含有pLEX_btrC的GI724抹在基礎營養培養基(M9基礎培養基0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨)中培養6小時所得的菌體的萃取物(用lxSDSLodingBuffer:50mMTris-HC1(pH6,8);2%SDS;0.1%溴酚藍；10%甘油；lOOmM二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)溶液萃取、以下相同)條帶2:將含有pLEX-btrC的GI724抹在添加色氨酸的誘導培養基中培養6小時所得的菌體的萃取物條帶3:將含有pLEX-btrC的GI724抹在未添加色氨酸的誘導培養基中培養6小時所得到菌體的萃取物條帶4:在米糠培養基(組成20%米糠酶處理液)中培養2小時所得的菌體的萃取物條帶5:在添加色氨酸的2xYT培養基中在米糠培養基(組成20%米糠酶處理液)中培養6小時所得的菌體的萃取物使用2xYT培養基時，即使不添加色氨酸，BtrC也可高度表達。另外，使用米糠培養基培養的菌體中，BtrC也可高度表達。上述結果表明，使用上述表達體系，不使用昂貴的誘導物，也可以高度表達DOI合成酶基因。<GI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD-btr沐〉在前培養培養基(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中，在30。C下將GI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹培養一晚。以該前培養液作為主培養培養基，在2xYT培養基(大腸桿菌用完全培養基；1.6%胰腖(triptone)、1%酵母^是取物、0.5%氯化鈉)中按1%進行植菌，再於30°〇下培養直至0.0.60011111=0.7後，回收菌體，用12。/。SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳確認BtrC蛋白質的表達。其結果如圖3B所示。需要說明的是，圖3B的各條帶如下所示。帶l:分子量標記物帶2:主培養O小時後收集的菌體萃取物帶3:主培養12小時後收集的菌體萃取物帶4:主培養36小時後收集的菌體萃取物帶5:主培養72小時後收集的菌體萃取物根據圖3B可以確認，通過在2xYT培養基中培養6小時，BtrC大量表達。由此結果可知，通過使用此表達體系，不添加昂貴的誘導物，DOI合成酶基因也能高度表達。(實施例6)<〈DOI的合成〉〉<使用含有pLEX-btrC的GI724Apgi抹的DOI合成〉將GI724Apgi/pLEX-btrC抹接種至裝入300mL三角燒瓶中的35mL前培養液(RMG培養基、0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中，培養15小時。然後，在裝入3升2xYT培養基的10升培養槽中以1%的濃度植入菌體。將其在培養溫度30。C、攪拌速度300rpm、空氣10L/分鐘、pH7.7的條件下進行培養，600nm的O.D.為0.7時以20/0或5%濃度添加D-葡萄糖，再培養48小時。通過離心從培養規定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液l。在35mL含有l。/。甘露醇的RMG培養基(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氬鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中植入GI724ApgiAzwf/pLEX-btrC抹，進行l晚的前培養。然後，在3升含有3。/。甘露醇的2xYT培養基(IO升培養槽內)中以1%的濃度植入菌體，在30。C、攪拌速度300rpm、空氣10L/分鐘、pH7.7的條件下進行培養，600nm的O.D.為0.7時，以3%的濃度添加葡萄糖，再繼續培養。通過離心從培養規定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液2。條條條條條向300mL三角燒瓶中的50mL前培養液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹，培養15小時。將該前培養液以l。/。植菌到加入了3L2xYT培養基的IOL培養槽(B.E.MARUBISHI抹式會社MDL-6C型)中。將其在培養溫度25。C、攪拌速度300rpm、流入空氣10L/分鐘、pH7.0的條件下進行培養，OD600nm=0.7時添加D-葡萄糖使其濃度為5%，再培養72小時。通過離心從培養規定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液3。<使用含有pGAP—btrC/pGAD—btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹的DOI合成〉向300mL三角燒瓶中的50mL的前培養液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化《美)中接種含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹，培養15小時。將該前培養液以1%的濃度植菌到加入3L的2xYT培養基的10L培養槽中。將其在培養溫度25。C、攪拌速度300rpm、流入空氣10L/分鐘、pH6.0的條件下進行培養，OD600nm=0.7時添加D-葡萄糖使濃度為5%，再培養72小時。通過離心從培養，見定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液4。<使用含有pLEX-btrC的GI724Armf株的DOI合成〉在試驗管中向3mL前培養液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種含有pLEX-btrC的GI724Armf抹，培養15小時。將此前培養液以1%的濃度植菌到加入1OmL的2xYT培養基的L型試驗管中。將其在培養溫度30。C、振蕩速度160rpm、pH7.0的條件下進行培養，OD600nm=0.7時，添加D-葡萄糖使其濃度為3%，再培養72小時。通過離心從培養身見定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液5。(實施例7)<〈DOI生產量的測定〉〉〈DOI的將化〉按照以下順序定量培養上清液中蓄積的DOI。對於培養上清液1及2,在各時間點收集培養液，加入與上清液等量的水、上清液的2倍量的曱醇、及終濃度為1.5mg/mL的0-(4-硝基千基)羥基胺(NBHA)，將其混合，在60。C下培育1小時，由此誘導DOI的肟化。另外，將培養上清液3、4及5混合9倍量的滅菌蒸餾水，再加入與該溶液等量的曱醇後，力口入30mg/mL的o-(4-硝基節基)羥基胺鹽酸鹽(NBHA),將其混合，在60。C下培育1小時，由此誘導DOI的月虧體。<001的鬥全測〉如上所述得到的DOI將體在SpeepVacSystem(Thermo社ISSl10)中蒸發掉溶劑後，將肟化DOI溶解於適量的曱醇，採用HPLC(高效液相色譜)分析法對其中的一部分進行分析，進行DOI的檢測及定量。高效液相色i普為SHIMADZU社LC-10AT、柱使用Phrnomenex社Luna5uC18(柱長150mm、柱內徑4.6mm),溶離液4吏用20%曱醇。測定262nm下的紫外線吸收。根據標準曲線法定量DOI的O-(4-硝基節基)肟衍生物的量。需要說明的是，使用Glucoseassayprocedurekit(Megazyme社制)進行葡萄糖定量。如圖4A及4B所示，在HPLC分析中確認相當於DOI的將體的峰。另外，圖5至7中給出DOI生產量、培養基的濁度、及D-葡萄糖濃度的時間曲線。(參考例l)<使用含有pLEX-btrC的GI724Apgi抹的DOI合成〉向裝入300mL三角燒瓶的35mL前培養液(RMG培養基0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種GI724Apgi/pLEX-btrC加入3升的2xYT培養基的10升培養槽中以1%的濃度植入菌體。將其在培養溫度30。C、攪拌速度300rpm、空氣10L/分鐘、pH7.7的條件下培養，600nm的O.D.為0.7時添加D-葡萄糖至濃度為2%或5%，再培養24小時。通過離心從培養規定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液ll。(參考例2)向300mL三角燒瓶中的50mL前培養液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氬鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹，培養15小時。在加入3L2xYT培養基的10L培養槽(B.E.MARUBISHI抹式會社MDL-6C型)中以1%濃度植菌此前培養液。將其在培養溫度25。C、攪拌速度300rpm、流入空氣10L/分鐘、pH7.0的條件下進行培養，OD600nm-0.7時，添加D-葡萄糖使其濃度為5%，再培養72小時。分別回收D-葡萄糖添加前及D-葡萄糖添加後的培養液，將此培養液離心，除去菌體，分別回收培養上清液12及13。(參考例3)<使用含有pLEX-btrC的GI724野生型抹的DOI合成〉在具有3mL前培養液(0.6%磷酸氬二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白胺基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)的試驗管中接種含有pLEX-btrC的GI724野生型株，培養15小時。將此前培養液以1%的濃度植菌到加入1OmL的2xYT培養基的L型試驗管中。將其在培養溫度30。C、振蕩速度160rpm、pH7.0的條件下進行培養，OD600nm=0.7時添加D-葡萄糖使其濃度為3%，再培養72小時。通過離心從培養規定時間的培養液中除去菌體，回收培養上清液14。(參考例4)〈DOI生產量的測定〉可以按照下述順序對如上所述得到的培養上清液11至14中蓄積的DOI進行定量。對於培養上清液ll,加入與此上清液等量的水、上清液的2倍量的甲醇、及終濃度1.5mg/mL的O-(4-硝基節基)羥基胺(NBHA)，將其混合，在60。C下培育1小時，由此誘導DOI的肝化。針對培養上清液12、13及14,混合相對於上清液為9倍量的滅菌蒸餾水，再加入與此溶液等量的甲醇後，加入30mg/mL的o-(4-硝基千基)羥基胺鹽酸鹽(NBHA)混合，在60。C下培育1小時，由此誘導DOI的將體。用SpeepVacSystem(Thermo社ISSl10)使來自上述衍生化的培養上清液11至14的液體蒸發掉溶劑後，將肟化DOI溶解於適量的曱醇，用HPLC(高效液相色譜)分析法對其中的一部分進行分析，進行DOI的檢測及定量。高效液相色語為SHIMADZU社LC-9A、柱使用Phrnomenex一土Luna5uC18(片主長150mm、4主內^聖4.6mm),;容離'液4吏用20%曱醇。測定262nm下的紫外線吸收。通過標準曲線定量DOI的O—(4-硝基節基)將衍生物的量。(實施例8)<使用AmberliteIR120和AmberliteIRA410混合柱的方法〉將氫離子型的AmbediteIR120和乙酸離子型的AmberliteIRA410各200mL混合後，充填到柱(cp5cmx25cm)中，將柱調至pH2.96,添力口100mL參考例l的培養液(含有1.4g的D01)後，通過以2mL/分鐘的流速流入蒸餾水進行溶離。以每餾分6mL進行收集，每隔l瓶對所得餾分測定pH及傳導度。另外，每隔3瓶進行DOI的定量。DOI的定量在衍生成0-(4-硝基千基)肟後，用HPLC測定面積，之後，根據標準曲線進行計算。此時的結果如圖10所示。另外，將餾分分4段收集，凍結乾燥後，測定各段中DOI的純度及量。結果如表2所示。所得的精製DOI的13〔-NMR色譜如圖ll所示。13C-NMR色譜使用Bruker社的DPX-250NMR裝置("C核在67.5MHz共振)，測定溶解於重水的試衝羊。(實施例9)<使用AmberliteIR200和AmberliteIRA410的混合柱的方法〉將氫離子型的AmberliteIR200和乙酸離子型的AmberliteIRA410各200mL混合後，充填到柱(cp5cmx25cm)中。向其中加入pH調至2.97的50mL參考例l的培養液(含有562mg的D01)後，通過以2mL/分鐘的流速流入蒸餾水進行溶離。以每餾分6mL進行收集，每隔l瓶對所得餾分測定pH及傳導度。另外，每隔3瓶進行DOI的定量。此時的結果如圖12所示。另外，將餾分分為4段進行收集，凍結乾燥後，測定各段中DOI的純度及量。結果如表3所示。所得的精製D0I的130NMR色語如圖13所示。DOI的定量方法及"C-NMR色譜的測定方法與實施例8相同。[表2]tableseeoriginaldocumentpage30[表3]tableseeoriginaldocumentpage30(實施例1O)告的表中記載的細胞)中的宿主細胞。5、如權利要求3或4所述的轉化體，其特徵在於，所述宿主細胞是基因被破壞的宿主細胞，所述基因為選自編碼磷酸葡糖異構酶的pgi基因、編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的zwf基因、編碼磷酸葡糖變位酶的pgm基因、及編碼負責處於穩定期的蛋白質合成的修飾的核糖體修飾因子蛋白質的rmf基因中的至少一種。6、一種2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法，其特徵在於，該方法具有使權利要求3至5中任一項所述的轉化體和碳源接觸的工序。7、如權利要求6所述的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法，其特徵在於，所述碳源為選自D-葡萄糖、寡糖、多糖、澱粉、纖維素、米糠及廢糖蜜以及可以得到D-葡萄糖的生物質中的至少一種碳源。8、一種2-脫氧-青蟹肌糖，其特徵在於，是通過權利要求6或7中所述的2-脫氧-青蟹肌糖的製備方法而獲得的。9、一種2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法，其特徵在於，所述精製方法包含以下工序，使權利要求3至5中任一項所述的轉化體和碳源接觸，得到含有2-脫氧-青蟹力幾糖的組合物的工序；和用具有氫離子型強酸性陽離子交換樹脂和有機酸離子型鹼性陰離子交換樹脂的混合柱或雙柱處理所述組合物的工序。10、如權利要求9所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法，其特徵在於，所述有機酸離子型鹼性陰離子交換樹脂是乙酸離子型陰離子交換樹脂。11、一種2-脫氧-青蟹肌糖，其特徵在於，是通過權利要求9或IO所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法而獲得的。12、一種2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法，其特徵在於，所述精製方法包含以下工序，使權利要求11所述的2-脫氧-青蟹肌糖和三烷氧基曱烷反應，得到2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序；和在酸存在下水解所述2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序。13、如權利要求12所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法，其特徵在於，所述三烷氧基曱烷是三曱氧基曱烷。14、一種2-脫氧-青蟹肌糖，其特徵在於，是通過權利要求12或13所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精製方法而獲得的。全文摘要在作為宿主細胞的大腸桿菌中導入至少一種由參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因構成的基因表達盒，配製轉化體，使用此轉化體，由D-葡萄糖、寡糖、多糖、澱粉或米糠合成2-脫氧-青蟹肌糖。將含有此2-脫氧-青蟹肌糖的培養液，用由氫離子型強酸性陽離子交換樹脂和有機酸離子型鹼性陰離子交換樹脂構成的混合柱或雙柱進行處理。使該被精製的2-脫氧-青蟹肌糖與三甲氧基甲烷反應，變為2-脫氧-青蟹肌糖二甲基縮酮，結晶化·精製後，在酸存在下水解，高度精製。文檔編號C12N15/00GK101151368SQ20068001077公開日2008年3月26日申請日期2006年3月23日優先權日2005年3月30日發明者宮崎達雄,小暮高久,平山匡男,肋坂直樹,高久洋曉,高木正道,鰺坂勝美申請人:新潟生物研究園株式會社